CC BY
47
2003
Известия ТИНРО
Том 134
УДК 597-1.05
Е.П.Караулова, С.В.Леваньков, Е.В.Якуш, В.Н.Акулин
КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ СОСТАВ МИОФИБРИЛЛЯРНЫХ БЕЛКОВ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ ГЛУБОКОВОДНЫХ РЫБ
Дана сравнительная характеристика и установлены общие и отличительные особенности качественного и количественного состава миофибриллярных белков скелетных мышц некоторых видов глубоководных рыб: лемонемы (Podonema longipes), пепельного (Coryphaenoides cinereus) и малоглазого макрурусов (Co-ryphaenoides pectoralis). Методом диск-ДСН-электрофореза показано, что для мышечных тканей глубоководных рыб характерно более высокое содержание минорных миофибриллярных белков (до 11 %), более низкое соотношение миозин/актин актомиозинового комплекса (2,6-2,8) по сравнению с традиционными объектами. При этом миозины скелетных мышц глубоководных рыб отличаются соотношением 1 и 3-й легких миозиновых цепей и большой молекулярной массой легкой цепи 1. Тропомиозины скелетных мышц глубоководных объектов характеризуются меньшим соотношением а- и Р-субъединиц. Обнаружены также существенные различия в соотношении компонентов тропонинового комплекса как среди объектов исследованной группы, так и при сравнении с традиционными объектами.
Karaulova E.P., Levan'kov S.V., Yakush E.V., Akulin V.N. Qualitative and quantitative composition of myofibril proteins of some deep-sea fish species // Izv. TINRO. — 2003. — Vol. 134. — P. 309-320.
Comparative characteristics of qualitative and quantitative composition of myofibril protein of skeletal muscles of some deep-sea fish species (Podonema longipes, Coryphaenoides cinereus and Coryphaenoides pectoralis) is presented, its general and distinctive features are defined.
The higher content (up to 11 %) of minor myofibril proteins and the lower ratio myosin/actin of actomyosin complex (2.6-2.8) were revealed for muscle tissue of deep-sea fishes, relative to traditional objects, by means of the disc-SDS-electro-phoresis (PAGE-mode). The myosin of skeletal muscles of deep-sea fishes differed by a relation between the 1st and 3rd myosin light chains and by a high molecular weight of the 1st light chain. The myosin light chains and troponin subunits had closer values of electrophoretic mobility. So, the myosin light chains was separated by the treatment of the myosin by the solution of urea, 5.5'-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid, and ammonium chloride. The thermodissociation method was used for non-selective myosin dissociation. Short-term and intensive heat treatments of myosin solutions were realized.
Tropomyosin of skeletal muscles of deep-sea objects differed by a smaller relation of a- and P-subunits. The value of this relation was 1.1: 1.0 for Coryphaenoides cinereus and 1.35: 1.0 for Coryphaenoides pectoralis. The essential distinctions in the ratio of troponin complex subunits were found both between explored objects and between the explored group and traditional objects.
Изменения молекулярной структуры белков рассматриваются исследователями как главная причина различий и многообразия биологических функций клетки. Однако явление, обнаруживаемое на клеточном уровне, далеко не всегда возможно связать с поведением белковой молекулы, вследствие того что объект представляет сложную биологическую систему. Так, изменение сократительной способности мышечной ткани под влиянием ряда химических или физических агентов и факторов может зависеть не только от состояния самих сократительных белков, но и от нарушения работы ферментных систем, разобщения метаболических путей или истощения энергетических ресурсов клетки. В связи с этим, а также с наблюдаемыми различиями в поведении белков и реакции клетки на эти изменения первостепенной задачей исследования становится характеристика качественного состава и количественных соотношений белков мышц. Миозины, выделенные из мышц разных типов, на разных стадиях онтогенеза, у животных разных видов, имеют характерные особенности, как функциональные, так и структурные. При изучении свойств и особенностей миозинов большое значение имеет состав сопутствующих белков, в связи с тем что в мышце, как сложной белковой системе, отдельные компоненты могут и существенно влияют на свойства основных белков.
Цель данной работы — установить качественный и количественный состав белков скелетных мышц некоторых видов глубоководных рыб. Интерес к этим объектам определяется особенностями химического состава их мышечных тканей (Технологическая характеристика ..., 1978). Все они характеризуются высоким содержанием влаги и низким содержанием белка и липидов. По этой причине в некоторых биохимических исследованиях скелетные мышцы глубоководных рыб используются как модельные биохимические системы, например, для изучения влияния различных физико-химических факторов на фолдинг белка, физическую стабильность, резистентность и рефлекторику биосистем в условиях больших давлений и низких температур (Endo et al., 1993; Siebenaller, 2000; Stevens, Siebenaller, 2000). В качестве объектов исследования нами выбраны скелетные мышцы лемонемы (Podonema longipes), пепельного (Coryphaenoides cinereus) и малоглазого макрурусов (Coryphaenoides pe-ctoralis). Данные объекты исследования по технохимическим характеристикам мышечных тканей составляют полный спектр модельных систем в соответствии с общепринятой в настоящее время классификацией (Борисочкина, Дубровская, 1988).
Целью данной работы было также дать сравнительную характеристику, установить общие и отличительные особенности качественного и количественного состава основных миофибриллярных белков скелетных мышц некоторых видов глубоководных рыб, используя методы фракционирования, выделения и очистки мышечных белков.
Для исследования состава миофибриллярных белков скелетных мышц глубоководных рыб тушку рыбы разделывали: извлекали внутренности, снимали кожу, отделяли мышцы и удаляли красные боковые мышцы. Филе белых мышц замораживали в 50 %-ном глицерине при температуре минус 40 °С, хранили при температуре минус 24 оС и доставляли в лабораторию в течение 1 мес.
Качественный состав белков исследовали методом диск-ДСН-электрофо-реза. Образцы для анализа готовили следующим образом: 0,5 г ткани солюби-лизировали при нагревании при 95 оС 1,5 мин в 9,5 мл 8 М мочевины с добавкой 1,0 %-ного додецилсульфата натрия (ДСН), 0,5 %-ного меркаптоэта-нола в 20 мМ трисхлоридном буфере, рН 8. Раствор охлаждали до комнатной температуры и отфильтровывали. Фильтрат диализовали 12-14 ч против десятикратного объема 1 %-ного ДСН. Для анализа 0,1 мл образца разводили вдвое буфером, содержащим глицерин, ДСН, 0,05 % бромфенолового синего. Для анализа использовали 5-10 мкл получаемого таким образом раствора.
В качестве концентрирующего геля использовали полиакриламидный гель с концентрацией 3,5 %. Концентрирование вели при силе тока 15 мА и напряжении 210-220 В. В качестве разделяющего геля использовали гели с постоянной концентрацией полиакриламида 10,0; 12,5 и 15,0 %, а также градиентные гели с диапазоном концентраций 7,5-12,5 % и 10-15 % полиакриламида. Разделение вели при силе тока 5-7 мА и напряжении 100-110 В в течение 6-8 ч.
Актомиозин экстрагировали из концентрата миофибрилл, полученного пятикратной экстракцией саркоплазматических белков мышц 5 мМ раствором ЭДТА при температуре 2-6 оС при соотношении ткань/раствор 1: 5. Общее время экстракции — 12 ч. Полученный концентрат фибриллярных белков дополнительно гомогенизировали в растворе с низкой ионной силой (0,1 M KCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,0), затем немедленно добавляли равный объем свежеприготовленного раствора 1,1 М KCl, 0,1 M Na2CO3, 0,1 M NaHCO3. Экстракцию проводили 15-30 мин при периодическом перемешивании. Смесь центрифугировали. Актомиозин осаждали добавлением полученного экстракта к 15-кратному объему 5 мМ ЭДТА, рН 6,8-7,0. Осторожно перемешивали полученную смесь и оставляли на холоду на 10-12 ч. Суспензию центрифугировали при 3000 g 15 мин. Осадок растворяли в минимальном объеме 3 М KCl, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0 и доводили концентрацию KCl до 0,3 М. Актомиозин выделяли осаждением насыщенным раствором сульфата аммония, который добавляли к полученному раствору до достижения степени насыщения 35 %. Осадок актомиозина отделяли центрифугированием, промывали раствором
5 мМ ЭДТА и диализовали против пятидесятикратного объема этого же раствора 6-8 ч. Полученный в диализной ячейке осадок отделяли центрифугированием.
Для получения миозина использовали метод Б раггманна-Дженни (Bruggmann, Jenny, 1975) в небольшой модификации. В качестве основного рабочего раствора использовали раствор Перри (Parry, 1981). Этот же раствор, разбавленный в 10 раз, использовали для диализа. Окончательную очистку миозина проводили "batch''-процедурой на DEAE-Sepharose 4В (Pharmacia Biotech AB, Швеция). Использование данного сорбента позволяет добиться более эффективного отделения регуляторных белков в отличие от классической процедуры, которая выполняется на DEAE-Sephadex. Полученный в результате раствор очищенного миозина использовали для работы. Таким образом получали миозины с максимальной АТФазной активностью.
Для получения тропомиозина использовали схему Бейли (Bailey, 1948) в небольшой модификации. Высаливание тропомиозина сульфатом аммония проводили из растворов с высокой ионной силой (0,5-0,6 М хлористого калия), что позволило исключить процедуру концентрирования белка этанолом и дополнительную стадию дробного осаждения. На стадии окончательной очистки препаратов тропомиозина от компонентов тропонинового комплекса использовали обработку раствора белка в 1 М фосфатном буфере, рН 6,4 при 90 оС в течение
6 мин.
Актин и актинин получали экстракцией раствором йодистого калия (Ishikawa, 1983).
О степени нативности препаратов миофибриллярных белков судили по величине соотношения А320/А360 (Туроверов, Щелчков, 1970) спектров ультрафиолетовой флуоресценции (УФФ) растворов или суспензий белков. Спектры флуоресценции записывали на приборе RF-5000 (Shimadzu, Япония) при длинах волн экстинкции (^Ex) 260, 280 и 290 нм. Спектры ультрафиолетовой флуоресценции регистрировали в автоматическом режиме при ширине щели экстинк-ции 3-10 нм и эмиссии 5-15 нм. Для количественной оценки степени денатура-ционных изменений белков использовали формулу Туроверова-Щелчкова (Ту-роверов и др., 1975).
Концентрацию белка в растворах определяли по методу Варбурга—Христиана (Warburg, Christian, 1941; Layne, 1957). УФ-спектры регистрировали на приборе Hitachi 330 (Япония).
Анализ электрофореграмм, полученных для концентратов миофибрилляр-ных белков мышечных тканей глубоководных рыб (рис. 1), не выявил существенных различий качественного состава миофибриллярных белков в ряду исследуемых объектов. Идентичным был состав быстрых и медленных мышц. Исключение составили минорные белки с молекулярными массами субъединиц 50-200 кДа. Их содержание в медленных мышцах было значительно выше, чем в быстрых.
232
132 Рис. 1. Состав и электрофоретическая
подвижность белков лемонемы (1), макруру-са пепельного (2), макруруса малоглазого (3) 66 в сравнении с миофибриллярными белками минтая (4). 5 — стандартные белки, указаны молекулярные массы. Электрофорез выпол-43 нен в градиентном геле с диапазоном концентрации 10-15 %
Fig. 1. Composition and electrophoretic mobility of proteins of Podonema longipes (1), Coryphaenoides cinereus (2), Coryphaenoides 29 pectoralis (3) in comparison with myofibrillar proteins of Theragra chalcogramma (4). 5 — standard proteins, molecular weight is shown. Gradient PAGE with concentration diapason of polyacrylamide from 10 to 15 % was used
14,5
Различия в составе и содержании минорных белков в быстрых мышцах глубоководных рыб проявляются при сравнении с традиционными объектами (табл. 1). Мышцы глубоководных рыб характеризуются более высокой долей минорных белков в сравнении с традиционными объектами. При этом доля минорных мышечных белков тем выше, чем выше влагосодержание ткани. Так, при содержании влаги 90,7±0,6 % (макрурус малоглазый) наблюдалось максимальное значение содержания минорных белков, в то время как для макруруса пепельного, имеющего 82,2 ±0,7 % влаги в мышце, доля этих компонентов составляет величину, характерную для традиционных объектов.
По-видимому, доля минорных белков характеризует как состав, так и прочность 2-линии и М-полосы к механическому и химическому воздействию, которое проявляется в способности этих белков экстрагироваться при обработке диссоциирующими растворами (Ishikawa, 1983; StreЫer е! а1., 1983). При этом состав и электрофоретическая подвижность (рис. 1) основных миофибрилляр-ных белков глубоководных рыб схожи как между собой, так и в сравнении с традиционными объектами (показаны миофибриллярные белки скелетных мышц минтая).
Использование специальных методов фракционирования миофибриллярных белков позволило сделать полное отнесение сигналов электрофореграмм к соответствующим белкам миофибрилл. Наиболее проблемным было отнесение
• — *
сигналов легких миозиновых це- Таблица 1
пей и компонентов тропониново- Содержание минорных бе,яков
го комплекса ввиду близких зна- в мышечных тканях рью, %
чений электрофоретической под- , Table 1
^ тг Minor proteins contents in fish muscles, %
вижности данных белков. Для ^
этого использовали сравнительный анализ электрофореграмм, полученных в различных условиях разделения, и специфические приемы диссоциации миозинов под действием разных факторов и реагентов, позволяющих полностью или селективно отделить легкие миозиновые цепи. Отделение всех легких цепей миозина проводили под действием растворов мочевины. При этом минимальные концентрации мочевины, при которых данный процесс происходит, различны и составляют 2,0 М для миозина мышц пепельного макруруса; 2,8 М — лемонемы и 3,2 М — малоглазого макруруса. Минимальную необходимую концентрацию мочевины определяли используя метод ультрафиолетовой флуоресценции. Критерием служили постоянство положения максимума и полуширина сигнала эмиссии в спектре флуоресценции белка при стабильном снижении интенсивности с увеличением концентрации мочевины (рис. 2).
Объект Содержание минорных белков
Макрурус малоглазый
(Coryphaenoides pectoralis) 11,16
Лемонема
(Podonema longipes) 7,73
Макрурус пепельный
(Coryphaenoides cinereus) 4,89
Минтай тихоокеанский
(Theragra chalcogramma) 4,21
Рис. 2. Диссоциация миозинов в различных условиях (на примере лемонемы). Электрофорез выполнен в градиентном геле 10-15 %: 1 — миофиб-риллярные белки скелетных мышц лемонемы; 2 — диссоциация под действием 2,8 M мочевины или при нагревании до 53 °С, 3 мин; 3 — диссоциация при 40 оС, 60 мин; 4 — диссоциация в 4,7 M растворе хлорида аммония; 5 — диссоциация под действием 5,5'-дитио-б^с-2-нитробензойной кислоты; MHC — тяжелые миозиновые цепи; LC;_3 — легкие цепи миозина
Fig. 2. Myosin dissociation at the different conditions (Podonema longipes example is shown). Gradient PAGE with concentration diapason of Polyacrylamide from 10 to 15% was used: 1 — myofibrillar proteins of Podonema longipes skeletal muscles; 2 — dissociation under the influence of 2.8 M urea and during 3-minute heating up to 53 °С; 3 — dissociation during 60-minute heating up to 40 оС; 4 — dissociation in 4.7 M ammonium chloride solution; 5 — dissociation under the influence of 5.5'-dithio-bis-2-nitroben-zoic acid; MHC — myosin heavy chains; LC;_3 — myo-sin light chains
Наиболее эффективный результат был получен в варианте диссоциации миозина после кратковременного (3-4 мин) интенсивного прогрева (53 °С) раствора белка. При этом отделение всех легких цепей происходило и в случае использования в этой процедуре актомиозина. В данных условиях значительное (до 60 %) количество белка агрегирует, что позволяет не использовать допол-
нительных операций для выделения тяжелых миозиновых цепей (дорожка 2). Более легкий прогрев (40 °С) не более 60 мин позволяет селективно удалить из молекулы миозина легкие цепи LCj и LC3, а обработка 5,5'-дитио-бас-2-нитробензойной кислотой приводит к удалению только легких цепей LC2. Легкую цепь LC3 удаляли длительной (до 2 ч) инкубацией раствора миозина в концентрированных растворах хлорида аммония (4,5-4,7 М) (рис. 2). Сопоставление полученных данных с характеристиками сигналов электрофо-реграмм при экстракции тропомиозина и компонентов тропонинового комплекса методом Бейли позволило сделать точные отнесения всех электрофоре-тических зон к соответствующим белкам миофибрилл. Полученные данные оказались идентичными с данными анализа электрофореграмм миозинов, выделенных из скелетных мышц исследуемых объектов по методу Браггман-на—Дженни (Bruggmann, J enny, 1975).
Для экстракции актина нами использовался метод, предполагающий деполимеризацию фибриллярного актина и основанный на более высокой термостабильности глобулярной формы актина (Taguchi et al., 1979).
Учитывая низкую селективность основных используемых для этой цели растворов, актин выделяли из промытой водой мышцы (рис. 3, дорожка 1) экстракцией 0,6 М раствором иодида калия. Время экстракции ограничивали 5 мин, так как при увеличении времени экстракции резко возрастало количество примесных белков с молекулярной массой от 60 до 180 кДа, причем с увеличением времени экстракции до 30 мин их количество превышало концентрацию актини-на более чем в 5 раз. Состав белков экстракта представлен на рис. 3 (дорожка
2). Осаждением сульфатом аммония в интервале 15-25 % насыщения получали белок с молекулярной массой субъединицы около 100 кДа (рис. 3, дорожка
3). Условия получения, молекулярная масса и характерная зона локализации данного белка на электрофореграмме позволяют идентифицировать его как а-акти-нин (Suzuki et al., 1976; Ishikawa, 1983).
1 2 3 4 5
Рис. 3. Экстракция актинина (а—А) и актина (Ac) из мышечной ткани глубоководных рыб (на примере лемонемы): 1 — концентрат миофибриллярных белков скелетных мышц лемонемы; 2 — KI-экстракт; 3 — белок, осажденный из KI-экстракта раствором сульфата аммония 15-25 %-ной степени насыщения (а-A — актинин); 4 — экстракт после осаждения а-ак-тинина; 5 — препарат актина
Fig. 3. Extraction of actin and actinine from Podonema longipes muscle: 1 — concentrate of myofibrillar proteins of Podonema longipes skeletal muscle; 2 — Kl-extract of myofibrillar proteins of Podonema longipes; 3 — а-acti-nine; 4 — extract after а-actinine isolation; 5 — preparation of purified actin
Актин после отделения актинина (рис. 3, дорожка 4) деполимеризовали диализом раствора против 0,6 М раствора йодистого калия и нагревали на водя-
ной бане 3 мин при 60 0С. Раствор отфильтровывали, и актин полимеризовали диализом против 0,5 M раствора хлорида калия. По данным электрофореза, в растворе получали до 7 5 % актина (рис. 3, дорожка 5). По данным УФФ-анализа, в качестве примеси препарат содержал до 35 % денатурированного белка, однако он увеличивал относительную вязкость растворов миозина и в присутствии ионов магния обеспечивал расщепление АТФ.
Таким образом, результаты идентификации всех миозиновых цепей и актина на электрофореграмме позволили установить точные количественные отношения этих белков в актомиозиновых комплексах мышц исследуемых объектов. В табл. 2 приведены данные, полученные для актомиозинов глубоководных рыб и некоторых традиционных объектов промысла.
Известно, что среднестати- _ „
Таблица 2
стическое соотношение мио-
, АО Соотношение миозин/актин
зин/актин колеблется от 2 до актомиозиновых комплексов миофибрилл
4 и в основном составляет ве- некоторых рыб
личину 3,5-4,0 (Connel, Howgate, Table 2
1959). Как видно из данных табл. Myosin/Actin ratio for some fishes myofibril's
2, для актомиозинов глубоковод- _actomyosin complexes_
ных рыб характерно более низ- Объект Соотношение
кое соотношение миозин/ актин
по сравнению с традиционными
объектами независимо от влаго-
содержания ткани.
Процесс выделения тропо-миозинов (на примере мало-глазого макруруса) на основе процедуры Бейли показан на рис. 4.
Тропомиозины экстрагировали из предварительно обработанной спиртом и высушенной до воздушно-сухого состояния мышцы (рис. 4, дорожка 1). Э кстракцию вели раствором 1 M КС1 (рН 7,0) в течение 12 ч при комнатной температуре. Двукратная экстракция обеспечивает количественное извлечение тропоми-озина (рис. 4, дорожка 2). Дальнейшие процедуры заключались в удалении примесей актина и тропонина. Актин удаляли кислотно-щелочным переосаждением. Осадок, по данным электрофореза, содержал в основном денатурированный актин (значение показателя А320/А360 в УФФ-спектре 0,42) и тропомиозин с незначительной примесью тропонина (рис. 4, дорожка 3). Тропонин и тропомиозин разделяли фракционированием с помощью насыщенного раствора сульфата аммония. Тропомиозиновый комплекс выделяли при концентрации сульфата аммония от 41-60 % (в случае лемонемы), 3555 % (макрурус пепельный) и 50,0-62,5 % (макрурус малоглазый). Выпавший осадок, по данным электрофореза, представлял собой тропомиозин не менее 75 %-ной чистоты с примесью тропонина (рис. 4, дорожка 5). Для окончательной очистки тропомиозина использовали более высокую термостабильность этого белка по сравнению с тропонином (Cheng, Parrish, 1979). Это позволило получить практически чистый тропомиозин (рис. 4, дорожка 6), представленный на электрофореграмме двумя полосами с близкой элект-рофоретической подвижностью.
Известно, что тропомиозин состоит из двух субъединиц с одинаковой массой (Cummins, Perry, 1974), но различающихся электрофоретической подвижнос-
Минтай тихоокеанский
(Theragra chalcogramma) 3,06
Корюшка малоротая обыкновенная
(Hypomesus оШи^) 3,72
Пятнистый терпуг
(Hexagrammos stelleri) 3,86
Палтус тихоокеанский белокорый
(Hippologlossus stenolepis) 3,52
Камбала желтоперая
(Pleuronectes (Limanda) asper) 3,45
Лемонема (Podonema longipes) 2,76
Макрурус пепельный
(Coryphaenoides cinereus) 2,85
Макрурус малоглазый
(Coryphaenoides pectoralis) 2,59
Рис. 4. Процесс получения и очистки тро-помиозина глубоководных рыб (на примере ма-логлазого макруруса: Ac — актин; Tn — тро-понин; Tm — тропомиозин): 1 — обработанная спиртом, высушенная до воздушно-сухого состояния мышца; 2 — остаток после двукратной экстракции тропомиозина; 3 — осадок после кислотно-основной обработки; 4 — остаток после кислотно-щелочной обработки; 5 — препарат тропомиозина после осаждения сульфатом аммония; 6 — очищенный препарат тропомиозина
Fig. 4. Tropomyosin producing and purification process (the example of Coryphaenoides pectoralis is shown: Ac — actin; Tn — troponin; Tm — tropomyosin): 1 — air-dried ethanol treated muscle; 2 — residue after double extraction of tropomyosin; 3 — the sediment after acid-base treatment; 4 — residue after acid-base treatment; 5 — preparation of tropomyosin after precipitation under influence of ammonium sulphate; 6 — purified preparation of tropomyo-sin
тью при ДСН-электрофорезе. В литературе это объясняется разным связыванием молекул субъединиц с детергентом. При этом соотношение субъединиц а: в в скелетных мышцах позвоночных составляет от 1,3: 1,0 до 3,8: 1,0 (Potter, 1974). Субъединичный состав тропомиозинов скелетных мышц глубоководных рыб представлен в табл. 3.
Таблица 3
Состав тропомиозинов глубоководных рыб (рис. 5)
Table 3
Composition of deep-sea fishes muscle tropomyosin (fig. 5)
Объект MW , ос' кДа MW кДа Соотношение a: в MW тропомиозина, кДа
Макрурус пепельный
(Coryphaenoides cinereus) 33,0 34,0 1,1: 1,0 67,0
Лемонема
(Podonema longipes) 34,2 36,6 1,2: 1,0 70,6
Макрурус малоглазый
(Coryphaenoides pectoralis) 34,3 36,0 1,35: 1,0 70,0
Минтай тихоокеанский
(Theragra chalcogramma) 35,5 36,5 1,66: 1,0 71,7
Необходимо отметить, что, хотя соотношение субъединиц тропомиозинов в ряду глубоководных рыб повышается с увеличением влагосодержания ткани, оно остается меньше минимального, известного из литературы значения.
Известно, что тропомиозин не содержит триптофана, а его УФ-спектр похож на спектр тирозина с максимумом при 278 нм ^арга^, Watanabe, 1970). Выделенные нами из скелетных мышц глубоководных рыб тропомиозины также имели максимум поглощения в УФ-спектре в области, близкой к этому значению (277,4-278,8 нм), в то время как для остальных миофибриллярных белков максимум УФ-поглощения приходился на интервал длин волн 287-294 нм. Величина отношения Аи278/Аи260 для выделенных препаратов тропомиозина составляла 1,98-2,03.
Рис. 5. Тропомиозины скелетных мышц глубоководных рыб (фрагмент денситограммы): 1 — мак-рурус пепельный, 2 — лемонема, 3 — макрурус мало-глазый
Fig. 5. Tropomyosin of deep-sea fishes skeletal muscle (fragment of densitogramm): 1 — Cory-phaenoides cinereus, 2 — Podonema longipes, 3 — Coryphaenoides pectoralis
Состав и количественные соотношения в тропониновом комплексе приведены в табл. 4.
Таблица 4
Молекулярно-массовый и количественный состав тропонинов глубоководных рыб
Table 4
Molecular weights and quantitative composition of deep-sea fish muscle troponines
Объект Компоненты тропонинового комплекса, мол. масса, кДа Соотношение компонентов Мол. масса, кДа
Макрурус малоглазый (Coryphaenoides pectoralis) 38,0 21,0 18,5 1,0 0,90 0,61 68,2
Лемонема (Podonema longipes) 39,0 20,4 17,7 1,0 0,66 0,83 67,1
Макрурус пепельный (Coryphaenoides cinereus) 37,3 20,5 20,1 1,0 0,64 0,85 67,4
По литературным данным, тропонин — эквимолекулярный комплекс, а различия в соотношении компонентов отражают неодинаковую скорость про-теолитической деградации компонентов тропонина, заметно проявляющую себя в процессе изоляции белка из миофибрилл (Yates, Greaser, 1983). Из полученных нами данных можно заключить, что если протеолиз является причиной наблюдаемого распределения тропонинов, то наибольшей стабильностью обладает самый тяжелый компонент тропонинового комплекса скелетных мышц глубоководных рыб. В то же время в мышцах традиционных объектов самым стойким к протеолизу является компонент со средней молекулярной массой (Sperling et al., 1979). Однако различия в молекулярных массах и содержании компонентов тропонинового комплекса практически не отражаются на молекулярных массах белков, которые составляют близкие величины — 67,1-68,2 кДа (табл. 4).
На основании полученных результатов исследования состава миофибриллярных белков выполнены отнесения основных сигналов электрофореграмм к соответствующим им компонентам мио-фибрилл. Анализ денситограмм (рис. 6) позволил точно установить количественное содержание основных миофибриллярных белков исследуемых объектов.
Состав и молекулярные массы основных миофибриллярных белков скелетных мышц исследованных объектов представлены в табл. 5.
Рис. 6. Денситограммы электрофореграмм мышечных белков глубоководных рыб: a — макруруса пепельного, б — лемонемы, в — макруруса малоглазого; MHC — тяжелые мио-зиновые цепи, Ac — актин, Tn — (T, I, C) — тропонины, Tm — тропомиозин, LC1-3 — легкие миозиновые цепи
Fig. 6. Densytogramms of deep-sea fishes muscle protein's electro-phoregramm: a — Coryphaenoides ci-nereus, б — Podonema longipes, в — Coryphaenoides pectoralis; MHC — myosin heavy chain, Ac — actin, Tn — (T, I, C) — troponin, Tm — tropomyosin, LC1-3 — myosin light chains
Таким образом, методом электрофореза показано, что качественный состав основных миофибриллярных белков глубоководных рыб идентичен таковому для традиционных объектов рыбного промысла. Однако наблюдались различия в содержании минорных белков, доля которых для традиционных объектов составляет 4-6 %, для глубоководных — 7-11 %. Глубоководные объекты отличаются более низким соотношением миозин/актин актомиозинового комплекса — 2,6-2,8. При этом миозины скелетных мышц глубоководных рыб характеризуются большой молекулярной массой легкой цепи ЬС1 — 27,0-28,5 кДа. Тропомиозины скелетных мышц глубоководных объектов отличаются меньшим соотношением а- и р-субъединиц — 1,1-1,35: 1,0. При этом максимальное соотношение субъединиц отмечено для тропомиозина макруруса малогла-зого — объекта с максимальным содержанием влаги в мышечной ткани, а
Taô^Hua 5
Ko^HqecTBeHHMH cocTaB mho^HÔPH^^HPHMX ôe^KOB r^y60K0B0AHMX pbi6
Table 5
Quantitative composition of deep-sea fish myofibrillar proteins
Объект Белок MW, кДа %
Макрурус Миозин (тяжелые цепи) 207,0 60,6*
пепельный Актин 47,0 21,25
( Coryphaenoides Тропонин 37,3 6,2*
cinereus) 20,5 20,1
Тропомиозин 33,0 4,8
34,0
Миозин (легкие цепи) 16,5 17,3 27,2
Лемонема Миозин (тяжелые цепи) 207,0 59,8*
(Podonema Актин 47,0 21,7
longipes) Тропонин 39,0 20,4 17,7 6,2*
Тропомиозин 34,2 4,6
36,6
Миозин (легкие цепи) 16,8 17,5 27,0
Макрурус Миозин (тяжелые цепи) 207,0 56,8*
малоглазый Актин 47,0 21,9
( Coryphaenoides Тропонин 38,0 5,4*
pectoralis) 21,0 18,5
Тропомиозин 34,3 4,7
36,0
Миозин (легкие цепи) 16,8 18,0 28,5
* Общее содержание.
минимальное — для макруруса пепельного, содержание влаги в мышцах которого минимально в ряду исследованных объектов. Соотношение субъединиц тро-понинового комплекса характеризуется преобладанием самого тяжелого компонента. В ряду исследованных объектов его доля в тропониновом комплексе тем больше, чем выше его молекулярная масса.
Дальнейшие исследования позволят установить, насколько обнаруженные различия количественного состава миофибриллярных белков влияют на физико-химические свойства скелетных мышц глубоководных рыб.
Литература
Борисочкина Л.И., Дубровская Т.А. Технология продуктов из океанических рыб. — М.: ВО "Агропромиздат", 1988. — 209 с.
Технологическая характеристика глубоководных рыб и комплексная технология их переработки / Под. ред. Л.И.Перовой. — Калининград: АтлантНИРО, 1978. — 23 с.
Туроверов К.К., Хайтлина С.Ю., Пинаев Г.П. Флуоресцентные свойства и определение содержания нативного актина в его препаратах // Биохимия. — 1975. — Т. 40, вып. 2. — С. 316-322.
Туроверов К.К., Щелчков Б.В. Исследование тепловой денатурации белков с помощью двухволнового метода регистрации изменений спектра их ультрафиолетовой флуоресценции // Биофизика. — 1970. — Т. 15, вып. 6. — С. 965-972.
Bailey K. Tropomyosin: a new asymmetric protein component of muscle fibril // Biochem. Journ. — 1948. — Vol. 43, № 2. — P. 271-279.
Bruggmann S., Jenny E. The immunological specificity of myosins from cross-strained muscles as revealed by quantitative microcomplement fixation and enzyme inhibition by antisera // Biochem. Biophys. Acta. — 1975. — Vol. 412, № 1. — P. 39.
Cheng C.S., Parrish F.C. Heat-induced changes in myofibrillar proteins of bovine longissimus muscle // J. Food Sci. — 1979. — Vol. 44. — P. 23-26.
Connel J. J., Howgate P.E. Studies on the properties of skeletal Muscle // Biochem. Journ. — 1959. — Vol. 71, № 1. — P. 83-86.
Cummins P., Perry S.V. Chemical and immunochemical characteristics of tropomyosins from striated and smooth muscle // Biochem. Journ. — 1974. — Vol. 141, № 1. — P. 43-49.
Endo H., Yabe M., Amaoka K. Occurance of the Macrourid alevins genera albatrossia and Coryphaenoides in the Northern Pacific Ocean // Jap. Journ. of Ichtihy-ology. — 1993. — Vol. 40, № 2. — P. 219-226.
Ishikawa H. Fine structure of skeletal muscle // Cell and muscle Motility. — N.Y.: Plenum Press, 1983. — P. 1-40.
Layne E. Proteinbestimmung über UV-Extinktion (280/260 nm) // Meth. Enzy-mol. — 1957. — Vol. 3. — P. 447-454.
Parry D.A.D. Structure of rabbit skeletal myosin. Analysis of amino acid sequences of two fragments from the rod region // J. Mol. Biol. — 1981. — Vol. 153. — P. 459-464.
Potter J.D. The content of troponin, tropomyosin, actin and myosin in rabbit skeletal muscle myofibrils // Arch. Bioche. Biophys. — 1974. — Vol. 162. — P. 436-441.
Siebenaller J.F. The effects of hydrostatic pressure on signal transduction in brain membranes of deep-sea fishes of the genus Coryphaenoides // Fish Physiol. and Bio-chem. — 2000. — Vol. 23, № 2. — P. 99-106.
Sperling J.E., Feldmann K., Meyer H. et al. Isolation, characterization and phosphorylation pattern of the troponin complexes TI2C and I2C // Eur. Journ. Biochem. — 1979. — Vol. 101. — P. 581-592.
Stevens C.K., Siebenaller J.F. The effects of hydrostatic pressure on pertussis toxin-catalyzed ribosylation of G proteins from deep-living macrourid fishes // Comp. Biochem. and Physiol. B: Biochem. and Molecular Biology. — 2000. — Vol. 125, № 1. — P. 103-114.
Staprans I., Watanabe S. Optical properties of troponin, tropomyosin and relaxing protein of rabbit skeletal muscle // J. Biol. Chem. — 1970. — Vol. 245. — P. 5962-5966.
Strehler E.E., Carlsson E., Eppenberger H. M., Thornell l.E. Ultrastructural localization of M-bond protein in chiken breast muscle as revealed by combined immunocy-tochemistry and ultramicrotomy // J. Mol. Biol. — 1983. — Vol. 166. — P. 141-158.
Suzuki A., Goll D.E., Singh I. et al. Some properties of purified skeletal muscle a-actinin // J. Biol. Chem. — 1976. — Vol. 251. — P. 6860-6870.
Taguchi T., Kikuchi K., Tanaka M., Suzuki K. Heat coagulation of fish actin // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. — 1979. — Vol. 45, № 5. — P. 639-642.
Warburg O., Christian W. Isolierung und Kristallisation des Gärungsferments Eno-lase // Biochem. Z. — 1941. — Vol. 310. — P. 384-421.
Yates L.D., Greaser M.L. Troponin subunit sticheometry and content in rabbit skeletal muscle and myofibrils // J. Biol. Chem. — 1983. — Vol. 258. — P. 5770-5774.
Поступила в редакцию 24.04.03 г.
