CC BY
16КАЧЕСТВЕННО-КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОМАРКЕРОВ ВЫДЫХАЕМОГО ВОЗДУХА ЧЕЛОВЕКА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ
СОСТОЯНИЯХ
Карабиненко А.А.,
доктор медицинских наук, профессор кафедры госпитальной терапии №2 лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ
им. Н.И.Пирогова, Богомолова А.А.,
врач-исследователь кафедры госпитальной терапии №2 лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова
Надеждинский А.И.,
доктор физико-математических наук, профессор, зав. отделом диодно-лазерной спектрометрии Института общей
физики им. А.М. Прохорова РАН Понуровский Я.Я.,
кандидат физико-математических наук, ведущий научный сотрудник отдела диодно-лазерной спектрометрии Института общей физики им. А.М. Прохорова РАН
Заславский В.Я.,
кандидат физико-математических наук, ведущий научный сотрудник отдела диодно-лазерной спектрометрии Института общей физики им. А.М. Прохорова РАН
Шастун С.А.,
доктор биологических наук, профессор кафедры нормальной физиологии медицинского факультета ФБОУ ВПО РУДН
им. П.Лумумбы
QUALITATIVE AND QUANTITATIVE FEATURE OF BIOMARKERS OF HUMAN EXHALED AIR AT DIFFERENT FUNCTIONAL STATES
Karabinenko A.A., MD, Professor, Department of Hospital Therapy №2 Medical Faculty Pirogov Russian National Research Medical University (RNRMU),
Bogomolova A.A., doctor and researcher of the Department of Hospital Therapy №2 Medical Faculty Pirogov Russian National Research Medical University (RNRMU)
Nadezhdinsky A.I., Doctor of Physical and Mathematical Sciences, Professor, Head. Department of diode-laser spectroscopy, Institute of General Physics. AM Prokhorov, Russian Academy of Sciences
Ponurovsky Ya. Ya., Candidate of Physico-Mathematical Sciences, a leading researcher at the Department of diode-laser spectroscopy, Institute of General Physics. AM Prokhorov, Russian Academy of Sciences
Zaslavsky V.Ya., Candidate of Physical and Mathematical Sciences, Senior Research Fellow, Department of diode-laser spectroscopy, Institute of General Physics. AM Prokhorov, Russian Academy of Sciences
Shastun S.A., Doctor of Biological Sciences, Professor Normal Physiology Department Peoples' Friendship University of Russia.
АННОТАЦИЯ
Работа посвящена изучению биомаркеров выдыхаемого воздуха человека, определяемых методом диодно-лазерной спектрометрии (ДЛС). Применен новый образец устройства для ДЛС биомаркеров выдыхаемого воздуха. Показана возможность одновременного отслеживания уровня биомаркеров 12CO2, 13CO2, CH, H2S, NH3 у 162 пациентов с различными заболеваниями в фазе и ремиссии в покое, при физической нагрузке, восстановлении и после приема пищи. Выявлены биомаркеры выдыхаемого воздуха, позволяющие оценивать состояние кардиореспираторной функции, газообразных ин-градиентов, отражающих интенсивность пищеварения и степень инвазии B. Helicobacter pylori, характер пищевого режима. Выявляемые отклонения уровня биомаркеров выдыхаемого воздуха имеют диагностическое и прогностическое значение при проведении массовых скрининговых исследований.
ABSTRACT
The work is devoted to the study of biomarkers of exhaled human air determined by diode laser spectroscopy (DLS). Apply a new sample device DLS biomarkers of exhaled air. The possibility of simultaneous monitoring biomarker levels 12CO2, 13CO, CH4, H2S, NH3 in 162 patients with various diseases in the remission phase and at rest, during exercise, recovery and post-prandial. Identified biomarkers of exhaled air, allowing to assess the state of the cardiorespiratory function, gaseous Ingredients, reflecting the intensity of the digestive system and the degree of infestation B. Helicobacter pylori, the nature of the food regime. Identified deviations biomarkers of exhaled air levels have diagnostic and prognostic value during mass screening.
Ключевые слова: диодно-лазерная спектрометрия, выдыхаемый воздух, биомаркеры, нагрузочные тесты, скрининг.
Key words: diode laser spectrometry, exhaled air, biomarkers, stress tests, screening.
Актуальность проблемы: В настоящее время накоплен [8-10]. Каждое из соединений характеризуется своей осо-достаточно большой объем данных, свидетельствующих бой ролью в жизни организма, специфическими механиз-о возможности качественного и количественного опреде- мами образования и фармакинетикой, включая способы ления газообразных биомаркеров в биологических средах, и пути метаболизма. Помимо основных атмосферных применяемых в медико-физиологических исследованиях молекул (H2O, CO2, N2, O2) в выдыхаемом человеком воз-
духе методом масс-спектрометрии выявлено около 1000 газообразных метаболитов с концентрациями на уровне ррЬ-рр1 [7]. Известно, что при прохождении светового потока через газовую среду методом спектрального анализа можно получить качественно-количественные характеристики химических веществ, которые находятся в составе исследуемой газовой среды. Газовый анализ — основное прикладное направление использования методов диодно-лазерной спектрометрии (ДЛС) [5]. С её помощью реализуются высокие аналитические характеристики, такие как концентрационная чувствительность, точность детектирования, селективность, скорость регистрации и т.п. По данным различных исследований аналитические возможности ДЛС достаточно четко определяют направления перспективного использования данного подхода в этой области. Это, во-первых, детектирование достаточно легких газообразных молекул типа СО, С02, N0, N0^ ^0,
т,, но, НО, с,н, с,н, си,о, сн, си,ои, с,их>и,
3 2 2 2 2 4 2 6 2 4 3 2 5
С82, Н28, С5Н12, СН20Н8 и других в диапазоне концентраций от 1 млн-1 до 0.1 млрд-1 [3-5]. Во-вторых, возможна высокоточная регистрация изотопических модификаций молекул-метаболитов, обогащенных такими элементами, как Б, 13С, 180, 15N и 358, и спиновых модификаций, например орто- и параводы [1, 2]. В-третьих, долговременный мониторинг содержания вышеперечисленных соединений, включая многокомпонентный, а также исследование динамики их содержания в процессе одного дыхательного цикла в режиме реального времени, которые могут осуществляться без накопления или обогащения анализируемой газовой смеси. И, в-четвертых, применение данного подхода для исследований газообмена малых биообъектов - лабораторных животных и растений, в-пятых, возможность проведения скрининговых дыхательных тестов является эффективным методом оценки функционального состояния организма.
Под скрининговым исследованием в медицине пони-
мают комплекс мер, направленных на выявление заболевания в широкой группе населения при отсутствии ярко выраженных симптомов болезни. Основными требованиями к скрининговым тестам является простота, неинва-зивность и безопасность процедуры тестирования, высокая скорость обработки данных, возможность выявления заболеваний на ранней стадии. Для медико-физиологических исследований нередко используются различные газоанализаторы выдыхаемого воздуха, которые преимущественно задействованы на исследование лишь одного биомаркера (например, уреазный дыхательный тест на определение B. Helicobacter pylori, этаноловый тест, кап-нометрия и др.). Таким образом, метод ДЛС универсален для широкого круга газообразных объектов и чрезвычайно гибок для адаптации к различным задачам газоанализа [6]. Применение этого метода для изучения состава газообразных сред с использованием среднечастотных и низкочастотных диодно-лазерных систем, работающих в инфракрасном диапазоне, позволило определять большинство газообразных веществ, составляющих основные газометаболические продукты жизнедеятельности человека - 12CO2, 13CO2, CH4, H2S, NH3, SO2, NO2. Однако метаболические закономерности для большинства биологически активных молекул до сих пор недостаточно хорошо изучены.
Цель исследования: С целью выявления взаимосвязи газообразных биомаркеров метаболических процессов, протекающих в организме, в норме и при различных патологических состояниях человека нами было предложено определение некоторых газообразных молекул ВВ, которые одновременно выявлялись в порциях ВВ при их нахождении в газоаналитической камере "Herriott" инфракрасного диодно-лазерного спектроанализатора никочастотного диапазона (рис.1), разработанного в лаборатории диодно-лазерной спектрометрии ИОФ им. А.М.Прохорова РАН.
Рис. 1. Аналитическая кювета - "НетоИ". Базовая длина 30 см, полный оптический путь 25 м, Объем 2.6 л.
Всего качественно-количественная оценка ВВ методом ДЛС проводилась у 162 обследуемых (122 мужчин и 40 женщин) в возрасте от 19 до 74 лет, которые находились в терапевтическом отделении многопрофильного стационара в стабильной реабилитационной фазе различных
терапевтических заболеваний при удовлетворительном самочувствии больных сахарным диабетом 2 типа, хроническим гастродуоденитом, хроническим обструктив-ным бронхитом, реконвалесцентной фазы внебольничной пневмонии, хронической обструктивной болезни легких,
циррозом печени различной этиологии в фазе субкомпенсации, хронической болезни почек 1-3 ст., некризовым течении гипертонической болезни 2-3 ст., ишемической болезни сердца 2-3 функционального класса). Обследуемые выдыхали воздух в герметичный пластиковый мешок ёмкостью 2 л. Порции ВВ у большинства пациентов (112 человек, 90 мужчин и 22 женщины) исследованы в состоянии физического покоя, а у 40 человек (22 мужчин и 18 женщин) - в состоянии покоя, при дозированной физической нагрузке (30 приседаний, до достижении ЧСС 140 уд/ мин) и в периде восстановления после нагрузки. При этом у всех пациентов параллельно регистрировались показатели гликемии, ЧД, АД и пульсоксиметрии (8рО, и ЧСС).
100000
Результаты обследования и их обсуждение: При сравнении порций ВВ, взятых в состоянии покоя, с воздухом помещения (внешней среды), отмечается закономерное значительное увеличение (в 20-50 раз) содержания «легкой» фракции 12СО2 от 12300 до 25700 ррт. Такой расброс связан с различиями основного обмена и функциональным состоянием крдио-респираторной системы [11] у пациентов различного пола, возраста, индивидуальной выраженности компенсаторно-приспособительных реакций при различных заболеваниях внутренних органов. Тем не менее, при вариационном анализе 80 пациентов выявляется медиана распределения, характерная для каждого исследуемого газа (рис.2).
10000
Е
о. о.
о О
о
о
1000
100 3
10 ;
0.1
У -tT - А«-;'---»-«У
Оо
Л *и М *
____.1.4»
С 2 4 Б а 1С 1214 16 13 2С 22 2426 23 ЗС 32 3436 33 4042 44464В 5052 5456 5В ВО 62 64 56 6В7072 7476 7В ВО
Patient #
• С02
• СН4
• bronchitis С02
---meanC02
----Mean CH4
■ chronic renal "failure CH4
4 pneumonia CH4
д coronary artery disease CH4
Рис.2 Концентрация биомаркеров (СО2 и СН4) выдыхаемого воздуха у 80 пациентов с различными заболеваниями.
Как видно из приведенной вариации распределения газообразных биомаркеров ВВ, снижение концентрации выдыхаемого 12СО2 характерно при наличии тяжелой кар-дио-респираторной несостоятельности у больных ХОБЛ средне-тяжелого и тяжелого течения (класса С и D по классификации тяжести течения GOLD, 2014). Это подтверждалось снижением показателя Sp02 в тканях менее 90%. Метан (СН4) ВВ в основном образуется в желудочно-кишечном тракте путём «метанового брожения» перевариваемых пищевых продуктов. Повышение его содержания в ВВ у больных с хронической болезнью почек и при ИБС может быть связано с функциональным нарушением функции печени и ЖКТ в целом, что требует уточнения при дальнейших целенаправленных исследованиях. Содержание 13СО2 до 250-320 ррт в ВВ в покое выявлялось в 88% случаев, что указывало на вероятность наличия
B. Helicobacter pylori в желудке (сопоставление с дыхательным уреазным тестом выявило высокую корреляционную взаимосвязь, r =+0,78). Сероводород (H2S) был выявлен в выдыхаемом воздухе только у 1 пациента, у которого была необходимость в санации зубов. Во всех остальных случаях этот газообразный метаболит ВВ находился в следовых концентрациях (меньше 0,01 ррт) после приёма пищи.
Пробы с физической нагрузкой выявляли закономерное увеличение содержания 12СО2 и 13СО2 в ВВ в 1,5-2 раза по сравнению с исходными значениями. В то время, как содержание метана (СН4) на высоте нагрузки значительно снижалось. Это иллюстрировано на примере динамики газообразных биомаркеров ВВ у пациента 72 лет, страдающего сахарным инсулинзависимым диабетом 2 типа средней степени тяжести, гипертонической болезнью 2 ст., ХОБЛ средне-тяжелого течения (рис 3.).
30000280002600024000220002000018000-
30
25-
20-
15-
10-
Рис. 3. Динамика изменения концентрации биомаркеров ВВ (12СО2, 13СО2, СН4) при проведении физической и пищевой нагрузки у пациента К., 72 лет.
Промежутки измерений по времени (слева направо): 1 -исходный уровень; 2 - на высоте физической нагрузки (30 приседаний); 3 - восстановление 10 мин.; 4 - перед приемом пищи; 5 - через 60 мин после приёма пищи (1100 кал).
Как видно на графиках динамики газообразных биомаркеров ВВ, на фоне физической нагрузки (с достижением ЧСС 140 уд/мин) отмечается повышение концентрации 12СО2 и 13СО2 и «выгорание» СН4, в то время как в период восстановления наблюдаются прямопротивоположные изменения. На фоне пищевой нагрузки наблюдалось повышение концентрации 12СО2 в меньшей степени, чем при выполнении физической нагрузки и повышение 13СО2 в большей степени, чем при физической нагрузки, а также увеличение СН4 в отличие от его снижения при физической нагрузке. Увеличение содержания 13СО2 и СН4 по-
сле приёма пищи связано с влиянием ферментативных процессов на газообразование в ЖКТ, что указывает на гастроинтестинальное происхождение указанных выше биомаркеров ВВ.
Анализ результатов биомаркеров ВВ в режиме скри-нинговой оценки представляет интерес по выявлению симптомов развития некоторых физиологических и патологических состояний (рис. 4 и 5). Так, по характеристикам динамики газообразных биомаркеров ВВ с выполнением физических нагрузок можно выявлять лиц, которых можно причислить к «мясоедам», т.е. те люди, которые предпочитают в своем рационе мясную пищу (рис.4). У них выявляется повышенное содержание метана (СН4), которое также значимо превышает его содержание на фоне нагрузочных проб.
Рис. 4. Динамика концентрации СН4 в ВВ в покое, при физической нагрузке и при восстановлении в зависимости от характера пищевого рациона.
Наглядная иллюстрация изменений концентрации ме-
Скрининговый метод динамической оценки 12СО2 ВВ в
тана (СН4) у пациентов 3, 6, 7, 9, 10, 12, 14 и 15, употребля- диагностике кардио-респираторных нарушений позволяющих в основном мясную пищу, в сравнении с популяци- ет выявлять лиц с заболеваниями легких и сердечно-сосу-ей лиц, предпочитающих смешанную пищу. диетой системы (рис. 5).
■ капифовэчъй %
■ Иэ«даьй% Фю. нагрузка %
■ Восстансвгеше %
Рис. 5. Динамика выдыхаемого 12СО2 в покое, при физической нагрузке и при восстановлении у пациентов с субком-пенсированными заболеваниями кардио-респираторной системы.
При субкомпенсированном течении заболеваний кар-диореспираторной системы (легочно-сердечная недостаточность и хроническая сердечная недостаточность 2-3 функционального класса, ИБС, артериальная гипертония, реабилитанты после обострения ХОБЛ средне-тяжелого течения, тяжесть класса С)у пациентов №5 и №8 отмечается значительное снижение концентрации 12СО2 в ВВ. При этом, у пациентки №5 с преимущественно васкулярной патологией легких и легочной гипертензией (ДСЛА = 75 мм рт.ст., васкулит при системной красной волчанке) обращает на себя внимание низкий уровень биомаркеров до нагрузочного теста, в то время как у пациента №8 с субком-пенсированным интерстициальным заболеванием легких (бронхоальвеолит) имеется более выраженное снижение концентрации 12СО2 в ВВ после небольшой физической нагрузки (10 приседаний).
Таким образом, конструктивные усовершенствования
газоаналитического ДЛС-устройства позволили упростить процедуру обследования пациентов, обеспечить его высокую мобильность и повысить безопасность его применения в массовых скрининговых медико-физиологических исследованиях. При проведении исследований в условиях многопрофильной клиники показана хорошая сопоставимость полученных результатов содержания биомаркеров в выдыхаемом воздухе: 12СО2 , 13С02, СН4, И28,
кн3.
Одновременно фиксировались показатели пульсокси-метрии (Эр02), ЧСС, АД, ЧДД, глюкоза крови. Параллельное наблюдение за указанными параметрами широко известно в практике, поэтому отметим, что при выполнении нагрузочных проб наблюдается закономерное учащение ЧД и ЧСС, повышение АД и тенденция к уменьшению показателей оксигенации тканей (Эр02), особенно у пациентов с заболеваниями кардио-респиракторной си-
стемы. Наиболее существенно и закономерно на высоте нагрузки по отношению к исходным в покое изменялись параметры 112СО2 , СН4 ЧСС, ЧД, 3р02, глюкоза крови (у пожилых вследствие истощения гликогенового резерва — снижение уровня глюкозы при нагрузке, а у молодых, при сохранном гликогеновом резерве отмечается нароста-ние уровня гликемии). Исходное повышение содержания 12СО2 свидетельствует о скрытых или явных нарушениях газообменной функции легких или о снижении основного обмена. Это может быть косвенным маркером скрыто протекающих заболеваний органов дыхания, гипофункции щитовидной железы и др. патологических процессов. При нагрузке по сравнению с покоем в выдыхаемом воздухе существенно снижается уровень СН4, который «сгорает» в результате ускорения метаболических реакций. Показатели 13СО2 четко коррелируют с функциональным состоянием желудочного пищеварения (реагируют на прием пищи, наличия функциональных нарушений желудочно-кишечного тракта), что подтверждается многочисленными клиническими исследованиями уреазных дыхательных тестов.
Выводы: Таким образом, методы диодно-лазерной спектрометрии, соответствуют требованиям, предъявляемым к скрининговым инновационным технологиям для выявления скрыто протекающих патологических процессов и функциональных нарушений у человека. Внедрение этого метода в практику медико-физиологических исследований имеет важное значение, поскольку простота и точность измерения газообразных биомаркеров в минимальных концентрациях на уровне ррт, ррЬ позволяет применить эти методы в массовых скрининговых исследованиях для выявления лиц с отклонениями от средне-статистической нормы параметров газообразных метаболитов ВВ человека в условиях различных нагрузок позволяют обоснованно определить группы риска скрытых заболеваний и оценить степень функциональных нарушений.
Это создает основу для разработки новых технологических и методических подходов к неинвазивной биомедицинской диагностике, базирующихся на анализе дыхания и газообмена, в которых используются исследования в реальном времени, долговременный непрерывный мониторинг, массовые скрининговые обследования, новые нагрузочные тесты и т.п. С точки зрения практической медицины актуальность данного направления исследований обусловлена перспективностью использования результатов для разработки новых методов корреляционной диагностики заболеваний, радиационно-безопасной изотоп-диагностики с применением стабильных изотопов, сопровождения и оптимизации терапевтических воздей-
ствий различного характера, диагностики экстремальных физиологических состояний, а также для фармакологических исследований, оценки воздействия загрязнений окружающей среды и скрининговых тестов населения [6].
Список литературы:
1. Binhi V.N., Stepanov E.V. Tunable diode-laser spectroscopy of the para- and ortho-water vapour as a tool for investigation of metastable states of liquid water // Biological Effects of EMFs Crete Conf. Heraklion, Crete, Greece. October 17-20, 2000.
2. Степанов Е.В., Тихонов В.И., Миляев В.А. Применение перестраиваемых диодных лазеров для диагностики молекул орто- и параводы // Квантовая электрон. 2005. T. 35, № 3. C. 205- 206.
3. Preier H. Physics and applications of IV-VI compound semiconductor lasers // Semicond. Sci. Technol. 1990. Vol. 5. P. S12-S20.
4. Хинкли Е.Д., Нилл К.В., Блум Ф.А. Инфракрасная спектроскопия с использованием перестраиваемых лазеров // Лазерная спектроскопия атомов и молекул / Под ред. Г. Вальтера. М.: Мир, 1979. C. 155-235.
5. Курицын Ю.А. Инфракрасная спектроскопия с ин-жекционными лазерами // Лазерная аналитическая спектроскопия / Под общей редакцией В.С. Летохова. М.: Наука, 1986. C. 120- 173.
6. Степанов Е.В. Методы высокочувствительного газового анализа молекул-биомаркеров в исследованиях выдыхаемого воздуха // Труды Института общей физики им. А.М. Прохорова, 2005. Т61.
7. Terence Risby, Johns Hopkins University. From F.Tittel presentation at A.M.Prokhorov TDLS seminar # 9.
8. A.I.Kuznetzov, K.L.Moskalenko, A.I.Nadezhdinskii and E.V.Stepanov, Sensor Based on Tunable Diode Lasers and Mid-IR-Fiber Optic and Their Diagnostic Applications in Medicine and Enviromental Protection, Journal de Physique IV, 1, C7-253 (1991)
9. K.L.Moskalenko, N.Ya.Sobolev, I.A.Adamovskay, E.V.Stepanov, A.I.Nadezhdinskii, Susan McKenna-Lawlor, Tunable diode lasers application for fully automated absolute measurements of CO and CO2 concentrations in human breath, Proc.SPIE, 2205, 440-447 (1994)
10. K.L.Moskalenko, A.I.Nadezhdinskii, E.V.Stepanov, Tunable diode laser spectroscopy application for ammonia and methane content measurements in human breath, Proc.SPIE, 2205, 448-452 (1994)
11. Гайтон А.К. Медицинская физиология. Пер.с англ. Под ред.
