CC BY
15
Elmlar Akademiyasi. Xabarlar (Серия биологических наук), 2008, №1-2, с. 139
4. Сеидова Г.М., Микробиологические аспекты природной контаминации продовольственного сырья и продуктов питания плесневыми грибами и пути профилактики микотоксикозов в Азербайджане // Azarbaycan tababatinin muasir nailiyyatlari, 2010, №1
5. Baradkar V.P., Mathur M., Kumar S. Uncommon presentation of pulmonary aspergilloma // Indian J Med Microbiol., 2009, v.27(3), p.270-2
SUMMARY About biological features some fungi, which produced spolaige
G.M.Seidova
Azerbaijan Medical University, Baku
Since 1960 years, more 350 moulds were studied wщижщ can npoduced мйжотохинс. The complixity character of infection of cere als metabolites of Aspergillus is that the level, of жонтоминатиош of aflatoxins the same kind of culture is not just one area, but in the whole lanascape zone can be contained the least amount of toxins, and in another, thes same culture. Given the real danger of contamination with aflatoxin population, first of all, necessory to giarkly create, approve and impliment a national program of regional and global monitoring for microbological contamination of cereals metabolitis of fungi of the genus Aspergillus.
_Поступила: 09.02.2017
К вопросу ультраструктуры «некультивируемых» патогенов при острых кишечных инфекциях
1 2 12 Ф.Э. Садыхова , Э.К. Касимов , Э.А. Дадашев , Ф.Г.Рзаев
Азербайджанский Государственный институт
усовершенствования врачей имени А.Алиева1;
Азербайджанский медицинский университет , г.Баку
Известно, что менее 1% бактерий могут быть выращены в искусственных условиях, остальные представляют собой «некультиви-руемые» формы. И в этой связи следует отметить, что каждый экологический образец из внешней среды или, даже, из организменных проб исследуемого материала может содержать изобилие разновидностей, неизвестных ранее и которые, возможно, никогда не встретятся в будущем. У более 300 прокариотов полностью расшифрованы геномы, более 100 геномов в стадии завершения расшифровки, но только несколько десятков прокариот достаточно хорошо изучены [1]. И в этом аспекте, в связи с известным фактом существования «некультивируемых» микроорганизмов, которые могут быть в реальности этиологическим фактором патологического инфекционного процесса, представляется актуальной пробле-
ма изыскания презентативных диагностических методов исследования.
И в этой связи целью наших изысканий было определение спектра «некультивируемых» патогенов в материале от больных с острыми кишечными инфекциями (ОКИ) с использованием феномена бактериофагии при их рекультивации.
В этой связи нами проведена работа по поэтапной диагностике ОКИ с решением следующих задач:
1. Выделение и идентификация патогенов из суспензии фекалий от больных ОКИ классическим культуральным методом.
2. Единовременное и параллельное исследование по воздействию на полученную суспензию фекалий бактериофагами в различных сочетаниях с получением эффекта (феномена) фаголизиса с последующим (вторич-
ным) помутнением бульона «вторичными» культурами, включающими фагорезистентные штаммы микроорганизмов, включая «некуль-тивируемые», «покоящиеся», «сессильные» патогены.
3. Посев и идентификация патогенов из «вторичных» культур после фаголизиса бактериологическим культуральным методом.
4. Исследование «вторичных» культур изучением ультраструктуры патогенов методом электронной микроскопии, с последующим сопоставлением детектированных микроорганизмов с известными и изученными патогенами, опубликованными в официальной печати [7].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Выделение и идентификация патогенов из суспензии фекалий от больных с ОКИ с изучением биохимических свойств выделенных микроорганизмов было проведено классическими культуральными бактериологическими методами (2,3) с использованием расширенного набора питательных сред: мясо- пептонный агар, желточно - солевой агар, среда Эндо, SS-агар, маннитосолевой агар. При изучении феномена фаголизабельности были применены бактериофаги: бактериофаг стафилококковый жидкий (Bacteriophagum staphylococcus fluidum, Intestibacteriophagum Combinireae Ligvidum, Pyobacteriophagum combinireae Liguidum.
Intesti bacteriophagum combinereae liguidum включал: Shigella flexneri 1,2,3,4 Shigella son-nei, Shigella Newcastle, S.paratyphi A, S.paratyphi B, S.typhimurium, S.enteritidis, S.choleraesuis, S.oranienburg, Escherichia coli, Proteus (vulgaris, mirabilis), Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis.
Pyobacteriophagum combinireae liguidum включал: Staphylococcus aureus, Streptococcus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus (vulgaris, mirabilis).
В исследовании применён метод фаголизиса [4]. При изучении ультраструктуры микроорганизмов применён метод электронной микроскопии с использованием микроскопа Latimed (Leitz). Материал для исследования центрифугировался и из полученного осадка готовились эпонаралдитовые блоки. Получен-
ные блоки разрезались посредством ультратомов LKB- III, Leica EM UC7 на полутонкие срезы толщиной 1-2 цт и окрашивались ме-тиленовым азуром II и основным фуксином. При микроскопировании срезов в микроскопе Latimed (ЪеИ^)фотоснимки производились цифровой фотокамерой Pixeza.Для исследования в электронном микроскопе серебристые и золотистые ультратонкие срезы толщиной 70100 нм окрашивались сначала 2%- ным ура-цил- ацетатным раствором, затем 0,6% - ным раствором чистого цитрата свинца в NaOH с концентрацией 0,Ш.Ультратонкие срезы исследовались в трансмиссионном электронном микроскопеНйасЫ 12E и JEM - 1400 при напряжение 80 -120 кв. Полученные в формате TiF микрофотографии и электронограммы анализировались и описывались при помощи морфометрической компьютерной программы «The TEM imaging platform», созданной немецкой компанией «Olympus Soft imaging Solutions GmbH» (5,6).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основываясь на морфологической картине первичного посева с получением кокковидных образований (рис 1) с последующим предварительным определением Staphylococcus aureus были взяты соответствующие элективные среды: желточно- солевой агар, маннитосолевой агар.
На ЖСА были выявлены мелкие, гладкие, белесоватые колонии с характерным ободком (ферментация лецитиназы).
Окраска по Граму выявила грамположи-тельные шаровидные кокки, расположенные как поодиночке, так и скученно в виде виноградных гроздьев.
После идентификации и изоляции чистой культуры S. aureus было проведено исследование биохимических свойств микроорганизма на маннитовой среде. В столбик с агаром был произведен посев бактериальной иглой и через сутки было отмечено пожелтение среды. Далее, с целью выявления «некультивируе-мых» патогенов в нативном материале было проведено исследование по фаголизабельно-сти возможно имеющихся в нём микроорганизмов. С этой целью в пробирки с нативным материалом добавлялись бактериофаги: в первую пробирку- стафилококковый бактерио-
фаг, во вторую- стафилококковый и «Инте-сти» бактериофаг в соотношении 1:1, в третью- стафилококковый бактериофаг, «Инте-сти» и «Пио» - бактериофаг в соотношении 1:1:1.
Через сутки в первой пробирке со стафилококковым бактериофагом было выявлено просветление, а ещё через сутки- повторное помутнение, то есть выявлено появление «вторичной культуры», включающее, возможно, фагорезистентные, «некульвируемые» («покоящиеся») патогены.
Для детекции отмеченных микроор- ганиз-мов был произведен посев «вторичной культуры» на среды: на мясо- пептонный агар, SS - агар, среду Эндо, кровяной агар, ЖСА; в две отобранные пробирки с маннитом был произведен посев бактериальной иглой материала из бульона со стафилококковым бактериофагом, в одну из них был добавлен также глицерин для обеспечения анаэробных условий. Предварительные морфологические исследования мазков с культурой, окрашенных по Граму, с использованием светового микроскопа выявили атипичные культуры, то есть выявлены были удлинённые, местами попарно расположенные, преимушественно грамотри-цательные палочковидные формы (Рис.2).
В пробирке с маннитом в анаэробных условиях посев из «вторичной» культуры выявил посинение, что указывало на присутствие штамма S. aureus.
Наряду с отмеченным результаты изучения морфологии «вторичной» культуры на мясо -пептонном агаре выявили колониальный рост в виде редких, мелких, беловатых колоний. На среде Эндо наблюдался рост мелких, редких колоний без металлического блеска.
Рост редких, мелких, беловатых колоний на желточно- солевом агаре характеризовался отсутствием ободка ферментации лецитиназы, что не характерно для культуры S. aureus, что подтверждает факт изменчивости микроорганизмов под воздействием ряда факторов и фагов, в том числе. Изучения морфологии патогенов в изучаемой нативной культуре под электронным микроскопом выявили кокко-видные структуры (рис. 3). Исследования же морфологии патогенов во «вторичной» культуре, то есть после воздействия бактериофа-
гом выявили наличие наряду с кокковидными структурами и палочковидные формы(Рис.4).
При сравнении полученных при электронной микроскопии фотографий ультраструктуры бактерий, детектированных нами из «вторичных» культур, (рис. 5,6,7) с фотографиями из «Атласов» с изученными ультраструктурами микроорганизмов (рис. 8,9,10) было выявлено, что палочковидные формы, выделенные нами, совпадают с фотографиями E.coli, Streptobacillus в «покоящихся» формах и Streptobacillus в изменённых формах (рис. 11,12).
Следует отметить следующее: исходя из изученных на сегодняшний день морфологических «различий» физиологически активных и «покоящихся» клеток E.coli в наших исследованиях во «вторичной» культуре выявлены следующие различия: форма палочки E.coli правильной формы, а у физиологически неактивной формы- палочки более мелкие, правильной формы.
НДНК(НН)- нити ДНК- в конденси- рован-ном состоянии переходного периода в отличие от нитей ДНК- в различной морфологической форме в физиологической активной клетке E.coli.
Нуклеоид- Н-в физиологически активной клетке- зона ярко выражена в центральной части или диффузно распределена в толще цитоплазмы, а при физиологически неак- тивной форме («покоящаяся» клетка)-зона нуклеоида практически не выявляется.
Учитывая клинику ОКИ у исследованных больных и выявленные признаки «покоящейся» формы патогена во «вторичной» культуре, он относим к I-ой группе патогенных эшерихий- варианта E.coli, вызывающие развитие острых кишечных инфекций и, в частности, к патовару- ДАКП- диффузно- адгези-рующие кишечные палочки, способные к повышенной колонизации поверхности различных слизистых оболочек (7). Касаясь выявленных кокковидных структур, то следует отметить их сопоставимость с изображением ультраструктуры клеток St. aureus, опубликованных в официальной печати (7).
После воздействия бактериофагом проявлены элементы изменчивости микроор- га-низмов: утолщение капсулы с неровными
фестончатыми краями со стёртыми пилями, напоминающие изменчивость в составе биоплёнок.
Наряду с детектированными патогенами в форме «покоящихся» клеток Е.соН следует отметить и наличие других неизученных (неизвестных) на сегодняшний день патогенов
(рис. 13,14) Результаты проведенных исследований по выявлению «некультивируемых», «покоящихся» клеток при ОКИ с неустановленной этиологией полагает необходимость исследований по изучению огромного сообщества микроорганизмов на нашей планете в перспективе.
Рис. 1. Результат изучения морфологии микроорганизмов в мазке из пробы фекалий от больного ОКИ до воздействия на пробу бактериофагом под световым микроскопом отмечаются кокковидные образования. Ув. 1000 раз.
Рис. 2. Результат изучения морфологии микроорганизмов в мазке из пробы фекалий от больного ОКИ после воздействия на пробу бактериофагом под световым микроскопом отмечаются кокковидные образования. Ув.1000раз
Рис.3 Результать изучения морфологии микроорганизмов в мазке из пробы фекалий от больного ОКИ до воздействия бактериофагами под электронным микроскопом: отчетливо видны кокковидные структуры: Ув^ 1000.
Рис. 4 Результать изучения морфологии микроорганизмов в мазке из пробы фекалий от больного ОКИ после воздействия бактериофагом под электронным микроскопом: наряду с кокковидными структурами очетливо видна и палочковидные формы. Ув. x 1000
Рис. 5 Результат изучения морфологии микроорганизмов в мазке из пробы
фекалий то больного ОКИ после воздействия бактериофагом под электронной микроскопом: выявлены патогенны палочковидной формы с некоторыми изменениями и в форме «покоящихся» структур. Ув. х 20.000
Рис.6 Результат изучения морфологии микроорганизмов в мазке из пробы фекалий от больного ОКИ после воздействия бактериофагом под электронным микроскопом: выявлены патогенны палочковидной формы с некоторыми изменениями и в форме «покоящихся» структур. Ув. х 10.000
Рис. 7. Результаты изучения морфологии микроорганизмов в мазке из проба фекалий от больного ОКИ после воздействия бактериофагом под электронным микроскопом: выявлены патогены палочковидной формы с некоторыми изменениями. Ув. х 46.500
■Углж: удьтраструктуры микробного кишечника человека
Глава 3. Основиьге представители семейства £тегоЬас<егшседе
Рис. 8. Ультратонкий срез фзиологически активной клетки Е.соН. Ув. 85000 («Атлас ультраструктуры микробиоты кишечника человека» О.В.Рыбальченко с соавт, 2008)
Рис. 9. Ультратонкий срез клеток E.coli: ФА- физиологически активная форма, ПК- покоящаяся (физиологически неактивной) Ув. 85000 («Атлас ультраструктуры микробиоты кишечника человека» О.В.Рыбальченко с со-авт, 2008)
Рис. 10.Ультратонкий срез покоящейся (физиологически неактивная). клетки E.coli. Ув. Х 70000.
Рис. 11. Позитивное окрашивание. Клетка E.coli в физиологически активном состоянии. Ув. Х 70000. («Атлас ультраструктуры микробиоты кишечника
Рис. 12 ТЭМ. Ультратонких срез фрагмента 1- суточной биопленки S.aureus с трехслойной мембраной в структуре поверхностной пленки. Ув. Х 65000
Рис.13. Неидентифицированные (нераспознанные) микроорганизмы (n.a.- not aviable microorganizms) Ув. х 150.000
Рис.14. Неидентифицированные (нераспознанные) микроорганизмы (n.a.- not aviable microorganisms Ув. х 100.000
ЛИТЕРАТУРА
1. Дятлов И.А. Актуальные проблемы медицинской микробиологии // ЖМЭИ, 2013, №1, с 88-89.
2. Поздеев О.К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В.И. Покровского, изд. группа. М.: ГЕОТАР - Медиа, 2010, 765с.
3. Мальцев В.Н., Пашков Е.П. Медицинская микробиология и иммунология / Под ред.
В.В. Зверева. М.:Практическая медицина 2014, с.14-509.
4. Гордеева Р.В. Изменения бактерий паратифа В. под влиянием VI- бактериофага in vitro.Изменчивость микроорганизмов / Под редакцией действ. проф. В.Д. Тимакова. М.: Медгиз, 1956, c.188-19
5. D'Amico F.A. Polychromaticstaining method for epoxyembedded tissue: a new combi-
nationofmethyleneblueand basicfuchsinefor ligh microscopy // Biotech Histochem, 2005, v.80, p.207-210
6. Electron Microscopy. Methods and Protocols. /Edited by John Kuo. USA, Totowa, New Jersey: Humana Press INC., 2007, 808p.
7. Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М., Добрица В.П. Атлас ультраструктуры микро-биоты кишечника человека. СПб: ИИЦ ВМА, 2008, 112с.
8. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии / Под ред. А.С. Быкова, А.А. Воробьёва, В.В. Зверева. М.: Медицинское информационное агентство, 2008, с.13-269
SUMMARY
To the question of ultrastructure of "uncultivated" pathogens in acute intestinal infections F.E. Sadyhova1, E.K. Kasimov2, E.A. Dadashev1, F.G.Rzayev2
Azerbaijan State Institute Improvement of doctors named after A.Aliyev1; Azerbaijan Medical University2' Baku The article presents data on the remediation of "uncultivated" pathogens from fecal samples from patients with OCD under the influence of bacteriophages with the study of the ultrastructure of detected pathogens by electron microscopy. Along with the known pathogens, a number of microorganisms that have not been studied in the present have been identified.
_Поступила: 21.02.2017
Скоростные показатели кровотока и индекс резистентности в магистральных сосудах больных с наличием и отсутствием сахарного диабета и при сочетании сахарного диабета с метаболическим синдромом
Р.А.Рзаева, Я.З.Курбанов, Д.В.Гаджиев
Азербайджанский медицинский университет, г. Баку
Как сахарный диабет (СД), так и метаболический синдром (МС), включающий гипергликемию в комплекс собственных проявлений, являются весьма распространенными заболеваниями [1,2,3,4], а при их сочетании резко увеличиваются проявления сердечнососудистой патологии [5,6,7,8].
В последние годы ультразвуковое исследование сосудов занимает ведущую позицию в оценке состояния сосудистого русла при различных патологических состояниях, при этом одним из основных ранних проявлений атеросклеротического поражения сосу-дов,наряду с обнаружением внутрисосуди-стых бляшек и утолщением интима-медиального слоя, относится снижение эластических свойств (или повышение жесткости) сосудистых стенок, которое на ранних стадиях атеросклероза может быть единствен-
ным предвестником изменения сосудистых стенок атеросклеротического генеза [9,10,11,12,13,14, 15,16].
В свою очередь, снижение эластичности сосудов играет важную роль в развитии и становлении артериальной гипертензии (АГ), развитии основных сосудистых осложнений вследствие гипергликемии, нарушений ли-пидного обмена, составляющих основу МС [17,18].
С этих позиций особенно привлекает внимание изучение состояния магистральных сосудов периферического русла при сочетании СД 2 типа (СД-2) с МС, отражающих состояние периферического кровообращения - скоростных показателей кровотока по магистральным сосудам в сопоставлении с индексом резистентности (ИР) потока крови, косвенно
