CC BY
81
ТОРФОВЕДЕНИЕ
УДК 543. 5
Л. В. Нечаев, О. Н. Чайковская, И. В. Соколова
К ВОПРОСУ О ВОЗДЕЙСТВИИ ИЗЛУЧЕНИЯ НА АНТИОКСИДАНТНУю АКТИВНОСТЬ
гуминовых кислот верхового торфяника васюганского болота1
Приведены результаты исследования антирадикальной и антиоксидантной активности гуминовых кислот (ГК) верхового торфяника Васюганского болота с помощью хемилюминесцентного метода. Показано, что гу-миновые кислоты обладают антирадикальной активностью. Под действием ультрафиолета антирадикальная активность ГК увеличивается, в то время как солнечное излучение мало влияет на антирадикальную активность образца.
Ключевые слова: гуминовые кислоты, антирадикальная активность, антиоксидантная активность, хе-милюминесценция, солнечное излучение, УФ-излучение.
Введение
Гуминовые кислоты (ГК) - органические соединения, широко распространенные в окружающей природе. Их роль в биосфере трудно переоценить. Эти соединения являются не только источником питания растений, но и регулируют важнейшие физико-химические и биологические свойства почвы, обеспечивая благоприятный водно-воздушный режим. В целом можно сказать, что ГК регулируют устойчивость экосистем.
Важнейшим свойством ГК является их биологическая активность. В научной литературе неоднократно отмечалось положительное влияние этих веществ на рост и развитие растений, повышение резистентности лабораторных животных к некоторым заболеваниям при использовании ГК в качестве пищевой добавки. Один из первых медицинских препаратов на основе ГК, зарегистрированных в России, - «Гумизоль» (0.01 %-ный раствор ГК в изотоническом растворе хлорида натрия) - рекомендовано применять при различных воспалительных процессах. В то же время появляются работы, в которых утверждается, что ГК приводят к окислительному стрессу живых организмов [1, с. 98; 2, с. 1828; 3, с. 100; 4, с. 41].
Окислительный стресс чаще всего обусловлен избыточным содержанием активных форм кислорода (АФК), которые инициируют цепные радикальные процессы окисления белков, липидов и других компонентов клетки. С окислительным стрессом связывают патогенез таких заболеваний, как атеросклероз и болезнь Альцгеймера. Антиоксиданты
прерывают эти быстрорастущие процессы, образуя малоактивные радикалы, легко выводящиеся из организма. Таким образом, можно говорить об антирадикальной активности антиоксидантов. Исследование антиоксидантов приобретает все большее значение для современной медицины.
В современной литературе широко представлены работы по исследованию различных свойств ГК, в основном их физиологического действия на растительные и животные организмы. Что касается антиоксидантной активности, результаты соответствующих исследований только начинают появляться, к тому же они весьма противоречивы. Это обусловлено различием применяемых методик определения антиоксидантной активности, а также природой индивидуальных образцов ГК. В работе [5, с. 147] изучено влияние типа торфа, способа выделения и концентрации ГК на электрохимическое поведение кислорода и определена суммарная антиоксидантная активность ГК. Показано, что все исследованные гуминовые препараты обладают антиоксидантной активностью, которая зависит от исходного типа торфа и способа выделения ГК. Отмечено, что высокие значения показателя АОА наблюдаются у кислот, полученных щелочным гидролизом, а кислотная обработка приводит к снижению их активности. Образцы, характеризующиеся большей полидисперсностью, отличаются меньшими изменениями показателя АОА. В то же время для образцов со значительной долей низкомолекулярной фракции отмечены высокие значения показателя антиоксидантной активности.
1 Работа выполнена при финансовой поддержке проекта ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (госконтракт № П1128 в рамках реализации мероприятия 1.2 . 1) и гранта Президента РФ на поддержку ведущей научной школы (№ НШ-4297 .2010 .2) на базе научно-образовательного центра Томского государственного университета «Квантовая химия, спектроскопия и фотоника наноматериалов», а также госконтракта № 02 .740 .11.0325 .
В работе [6] проведен сравнительный анализ суммарной антиоксидантной активности препаратов ГК торфа и ГФК Aldrich с помощью вольтамперомет-рического метода. Образцы ГК и ГФК облучали ультрафиолетовым светом и лампой, моделирующей солнечное излучение. Вольтамперометрический метод показал незначительное увеличение антиоксидантной активности ГК торфа в процессе облучения ультрафиолетовым светом. В то же время при облучении лампой, моделирующей солнечное излучение, антиоксидантная активность ГК торфа уменьшается.
В связи со сказанным выше представляется очевидной актуальность определения антиоксидан-тных и антирадикальных свойств ГК. Целью данной работы является качественная оценка антирадикальной активности ГК. Особый интерес для исследователей представляет установление зависимости антирадикальной активности ГК от длины волны облучения при возбуждении ультрафиолетовым и видимым светом. Оценка антирадикальной активности ГК до и после облучения будет способствовать лучшему пониманию роли этих веществ в живой природе, а также позволит сделать некоторые выводы об изменении структуры этих соединений.
Объекты и методы исследования
В качестве объектов исследования использовали ГК, выделенные из верхового сфагнового торфа месторождения «Темное» Томской области со степенью разложения R 5 %. Образец ГК предоставлен сотрудниками Института химии нефти СО РАН
Н. В. Юдиной и Е. В. Мальцевой. Гуминовые вещества извлекали из торфа экстракцией G.1 н. раствором NaOH. Из полученного экстракта ГК осаждались подкислением HCl до рН 2. Осадок отделяли центрифугированием, промывали дистиллированной водой и высушивали. Рабочая концентрация ГК в растворах составляла 1 * 1G-3 г*л-1 при рН = 1G ^ 11. Облучение 5G мл раствора G.G1 г/л ГК проводили в стакане в течение 2.32 мин КгС1*-экс-илампой с длиной волны излучения ~ 222 нм при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Технические характеристики импульсной экс-иплексной лампы барьерного разряда на рабочих молекулах KrCl*: длина волны излучения 1изл « 222 нм, Dl = 5-1G нм, пиковая мощность излучения = 18 мВт*см-2, f = 2GG кГц, длительность импульса 1 мкс. Расстояние от лампы до раствора h = 8.5 см. Технические характеристики лампы «Solar»: Хизл, 3GG-SGG нм, W^ до 16G мВт-см-2.
В работе был использован люминол фирмы «Aldrich». Хемилюминесценцию люминола наблюдали на спектрофлуориметре «Cary Eclipse» («Var-ian», Австралия) в режимах «Хемилюминесцен-ция» и «Кинетика». Подробная методика определения антирадикальной активности гуминовых кислот приведена ниже.
1. Был приготовлен водно-щелочной раствор
3 мМ люминола с концентрацией 0.3 М NaOH. 2. Для приготовления 3 мл рабочего раствора взяли 0.1 мл этого раствора, добавили 2.88 мл буфера (тетраборат натрия, pH = 9.16), 10 мкл раствора
0.5 г/л фталоцианина (катализатор) и 10 мкл 0.1 М Н2О2. 3. После тщательного перемешивания кварцевая кювета (I = 1 см) с раствором была помещена в кюветное отделение с термостатом (t = 25 °С). После этого добавляли в кювету 10 мкл ГК из раствора с концентрацией 0.01 г/л. 4. Были получены спектры хемилюминесценции люминола, кинетики реакции на длине волны 425 нм до и после добавления растворов ГК. Проводили несколько подобных процедур для необлученного препарата ГК и для ГК, облученных в течение 2, 8, 16 и 32 мин.
Результаты и обсуждение
Антирадикальная активность ГК оценивалась по изменению интенсивности хемилюминесценции в реакции окисления люминола перекисью водорода. Интенсивность хемилюминесценции люминола заметно уменьшается уже в присутствии необлу-ченных образцов ГК. На рис. 1 приведены зависимости интенсивности хемилюминесценции люми-нола от времени облучения ГК. При добавлении необлученного раствора ГК в систему с люмино-лом наблюдается снижение пиковой интенсивности хемилюминесценции. Характерно закономерное уменьшение интенсивности хемилюминесценции при добавлении ГК, облученных в течение 2, 8 и 16 мин. Добавление в систему с люминолом ГК, облученных в течение 32 мин (рис. 1) приводит к дальнейшему уменьшению интенсивности свечения.
I
max
140 -,
120 -100 -806040200-
0 2 8 16 32
Время облучения, мин
Рис . 1. Изменение интенсивности хемилюминесценции люминола в максимуме полосы хемилюминесценции на длине волны 425 нм в присутствии ГК, облученных KrCl эксилампой и лампой «Solar» в течение 0-32 мин
Кинетика хемилюминесценции при реакции окисления люминола, инициированной добавлени-
— 1GS —
ем Н2О2, описывается многоэкспоненциальной зависимостью. Общий вид кинетики хемилюминесцен-ции люминола, активированной перекисью водорода, представлен на рис. 2. В ходе реакции окисления люминола наблюдается спад интенсивности хеми-люминесценции, который можно разделить на две компоненты. Первая компонента представляет быстрое затухание с длительностью 0.3 мин, вторая -медленное затухание с длительностью 2.3 мин.
При добавлении ГК длительность свечения второй компоненты изменяется. Из литературы [7, с. 358] известно, что это может характеризовать ан-тирадикальную активность вещества. При добавлении в систему с люминолом необлученной ГК длительность второй компоненты свечения уменьшается, следовательно, необлученная ГК обладает незначительной антирадикальной активностью. Однако облученный ультрафиолетом препарат ГК способствует увеличению длительности свечения второй компоненты, таким образом, антирадикальная активность ГК при облучении лампой KrCl возрастает. Этого не происходит при облучении лампой «Solar». В последнем случае длительность второй компоненты свечения не превышает соответствующую величину для необлученного препарата ГК.
0 ~1--1-------------1-'-1-----------1-1-1-1------■-1-1
0 1 2 3 4 5
время, мин
Рис. 2 . Изменение интенсивности хемилюминесценции люминола в зависимости от времени на длине волны 425 нм
Схема реакций, протекающих в системе с люминолом, еще далека от полного понимания, однако на основании литературных данных ее можно представить следующим образом. Инициатором окисления в данной модельной системе предположительно являются гидроксильные радикалы,
образующиеся при взаимодействии фталоцианина и пероксида водорода. Окисление люминола сопровождается образованием радикала люминола и в конечном счете приводит к образованию возбужденного продукта окисления, который переходит в основное состояние с высвечиванием кванта света хемилюминесценции. Количество выделившихся
квантов света хемилюминесценции пропорционально количеству образовавшегося продукта окисления и, следовательно, является мерой степени окисленности люминола. Добавление в данную модельную систему веществ, способных препятствовать окислению люминола (антиоксидантов), будет приводить к уменьшению количества квантов света хемилюминесценции. Из литературных данных известно, что тушение хемилюминесценции обусловлено взаимодействием ингибиторов не столько с радикалами-инициаторами, которые образуются при запуске реакций модельной системы, сколько с радикалами, образующимися в последующих реакциях окисления люминола. В качестве одного из них следует назвать супероксидный анион-радикал О2, который является промежуточным продуктом в реакции свободнорадикального окисления люминола. Одним из аргументов в пользу такого предположения является тот факт, что введение в модельную систему соответствующих реагентов вызывало уменьшение амплитуды хемилю-минесценции без существенного изменения длительности латентного периода. Факт появления второй компоненты свечения свидетельствует об образовании промежуточного люминесцирующего интермедиата, природа которого, однако, пока не ясна. Механизм хемилюминесценции этого продукта может отличаться от соответствующего механизма для люминола. Возможно образование нестабильных комплексов, распад которых сопровождается свечением. Таким образом, механизмы происходящих процессов оказываются весьма сложными и требуют дальнейшего исследования.
Согласно литературным данным [8, с. 22; 9, с. 54; 10], гуминовые кислоты обладают парамагнитными свойствами, что указывает на присутствие в их структуре неспаренных электронов. Этот факт можно объяснить присутствием в макромолекулах гуминовых кислот хинонных фрагментов. Присутствие в структуре ГК хинонных фрагментов обусловливает их взаимодействие со свободными радикалами реакции хемилюминесценции люминола, т. е. антирадикальную активность нео-блученных препаратов ГК. При облучении гумино-вых кислот происходят процессы фотоокисления и фотодеструкции. Фотодеструкция полиароматиче-ского ядра гуминовых кислот в начальной стадии приводит к образованию большого количества радикальных фрагментов. Это объясняет незначительное увеличение антирадикальной и антиокси-дантной активности гуминовых кислот при облучении лампой «Solar» в течение 2 и 8 мин. Хеми-люминесценция люминола (или его производного) сопровождается процессами дезактивации и тушения возбужденного состояния молекулярным кислородом. В присутствии гуминовой кислоты воз-
можен перенос энергии возбуждения люминола (или его производного) на молекулы ГК с последующей флуоресценцией. Кроме того, возможно поглощение гуминовой кислотой квантов света хеми-люминесценции и переход в возбужденное состояние. В некоторых работах указано на возможность хемилюминесценции ГК при фотоокислении. Механизмы реакций, происходящих в хемилюминес-центной системе при добавлении облученных ГК, конечно, являются очень сложными.
В общем, можно сказать, что хемилюминесцен-тный метод позволяет оценить взаимодействие гуминовых веществ с активными формами кислорода, пероксида водорода и окисленными формами люминола.
Заключение
В ходе проведенной работы показано, что нео-блученный образец ГК обладает антирадикальной активностью. Это можно объяснить активным взаимодействием макромолекул ГК со свободными радикалами, участвующими в реакции хемилюминесценции люминола. Взаимодействие ГК со свободными радикалами обусловлено наличием в их макромолекулах хинонных структур. Антиоксидантную активность ГК в щелочной среде связывают с присутствием в их структуре радикалов семи-хинонного типа. Под действием ультрафиолета ан-тирадикальная активность ГК увеличивается, в то время как солнечное излучение мало влияет на ан-тирадикальную активность образца.
Список литературы
1. Chiung-Wen Hu et al . Oxidatively damaged DNA induced by humic acid and arsenic in maternal and neonatal mice // Chemosphere . 2010 . V. 79 . P. 93-99 .
2 . Hsin-Ling Yang et al . Humic acid induces apoptosis in human premyelocytic leukemia HL-60 cells // Life Sciences . 2004. V. 75 . P. 1817-1831.
3 . Shufan Qi, Gertjan J . M . den Hartog, Aalt Bast. Damage to lung epithelial cells and lining fluid antioxidant defence by humic acid // Environmen-
tal Toxicol . and Pharmac . 2008. V. 26 . P. 96-101.
4 . You-Cheng Hseu et al . Humic acid induces apoptosis in human endothelial cells // Toxicol . and Appl . Pharmac . 2002 . V. 182 . P. 34-43.
5 . Короткова Е . И . Вольтамперометрический метод определения суммарной активности антиоксидантов в объектах искусственного и
природного происхождения: дис .. . . д-ра хим . наук. Томск, 2009 . 383 с .
6 . Юдина Н . В ., Чайковская О . Н . , Соколова И . В . и др . Окислительно-восстановительные свойства и антирадикальная активность
гуминовых кислот при воздействии УФ и видимым излучением // Журнал прикладной химии . (В печати .)
7 . Владимиров Ю . А. , Проскурнина Е . В . Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция // Успехи биол . химии . 2009 . Т . 49 . С . 341-
388
8 . Перминова И . В . Анализ, классификация и прогноз свойств гумусовых кислот: дис.. . . д-ра хим . наук. М . , 2000 . 359 с.
9 . Чуков С . Н . Структурно-функциональные параметры органического вещества почв в условиях антропогенного воздействия . СПб . : Изд-
во СПб. ун-та, 2001.216 с.
10 . Соколова И . В ., Чайковская О . Н . Влияние гуминовых кислот на фотопроцессы в водных средах // Вестн . Томского гос . пед . ун-та . 2008 .
Вып . 4(78) . С . 42-45.
Нечаев Л. В., аспирант.
Томский государственный университет.
Пр. Ленина, 36, г. Томск, Томская область, Россия, 634050. E-mail: lvnechaev@rambler.ru
Чайковская О. Н., доктор физико-математических наук, ведущий научный сотрудник. Томский государственный университет.
Пр. Ленина, 36, г. Томск, Томская область, Россия, 634050.
E-mail: tchon@phys.tsu.ru
Соколова И. В., доктор физико-математических наук, главный научный сотрудник.
Томский государственный университет.
Пр. Ленина, 36, г. Томск, Томская область, Россия, 634050.
E-mail: sokolova@phys.tsu.ru
Материал поступил в редакцию 03.12.2010.
— 11G —
L. V. Nechaev, O. N. Chaykovskaya, I. V. Sokolova
THE EFFECT oF IRRADIATioN on ANTioxiDANT ACTiviTY oF HuMIC ACIDs
from vasugan bog’s high-moor peat
In this paper there were presented the results of study effect of irradiation on antioxidant activity of humic acids from Vasugan bog’s hight-moor peat by chemiluminescence method. It was showed the antiradical activity of humic
acids. The antiradical activity increased after UV-irradiation. The sun irradiation was feebly influenced on antiradical
activity of humic acids.
Key words: humic acids, antiradical activity, antioxidant activity, chemiluminescence, sun irradiation, UV-irradiatioin.
Nechaev L. V Tomsk State University.
Pr. Lenina, 36, Tomsk, Tomsk region, Russia, 634050.
E-mail: lvnechaev@rambler.ru
Chaykovskaya O. N.
Tomsk State University.
Pr. Lenina, 36, Tomsk, Tomsk region, Russia, 634050.
E-mail: tchon@phys.tsu.ru
Sokolova I. V Tomsk State University.
Pr. Lenina, 36, Tomsk, Tomsk region, Russia, 634050.
E-mail: sokolova@phys.tsu.ru
