CC BY
49
9. Фельлблюм И.В. Оценка реактогенности и иммуноген-ности отечественной комбинированной вакцины Бубо-М при иммунизации взрослых против лифтерии, столбняка и вирусного гепатита В / И.В. Фельлблюм, Н.Н. Воробьева, А.М. Николаева и лр. // Журнал микробиологии, эпилемиологии и иммунобиологии. 2001. <5. С. 27 - 30.
10. Фельлблюм И.В. Реактогенность и иммуногенность отечественной комбинированной вакцины Бубо-М при иммунизации летей против лифтерии, столбняка и вирусного гепатита В / И.В. Фельлблюм, Н.Н. Воробьева, В.Н. Борисова и
лр. // Журнал микробиологии, эпилемиологии и иммунобиологии. 2001. < 6. С. 50 - 52.
11. Филатов Н.Н. Экономическая эффективность вакцинопро-филактики гепатита В в условиях Москвы / Н.Н. Филатов, И.Н. Лыткина, И.Л. Шаханина и лр. // Эпилемиология и инфекционные болезни. 2004. <5. С. 14 - 18.
12. Фролов В.М. Влияние экологически врелных факторов крупного промышленного региона на иммунологическую реактивность населения / В.М. Фролов, Н.А. Пересалин, А.М. Петруня // Журнал микробиологии, эпилемиологии и иммунобиологии. 1995. < 2. С. 119 - 122.
К вопросу о создании живой коревой вакцины на линиях перевиваемых клеток
Л.Л. Миронова, В.Д. Попова, О.И. Конюшко
ГУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН», Москва
настоящего времени сохраняется актуальность проблемы вакцинопрофилактики кори, так как заболеваемость этой инфекцией по-прежнему высокая. За последнее время резко возросла смертность от кори в развивающихся странах, а в Европе отмечается «повзросление» этой инфекции [1]. В связи с этим Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) поставила задачу снижения смертности от данного заболевания на 95%, а заболеваемости - на 90% по сравнению с 1997 годом - началом программы массовой вакцинации против нее [2]. В 1998 году ВОЗ опубликовала проект единой номенклатуры для систематизации диких штаммов вируса кори и описание их генотипов [3]. Это способствует активному эпидемиологическому надзору за заболеваемостью корью.
В нашем Институте с 1964 года ведутся исследования по созданию живой коревой вакцины на линии перевиваемых клеток. Дело в том, что специфика технологии получения противовирусных вакцин характеризуется большой изменчивостью ее основных параметров и их сложной взаимосвязью, что влияет на качество конечной продукции. Источниками вариабельности могут быть колебания качества исходных материалов для получения культур клеток, изменчивость вакцинных штаммов вируса, колебания режимных параметров, основных процессов технологии, влияние вспомогательных процессов и качества используемых материалов (питательные среды, вода, стеклянная посуда, резиновые пробки, технология, обработка этих материалов и т. д.) [3, 4]. Слож-
ность указанных процессов и их взаимосвязи обуславливает необходимость тщательной разработки каждого этапа технологии и оптимизации всех звеньев получения и испытания на безопасность вакцинных препаратов. Это включает подготовку исходных материалов, контроль их качества, оптимизацию технологических процессов получения конечного продукта. Важно также испытание его эффективности в лабораторных экспериментах и контролируемых эпидемиологических опытах.
В связи с тем, что живая коревая вакцина (ЖКВ) не была традиционным препаратом для нашего Института, проводились факультативные исследования, которые имели несколько практических выходов: в 1965 -
1966 годах была создана эффективная вакцина на первичных культурах клеток почек зеленых мартышек [6, 7]. В качестве вакцинного вируса был использован вариант штамма «Эдмонстон-Эдмонстон-Шварц» [8]. Впоследствии после проведенной селекции и клонирования этот штамм был обозначен «Эдмонстон-Шварц-Чумаков» (ЭШЧ) [9]. В результате было изготовлено 166 серий сухой живой коревой вакцины с высокими титрами от 4,90 до 5,50 !§ БОЕ/мл [10]. Иммунизация коревой вакциной была проведена в РСФСР, Украинской, Узбекской, Латвийской и Эстонской ССР, в Венгрии, на Кубе и в других странах. Например, в Украине было успешно привито 2,5 млн. человек [7], в Узбекской ССР 1 150 657 [11]. Общее число привитых составило 8,7 млн. человек [10].
Высокая реактогенность отмечалась у 0,7 - 1,8% привитых. При изучении 2931 парной сыворотки де-
[Эпидемиология и Вакиинопрофилактика 24 (23)/2 0 05
Эпидемиология и Вакиинопрофилактика <4 (23)/2 0 0 5
тей, не имевших антител к вирусу кори до иммунизации, сероконверсия наблюдалась в 98,1% с титром антител 1:174, что превышало защитный уровень антител против кори примерно в 3 раза [10, 12 - 14].
Позднее ЖКВ была изготовлена на первичных культурах клеток почек эмбрионов и новорожденных овец. Вакцина без осложнений была применена для иммунизации детей в Румынии [15, 16].
Последние серии ЖКВ были получены при размножении штамма ЭШЧ вируса кори в линии диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека М-22, прошедшей национальное лицензирование в качестве вакцинного субстрата, пригодного для получения любого вида медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) [17, 18].
Целью данной работы является освещение результатов исследований, связанных с разработкой эффективной и воспроизводимой технологии производства ЖКВ. В связи с этим были проведены повторные эксперименты по оптимизации условий размножения вакцинного штамма вируса кори ЭШЧ на клетках линии М-22 и некоторых других систем в поисках выбора наиболее пермиссивной.
Считаем это направление исследований важным и актуальным, так как уже более 15 лет ВОЗ рекомендует для производства противовирусных препаратов использовать линии перевиваемых клеток [24, 25].
В России живую коревую вакцину свыше 35 лет готовят на первичных культурах клеток японских перепелов с применением штамма Л-16 [26].
Несмотря на эффективную вакцинопрофилакти-ку живой коревой вакциной и с 2001 года ассоциированной паротитнокоревой вакциной, в России продолжают отмечаться подъемы заболеваний корью и эпидемическим паротитом [27 - 29], в частности в 2003 году в Москве произошел очередной подъем заболеваемости корью, причем среди заболевших 87,7% составляли подростки и взрослые [30].
Своими исследованиями мы хотим принять участие в выполнении «Программы ликвидации кори в Российской Федерации».
Материалы и методы
Посевным вирусом служили штамм ЭШЧ 49-ХУ0748 (серия 1), хранившийся при -200 С с апреля
1967 года, а также штамм 17-1-1064 (серия 2) и штамм 25-У!-1157 (серия 3) хранившиеся с января 1990 года. Средой поддержки были 0,5% гидролизат лактальбумина (ГЛА) на растворе Эрла, рН 7,5 и 7,6; среда 199 на растворе Эрла, рН 7,6, с 3 - 5% амино-пептида.
Размножение вируса осуществляли в линиях диплоидных клеток эмбриона человека М-21, М-22 [20, 7].
Кроме этого, изучали чувствительность к заражению штаммом ЭШЧ и других линий перевиваемых клеток - семенников новорожденной африканской зеленой мартышки 2688С [8], линии перевиваемых клеток селезенки и почек взрослых зеленых мартышек 455 и 4647 [9, 10], линии перевиваемых клеток сердца и языка зеленой мартышки 4179 [23]. При
этом проводили многократное восстановление клеток из криоконсервированного состояния. Проиент жизнеспособных клеток колебался от 70 до 85%, что связано с условиями хранения разных образиов. Рести-туиию осуществляли из банка посевных и рабочих клеток на разных уровнях пассажей. Линию М 21 - на уровне 15 - 16 пассажей, М-22 восстанавливали на уровне 9 - 19, 2688С - на 38 - 42-м уровнях, 455 - на 35 - 40, 4647 - на 40-м, 97 - 120-м пассаже, а 4179 -на уровне 45-го пассажа. Клетки, восстановленные из жидкого азота, поддерживали в последовательных пассажах стаиионарно. Культуры инкубировали при 37 + 0,50 С. В проиессе пересевов клетки от стекла отделяли смесью 0,25% раствора трипсина и Версена в соотношении 3:1. Кратность рассева для диплоидных клеток составляла 1:2, для остальных - 1:2 - 1:4. Для роста клеток применяли среду Игла МЕМ с 10% сыворотки крупного рогатого скота.
Результаты и обсуждение
При первичном заражении клеток линии М-22 штаммом ЭШЧ вируса кори I серии его накопление было зафиксировано на уровне 4,00 lg БОЕ/мл. При первичном заражении клеток линии М-22 вирусом II серии титры составили 2,60 и 3,90. В последующих последовательных пассажах отмечено активное размножение вируса кори, и титр достигал уровня 5,06 lg БОЕ/мл. При инокуляиии вируса III серии в клетках линии М-22 12 и 14 пассажей титры были 1,77 и 2,60. Перенос культуральной вируссодержащей жидкости в клетки линии М-22 17 пассажа завершился накоплением вируса в титре 5,12, а параллельное заражение культуры 12 пассажа закончилось размножением вируса в титре 4,98 lg БОЕ/мл. Затем было проведено 6 последовательных пассажей вируса с использованием линии М-22 на уровнях 12 - 22 пассажей. При этом показатели титров колебались от 3,00 до 5,00 lg БОЕ/мл.
Наиболее активное размножение вируса кори, штамма ЭШЧ, отмечено в клетках линии 2688С. Максимальный титр вируса I серии составил 5,92; II -6,18; III - 6,27 lg БОЕ/мл.
Проведены пассажи вируса кори при чередовании культур - с М-22 на 2688С и наоборот. При переводе вируса с М-22 (титр 3,67) на 2688С титр увеличился до 5,33 lg БОЕ/мл. При переводе с 2688С (титр 5,11) на М-22 титр снизился до 4,51 lg БОЕ/мл.
При заражении вакиинным штаммом вируса I серии также оказались чувствительными клетки линии М-21 (титр 4,47 lg БОЕ/мл), линии 4179 (3,80).
Была изучена чувствительность к заражению вирусом кори, штамм ЭШЧ, первичных культур семенников африканских зеленых мартышек, почки которых используют в производстве полиовакиин. Для получения культур проводили ферментативную обработку семенников 0,1 - 0,25% раствором трипсина. В качестве среды роста применяли среду Игла МЕМ или ГЛАХИ с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота. Заражению подверглись культуры от 58 животных, а также несколько субкультур.
Титры установлены в 49 культурах. В основном они были выше 3,00 lg БОЕ/мл, максимум - 5,06.
При внесении вируса I серии, полученного при заражении клеток линии 2688С с титром 6,07 lg БОЕ/мл, в первичную культуру клеток семенников и проведении на ней 10 последовательных пассажей, к сожалению, высоких титров не отмечено. Лишь в трех пассажах титры были выше 4,0. Причем лучшие результаты по степени репродукции вируса зарегистрированы в 6 - 8-суточных культурах, полученных от молодых животных (судя по массе тела).
В каждом опыте четко устанавливали сроки развития цитопатических изменений в клетках. Первые признаки появления симпластов в клетках диплоидных линий человека регистрировали на 8 - 10-е сутки. Генерализация процесса происходила за 3 - 5 суток, а дегенерация культуры с ее отслоением от стекла завершалась к концу двух недель. В линиях перевиваемых клеток обезьян симпласты формировались на 5 - 7-е сутки, и полная деструкция слоя заканчивалась к 6 - 10-м суткам. Наиболее эффективно штамм ЭШЧ размножался в клетках линии 4647, и особенно - 2688С. В связи с этим титрование вируса осуществляли в основном на этих двух культурах.
Проводили многократное изучение возможности получения больших объемов вируссодержащей жидкости, с последующей ее лиофилизацией. Окончательно отдали предпочтение использованию в качестве среды поддержки среде с 0,5% ГЛА на растворе Эрла, рН 7,5, с 3% аминопептида.
При сборе вируссодержащей жидкости добавляли сорбитол до конечной концентрации 5%, а перед лиофилизацией вносили желатозу до конечной концентрации 1%. После лиофилизации определяли титр вируса, который обычно варьировал от 4,00 до 5,00 lg БОЕ/мл, что является достаточным для приготовления эффективного препарата.
Выводы
Таким образом, результаты проведенных экспериментов дают возможность сделать вывод что при условиях, указанных в данной работе, возможно получение экспериментальные серии препарата на перевиваемых линиях клеток, и прежде всего М-22, для дальнейших лабораторных, преклинических и клинических испытаний живой коревой вакцины с целью дальнейшего решения вопроса о перспективах ее производства.
Литература
1. Маркушин С.Г., Коптяева И.Б., Ротан П. и др. Генетическая характеристика диких штаммов вируса кори, циркулирующих на европейской территории России в период 1998 -2002 г. // Вопросы вирусологии. 2004. < 4. С. 12 - 15.
2. WHO Expanded programme on immunization - progress towards global measles control and llimination. Wkly Epidemiol Rep. 1997. V. 7. P. 349 - 353.
3. WHO Expanded programme on immunization Standartization of the nomenclatire for describing the genetis characteristics of wild-type measles virus. Wkly Epidemiol Rep. 1997. Vol. 7. P. 349 - 353.
4. Малыгина И.Г., Лашкевич В.А., Миронова Л.Л. и др. - Методические рекомендации по приготовлению очищенной воды, применяемой для вирусологических исследований и в производстве культуральных противовирусных вакцин. М.: М3 СССР, 1984.
5. Малыгина И.Г., Миронова Л.Л., Моисеев В.П.. Методические рекомендации по выбору стекла, резиновых изделий и подготовка их для работы с культурами клеток. М.: М3 СССР, 1984.
6. Чумаков М.П. Проблема активной иммунизации против кори. Труды ИПВЭ АМН СССР. - М., 1967. - T. XI, вып. 1,
С. 3 - 15.
7. Чумаков М.П., Ворошилова М.К., Грачев В.П. и др. Дополнительные материалы изучения и применения живой коревой вакцины АМН СССР из штамма ЭШЧ и вопросы обеспечения массовой вакцинации против кори. Материалы проблемной комиссии АМН СССР. «Корь, вирусные энцефалиты, полиомиелит». Вып. 4: Корь, 1969. С. 5 - 22.
8. Ender Y. And Peebles T.S. Propagation in Tissue culture of cytopatogenic agents from Patients with Measles. Proc. Soc. Exper. Biol. and Med. 1954. - 86. P. 277 - 286.
9. Чумаков М.П., Грачев В.П., Дзагуров С.Г. и др. Адаптация и селекция высокоаттенуированного варианта вируса кори в первичных почечных культурах cercopithecus aethiops. Труды ИПВЭ АМН СССР. М., 1967, вып.1, С. 16 - 29.
10. Грачев В.П. Живые вакцины против желтой лихорадки, кори, чумы плотоядных и пути их усовершенствования. Автореферат диссертации на соискание ученой степени д.б.н. М., 1975.
11. Чумаков М.П., Джалилов Х.Д., Вирсанова Е.А. и др. Материалы массовой вакцинации детей в Ташкенте живой коревой вакциной из штамма ЭШЧ. Материалы проблемной комиссии АМН СССР «Корь, вирусные энцефалиты, полиомиелит». 1968, вып. 3, С. 7 - 14.
12. Ворошилова М.К., Чумаков М.П., Синяк К.М. и др. Изучение иммунологической активности живой коревой вакцины АМН СССР из штамма ЭШЧ. Труды ИПВЭ АМН СССР, 1967, т. XI, вып. 1, С. 67 - 75.
13. Чумаков М.П., Ворошилова М.К., Грачев В.П. и др. Изучение и применение живой коревой вакцины АМН СССР из штамма ЭШЧ для массовой вакцинации против кори. // «Гигиены эпид. микроб. и иммунолог, 1976, 14, 1, С. 1 - 16.
14. Чумаков М.П., Синяк К.М., Бойко В.М. и др. Эпидемиологическая эффективность массовой иммунизации детей живой коревой вакциной АМН СССР из штамма ЭШЧ в 1969 году. Труды ИПиВЭ АМН СССР, 1970, т. XVII, С. 3 - 21.
15. Чумаков М.П., Грачев В.П., Миронова Л.Л. и др. Экспериментальное изучение живой вакцины против кори из штамма ЭШЧ, приготовленной в первичных культурах почек ягнят. Труды ИПВЭ АМН СССР, 1970, т. 17, С. 31 - 40.
16. Чумаков М.П., Грачев В.П., Миронова Л.Л. Живая коревая вакцина из штамма ЭШЧ, изготовленная в культуре клеток почек новорожденных ягнят (КПЯ). Сборник «Актуальные проблемы вирусологии и профилактики вирусных заболеваний». М., 1972, С. 512 - 514.
17. Миронова Л.Л., Преображенская Н.К., Грачев В.П. и др. Штамм диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека, используемый для культивирования вирусов. Авт. свид. < 1317021 от 15 февраля 1987 г.
18. Чумаков М.П., Миронова Л.Л., Попова В.Д. и др. Разработка технологии изготовления живой коревой вакцины с использованием штамма ЭШЧ и линии диплоидных клеток человека М-22. // Биотехнология, 1998, < 3, С. 40 - 42.
19. Миронова Л.Л., Преображенская Н.К., Соловьева М.Н. и др. Штамм диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека, используемый в качестве тест-системы для определения антивирусной активности интерферонов человека и размножения вирусов. Авт. свид. < 1440029 от 22 июля 1988 г.
20. Миронова Л.Л., Попова В.Д., Колодина 3.И. и др. Получение и применение различных видов культур клеток органов и тканей эмбрионов, новорожденных и взрослых африкан-
[Эпидемиология и Вакиинопрофилактика 24 (23)/2 0 05
Эпидемиология и Вакиинопрофилактика <4 (23)/2 0 0 5
ОІ 1Ы1
ских зеленых мартышек. // Биотехнология. 1999. < 4. С. 15-20.
21. Миронова Л.Л., Хапчаев Ю.Х., Попова В.Д. Линия перевиваемых клеток селезенки взрослой зеленой мартышки 455, используемой для культивирования вирусов. Авт. свид. е 984214 от 22 августа 1982 г.
22. Миронова Л.Л., Хапчаев Ю.Х. Линия гетероплоидных клеток 4646; изучение, применение, перспективы. Тверь, 1995, 113 с.
23. Миронова Л.Л., Стобецкий В.И., Попова В.Д. и др. Получение и характеристика линий перевиваемых клеток органов и тканей. // Биотехнология. 2000. < 6. С. 48 - 53.
24. Требования к перевиваемым линиям клеток, используемые для производства биологических препаратов. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. Серия технических докладов ВОЗ <745. М., 1988, С. 85 - 98.
25. Методические указания аттестации перевиваемых клеточных линий-субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов РД 42-28-10-89. М., 1989.
26. Колышкин В.М. Состояние вакцинопрофилактики кори и эпидемического паротита в Российской Федерации на со-
временном этапе // Эпидемиология и вакиинопрофилактика, 2004, <4. С. 8 - 10.
27. Тихонова Н.П., Лазикова Г.Ф., Герасимова А.Г. и др.Пер-спективы реализаиии Программы ликвидаиии кори в России // Эпидемиология и вакиинопрофилактика. 2005. <1 С. 19 - 22.
28. Колышкин В.М. Иммуногенез при комбинированной вакиинаиии против кори и эпидемического паротита взрослых отечественной ассоииированной паротитно-коревой вакииной производства МПБП НПО «Микроген» // Эпидемиология и Вакиинопрофилактика. 2004. <6 С. 18 - 20.
29. Колышкин В.М. Роль отечественных коревых вакиин в Программе элиминаиии кори на территории Российской Фе-дераиии // Эпидемиология и Вакиинопрофилактика. 2004.
<6 С. 20 - 21.
30. Филатов Н.Н., Лыткина И.Н., Миронова В.Ф. и др. О состоянии заболеваемости корью и организаиии мероприятий по ее снижению в Москве // Эпидемиология и вакиинопрофилактика, 2004, <6 С. 10 - 14.
Особенности лабораторной диагностики бактериальных менингитов в условиях догоспитального применения антибиотиков
Г.В. Белошиикий, И.С. Королева
ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва
Введение
Раннее применение антибиотиков оказывает существенное влияние на прогноз течения заболевания бактериальным менингитом (БМ) и его исход. Из-за тяжести клинических проявлений, постинфекцион-ных осложнений и высоких показателей летальности антибактериальная терапия больным БМ является неотложной. При этом руководствуются эмпирическим выбором антибиотиков в отношении наиболее распространенных патогенов, до получения результатов бактериологического исследования. Правильность такой тактики, особенно при наличии характерных изменений в ликворе, подтверждена в работах зарубежных и отечественных авторов [3].
В России введение антибактериальных препаратов (пенициллина или левомицетина) больным генерализованными формами менингококковой инфекции на догоспитальном этапе регламентировано
Приказом е 375 от 23.12.98 Министерства здравоохранения Российской Федерации [1].
Вместе с тем, раннее применение антибиотиков до проведения диагностической пункции и забора крови на бактериологическое исследование резко снижает возможность выделения культуры возбудителя. Лечение антибиотиками, проводящееся амбулаторно даже в недостаточных дозах, приводит к быстрой гибели бактериальных клеток в цереброспинальной жидкости. Ценность культурального исследования спинно-мозговой жидкости после получения пациентом антибактериального препарата снижается с 70 - 85% до 50% и менее [4]. По данным некоторых исследователей, уже через 24 - 36 часов после проведения адекватной антибиотикотерапии ликвор не содержит жизнеспособных микроорганизмов, при отсутствии изменений в основных параметрах спинно-мозговой жидкости [2].
