CC BY
18
Кроме того, поскольку функция у имеет асимптотический характер распределения, ее можно представить в следующем виде:
у = а0 -г Ьу,х-х + а (х),
где а — ошибка средней sy с, умноженной на коэффициент t. Приняв условие, что при эффекте у-*- 0 будет взято число t с вероятностью 99% (при f — п — 2, где п — число животных в эксперименте), можно получить значение пороговой концентрации, т. е. timeji(Limac — при изучении верхних параметров токсичности):
а0 ■ Syx ' ¿99
Umac = х0 — /«о =-т,-' (")
у~> О °у/х
Верхняя граница эффекта (у-*■ 1,0) может быть определена по формуле: v , _ , 1 ~ °о + syx ■ t9t
х, -г "»¡'<99 = Л • (12)
Соответствующие расчеты содержатся в табл. 1.
Таким образом, метод двумерной корреляции и регрессии имеет несомненные преимущества перед традиционно применяемыми методами графического и пробит-анализа при оценке изолированного действия ядов, но главное его преимущество — возможность подхода к оценке их комбинированного действия.
ЛИТЕРАТУРА. Бройтман А. Я. — В кн.: Вопросы общей промышлен ной токсикологии. Л.. 1963, с. 9—16. — Кустов В. В., Т и у н о в Л. А., В а с и л ь ев Г. А. Комбинированное действие промышленных ядов. М., 1975, с. 101. — На горный П. А. — Гиг. и сан., 1973, № 7, с. 76—82. — Нагорный П. А. Матема тический анализ при токсикологической расшифровке комплекса летучих веществ, выделя ющихся в воздух из высокомолекулярных соединений (Метод, указания по применению) Киев, 1975.
Поступила 26/IV 1977 г
УДК 615.9.07:612.825.»
Е. С. Балынина, Л. А. Тимофигвская
К ВОПРОСУ ПРИМЕНЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПОВЕДЕНЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ В ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
Научно-исследовательский институт гигиены труда и профзаболеваний АМН СССР,
Москва
Исходя из актуальности применения новых методик в токсикологическом эксперименте для стандартизации исследований и необходимости более широкого использования поведенческих реакций в качестве интегральных показателей, основной задачей работы мы поставили сравнение двигательной активности (ДА) и эмоциональной реактивности (ЭР) у мышей БЫК1 с помощью трех методов: метода «открытого поля», «норкового рефлекса» и подсчета вертикальных вставаний в банке (определение так называемого вертикального компонента исследовательского поведения животных) с точки зрения информативности, чувствительности и экономичности. Были оценены физиологические колебания указанных показателей в зависимости от времени суток и пола у интактных животных и определен
коэффициент вариации = характеризующий вариабельность
признака, категорию и биологическую значимость показателя. Полагаем,
1 Под символом БНК Центральным питомником АМН СССР в 1972 г. выделен и ут»-вержден генетический стандарт белых мышей (Генетика, 1972, № 11, с. 76—82).
х-*
Рис. 1. Оборудование для исследования ДА и ЭР.
а — банка для определения вертикальных вставаний животных; б — открытая площадка для учета «норкового рефлекса»; в — установка «открытого поля»; 1 — манеж для животных; 2 — зеркальный отражатель; 3 — лампа накаливания; 4 — передвижной кронштейн; 5 — передвижная стойка-держатель.
Рис. 2. Изменения ДА и ЭР у интактных мышей что ДЛЯ трактовки изменений БНК в зависимости от времени суток и пола при воздействии химических (/ — У самок, // — у самцов).
гпрлинрний ^пппмишлрнниу По оск абсцисс — время суток (в ч); по оси ординат —
соединении ^промышленных ДА (1_4) и эр а _ ¿анка. б _ „„0рК0вый Реф-
ЯДОВ) недостаточно наличия леке»; в — «открытое поле». 1—3. 5—7 — изменения ДА _____________ „„„_„„„.„,г. и ЭР весной: 4, 8 — изменения ДА и ЭР осенью.
достоверных отклонении от контроля, необходимо также
знание меры значительности этих отклонений. Для оценки выявленных изменений с точки зрения гигиенической значимости и определения вредного действия важны данные об уровне физиологических колебаний показателей, в том числе поведенческих реакций (И. В. Саноцкий и соавт.; И. В. Саноцкий и И. П. Уланова).
Предлагаемые методы физиологичны и позволяют применять их в естественных условиях. Учитывая практические задачи серийных токсикологических исследований, изучение поведенческих показателей ограничили двумя параметрами: ориентировочно — исследовательской реакцией (двигательный компонент) и ЭР (вегетативная реакция дефекации по числу фекальных шариков). Традиционное определение ориентировочной реакции путем подсчета числа вставаний белых крыс в стеклянной банке за 1 мин было заменено для мышей подсчетом вставаний в специальной банке из органического стекла с подобранными для этой цели оптимальными размерами. Общий вид и размеры использованного оборудования представлены на рис. 1. Кроме того, была применена методика определения ориентировочной реакции Во1з51ег и соавт., основанная на использовании «норкового рефлекса» грызунов с регистрацией числа раз заглядывания мышей в отверстия площадки за 3 мин с учетом ЭР по числу фекальных шариков за время опыта. Специфичность и чувствительность указанного метода до-
казаны ранее для крыс при изучении нейротоксического действия фталатов и карборана (Е. С. Балынина и И. В. Березовская). С целью сравнения с указанными методами был применен метод «открытого поля» (Hall). Д. А. Кулагин с успехом использовал «открытое поле» для изучения поведения крыс разных линий. Модификация этого метода на мышах для целей токсикологического эксперимента разработана в лаборатории общей токсикологии (1977). Методика основана на использовании манежа, находящегося в затемненном помещении. Исследование проводят в течение 2 мин в одно и то же время суток при постоянной освещенности манежа лампой 500 Вт с зеркальным отражателем. Визуально просчитывают число пересеченных 4 лапами квадратов при спонтанном перемещении животного и вычисляют длину пробега: l = k-n, где / — длина пробега (в м); k — коэффициент пересчета 0,15 (по расчету исходя из размера и числа квадратов); п — число пересеченных при движении животного квадратов (размер каждого 20 X 20 см).
Длина пробега характеризует ДА животных. Одновременно при обследовании учитывают реакцию дефекации по числу фекальных шариков, которую расценивают как ЭР животных. Для проведения исследования необходимы тишина и изоляция от посторонних раздражителей, учет суточных биоритмов, половой чувствительности и сезонных изменений показателей.
Исследования проведены весной на 1530 интактных белых мышах обоего пола массой 22—24 г с учетом изменений показателей в 10, 12, 14 и 16 ч. Группы состояли из 40 животных (достаточно п= 10). Методом «открытого поля» проводили наблюдения весной и осенью. Кроме того, оценивали токсическое действие химических соединений на примере дибутилфта-лата (ДБФ) и диоктилфталата (ДОФ) и карборана при введении их в желудок в дозах, равных Limac по интегральным показателям, а также в диапазоне V5—VÄ0 Limac.
Изменения ДА и ЭР у интактных белых мышей SHK в зависимости от времени суток и пола животных показаны на рис. 2. В результате проведенного эксперимента в сравнительном плане тремя методами установлено, что ДА у самок выше, чем у самцов, во все сроки исследования. Наибольшая активность у мышей обоего пола отмечена в 10 и 16 ч. Известно, что большинство физиологических процессов на протяжении суток имеет тенденцию активизироваться в утренние часы и тормозиться ночью. В литературе описано более 100 физиологических функций, имеющих суточную периодичность (Л. И. Куприянович), к ним относится и ДА. Показатель ЭР, устанавливаемый с помощью методов вертикального вставания и «открытого поля», малоинформативен (V соответственно 86—87,5 и 61,0— 70,2%). В связи с большой вариабельностью этого признака мы полагаем, что он непригоден для токсикологического эксперимента, проводимого с помощью этих методов (3-я категория, малоинформативные показатели). Ценность концепции эмоциональности вызывает обоснованные сомнения (Р. Хайнд). В то же время с помощью «открытого поля» установлены достоверные половые и сезонные различия ЭР (см. таблицу).
ЭР у самцов выше, чем у самок, что согласуется с данными наблюдений за крысами (Д. А. Кулагин; П. Л. Бродхэрст; Hall). Коэффициент вариации V равен весной у самок 36,6%, у самцов 39,3%, а осенью — соответственно 44,6 и 51,2%, т. е. ЭР при этом методе выявляется как пластичный показатель (2-я категория по классификации В. О. Шефтеля и Р. Е. Совы), который может быть рекомендован к использованию в токсикологических исследованиях. Из литературы известно, что самый высокий уровень обменных процессов отмечается в весеннее время, в период усиления половой активности; описано более 50 физиологических процессов, характеризующихся сезонной периодичностью (А. П. Голиков и П. П. Голиков). С помощью метода «открытого поля» нами также отмечено повышение двигательной активности у самцов весной (особенно в 10 и 16 ч) и усн-
Колебания показателей ДА и ЭР у интактных мышей 5НК
Банка* «Открытая площадка» («норковый рефлекс») •• «Открытое поле»***
Время измерения, мин Сезон года Количество самок » самцов Средние показатели за день 1 Весна 400 160 ДА | ЭР 3 Весна 160 160 ДА | ЭР 2 Весна 160 160 ДА | ЭР Осень 190 140 ДА 1 ЭР
Самки
0=1 0=1,5 о=2 V 12,46^0,59 3,8 5,7 7,6 31,3 0,93^:0,13 0,8 1.2 1,6 86,0 22.65^0,8 5,0 7,5 10,0 22,1 1,71±0,22 1.2 1,8 2,4 70,2 4,12*0,16 0,96 1,44 1,92 20,8 1,61*0,1 0.6 0,9 1.2 36.6 4,94*0,21 1.3 1.9 2,6 26,3 0,56*0,04 0,25 0,37 0,5 44,6
Самцы
М—т 0=1 о=1,5 о=2 V 9,95^0,49 3,15 4,72 6,3 31,6 0,8±0,11 0.7 1,05 1.4 87,5 18,97±1,19 7,5 11,2 15,0 39,5 2.13*0,21 1.3 1.9 2.6 61,0 3,57*0,16 1.0 1.5 2.0 28,0 1,78*0,11 0,7 1,05 1.4 39.3 3,09*0,1 0,63 0,94 1,26 20,4 1,17*0,1 0,6 0,9 1.2 51,2
Подсчет числа вертикальных вставаний (ДА) и фекал ьных шариков (ЭР). •• Учет числа заглядываний в отверстия. ••• Определение длины пробега в метрах.
ление эмоциональной реактивности у животных обоего пола весной пег сравнению с осенью (см. рис. 2). ДА возрастает весной только у самцов,, у самок же в разные сезоны года она отличается большей стабильностью.
Информативность и чувствительность метода «открытого поля» оценивали на примере воздействия 2 фталатов и карборана. Ранее было выявлено выраженное избирательное нейротоксическое действие указанных ядов. В наших экспериментах Limac при введении фталатов в желудок мышам составил по СПП для ДБФ 500 мг/кг, для ДОФ 940 мг/кг, для карборана 450 мг/кг. Достоверные изменения ДА и ЭР, установленные методом «открытого поля», обнаружены при дозах в 10—20 раз ниже тех, при которых отмечены изменения СПП. Limac, рассчитанный с помощью метода «открытого поля» составил для ДБФ 26 мг/кг, для ДОФ 47 мг/кг, для карборана 23 мг/кг, а недействующие дозы — соответственно 10, 19 и 9 мг/кг.. Установленные пороги острого действия свидетельствуют о выраженном нейротоксическом действии рассмотренных веществ, а также о высокой чувствительности метода «открытого поля» и целесообразности определения поведенческих реакций в токсикологических исследованиях.
При современном уровне знания в связи со сложностью поведения животных как предмета исследования применение поведенческих реакций в токсикологии целесообразно ограничивать узкими задачами. Необходимо развивать и совершенствовать биометрический подход в изучении поведенческих реакций при токсикологических экспериментах прежде всего в методическом плане.
Нейрофизиологический механизм поведенческих реакций (общих целостных установочных реакций, специфической деятельности целого организма) позволяет понять важность их использования в первую очередь как интегральных показателей в токсикологических исследованиях, а при выраженном нейротропном действии — и как чувствительных специфических тестов.
Выводы
1. Установлена высокая чувствительность показателя ДА у мышей при помощи реакции вертикального вставания, «норкового рефлекса» и метода «открытого поля». Показатель ЭР может быть рекомендован для использования при исследовании только с помощью метода «открытого поля».
2. Установлены изменения поведенческих реакций у интактных животных в зависимости от пола и суточных биоритмов: у самок мышей ДА выше, а ЭР ниже, чем у самцов.
3. В качестве экспрессного метода исследования ДА мышей рекомендуется реакция вертикального вставания в банке. Полученные данные могут служить объективными показателями состояния животных.
ЛИТЕРАТУРА. Балынина Е. С., Березовская И. В. — Фар-макол. и токсикол., 1976, № 5, с. 635. — Бродхэрст П. Л. — В кн.: Актуальные проблемы генетики поведения. Л., 1975, с. 39. — Г о л и к о в А. П., Г о л и к о в П. П. Сезонные биоритмы в физиологии и патологии. М., 1973, с. 15, 144. — Кулаги н Д. А. — В кн.: Генетика поведения. Л., 1969, с. 35. — К у л а г и н Д. А. — В кн.: Научное совещание и симпозиум по эволюционной физиологии. 6-е. Труды. Л., 1972, с. 118. — К у п р и я н о в и ч Л. И. Биологические ритмы и сон. М., 1976, с. 23. — Саноцкий И. В. и др. Методы определения токсичности и опасности химических веществ. М., 1970, с. 21, 23. — С а н о ц к и й И. В., Уланова И. П. Критерии вредности в гигиене и токсикологии при оценке опасности химических соединений. М., 1975, с. 19. — X а й н д Р. — В кн.: Поведение животных. М., 1975, с. 568. - Шеф-тел ь В. О., Сова Р. Е. — В кн.: Применение математических методов для оценки и прогнозирования реальной опасности накопления пестицидов во внешней среде и организме. Киев, 1976. с. 37. — В о i s s i e г J. R., S i m on P.. Lwoff J.M.- Thérapie, 1964, v. 19, p. 571. — H a 1 1 C. S. — J. сотр. Psvchol., 1934, v. 17, p. 89.
Поступила 29/VII 1977 г.
