CC BY
21
УДК 581.9
К ВОПРОСУ О РАСПРОСТРАНЕНИИ HEDYSARUM UCRAINICUM KASCHM. НА ТЕРРИТОРИИ ВОЛГОГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ
© 2016 Н.А. Супрун1, И.А. Шанцер2
1 Государственное бюджетное учреждение Волгоградской области «Волгоградский региональный ботанический сад»
2 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук, г.Москва
Статья поступила в редакцию 28.11.2016
На основе морфологических и генетических исследований редких видов растений Hedysarum ucrainicum Kaschm. и H. cretaceum Fisch. с использованием морфологии и ISSR маркеров показано, что H. ucrainicum должен быть исключен из списка редких и исчезающих видов Волгоградской области, так как не произрастает на этой территории.
Ключевые слова: редкие виды, Hedysarum cretaceum, Hedysarum ucrainicum, Волгоградская область, Средний Дон, ISSR-метод.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 14-04-01094.
Hedysarum ucrainicum Kaschm. - редкий вид флоры меловых обнажений юга Европейской части России, описанный с мелов рек Айдара и Беленькой в Луганской области [1]. Вид считается узкорегиональным эндемиком и внесен в Красную книгу Российской Федерации [2]. Для территории Волгоградской области H. ucrainicum был впервые приведен в работах Н.Г. Володиной [3-5] из окрестностей хуторов Большеголубин-ский и Малонабатовский Калачевского района в излучине Среднего Дона. Эти местонахождения располагаются дизъюнктивно от основного ареала вида в бассейне р. Айдар. Во Флоре СССР [6] и Флоре европейской части СССР [7] H. ucrainicum приводится только для Белгородской (Ровенский район, меловые обнажения близ сс. Айдар, Нагольное, Ровеньки, Кленовское) и Воронежской областей (Кантемировский и Россошанский районы: меловые обнажения близ сс. Волоко-новка, Новобелая Кантемировского р-на [8]. На сегодняшний день H. ucrainicum сохраняется во флористическом списке для Волгоградской области и внесен в региональную Красную книгу [9], хотя нахождение его на территории области вызывает сомнения.
В Волгоградской области широко распространен и внешне сходный с H. ucrainicum вид - H. cretaceum Fisch. В Волгоградской области он довольно широко распространен на меловых обнажениях по рр. Дону, Хопру, Бузулуку, Иловле
Супрун Наталья Александровна, кандидат биологических наук, начальник научного отдела. E-mail: n.suprun@mail.ru.
Шанцер Иван Алексеевич, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории Гербарий. E-mail: ischanzer@gmail.com
и Медведице [10]. На территории области располагается locus classicus вида - он был описан по сборам из бывшего Камышинского уезда [11,4,7]. Среднедонские находки H. ucrainicum на территории Волгоградской области находятся в пределах ареала H. cretaceum, в отличие от популяций основной части ареала этого вида, который с ареалом H. cretaceum не перекрывается (рис. 1).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В анализ были включены 47 образцов копеечников, в том числе 36 образцов H. cretaceum (включая 4 образца H. «ucrainicum» из Волгоградской области) и 8 образцов H. ucrainicum из 11 географически удаленных друг от друга локальных популяций. Список местонахождений, сокращенных обозначений локальных популяций и числа образцов, изученных в каждой из них, приведен в таблице 1.
ДНК выделяли ЦТАБ методом [12] из листьев гербарных образцов или листьев, высушенных в силикагеле.
Для проведения фрагментного анализа ДНК были использованы межмикросателлитные маркеры (Inter Simple Sequence Repeats, ISSR), зарекомендовавшие себя, как надежные и воспроизводимые в большом числе исследований по изучению популяционной структуры и гибриди-зационных процессов в природных популяциях разных видов растений [13-17].
В качестве праймеров для проведения ПЦР были использованы 8 олигонуклеотидных последовательностей, комплементарных микросател-литным участкам генома. Состав и температуры отжига праймеров приведены в таблице 2.
Известия Самарского научного центра Российской академии наук, т.18, №5(2), 2016
Рис. 1. Ареал Я ucrainicum и Я cretaceum
Таблица 1. Исследованные популяции видов Hedysarum
Популя ция Место сбора Вид Место хранения образцов n
1. Волгоградская область, Нехаевский район, окр. х. Нехаевский H. cretaceum личный гербарий H.A. Супрун 4
2. Волгоградская область, Руднянский район, окр. урочища «Синяя гора» H. cretaceum личный гербарий H.A. Супрун 3
3. Волгоградская область, Дубовский район, окр. с. Полунино H. cretaceum личный гербарий H.A. Супрун 4
4. Волгоградская область, Иловлинский район, окр. х. Кондраши H. cretaceum личный гербарий H.A. Супрун 4
5. Волгоградская область, Иловлинский р-н, окр. ст. Сиротинская и Б. Набатовский, H. cretaceum личный гербарий H.A. Супрун, MHA 5
6. Волгоградская область, Иловлинский р-н, между сс. Михайловка и Каменный Брод H. cretaceum MHA 2
7. Волгоградская область, Ольховский район, окр. х. Захаровка и Михайловка, H. cretaceum личный гербарий H.A. Супрун, MHA 5
8. Волгоградская область, Жирновский р-н, меловые обнажения по р. Медведицы, с. Меловатка, Ольховка, Красный Яр H. cretaceum MHA 3
9. Волгоградская область, Камышинский р-н, окр. с. Белогорка H. cretaceum MHA 1
10. Волгоградская область, Калачевский район, близ х. Большенабатовский H. cretaceum, H. "ucrainicum" личный гербарий H.A. Супрун, MHA 8
11. Луганская обл., Меловской р-н, с. Стрельцовка H. ucrainicum MHA 8
Примечание: п - число образцов, изученных из отдельной локальной популяции; МИЛ - Гербарий ГБС РАН
Таблица 2. Последовательности ISSR праймеров, использованных для проведения ПЦР
Название 5'-3' последовательность Температура отжига, °С
M 2 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 50
M11 ACACACACACACACACYT 50
UBC 868 GAAGAAGAAGAAGAAGAA 48
HB12 GGGTGGGGTGGGGTG 54
HB13 TCTCTCTCTCTCTCTCRT 50
HB14 GGTCCCTGAC 36
HB15 GTGACGTAGG 36
844A AGCCAGCGAA 36
Реакционная смесь (20 мкл) содержала 10-20 нг ДНК, 20 пикомоль праймера и 4 мкл готового реакционного микса MasterMix 5X MagDDMIX-2025 (200 мкМ каждого dNTP, 1,5 мМ MgCl2, 1,5 ед. Taq-полимеразы и буфер, Диалат ЛТД, Россия). ПЦР с предварительной денатурацией (95°С - 3 мин) проводили в амплификаторе MJ Research PTC-220 DNA Engine Dyad (Biorad Ltd., США) в течение 40 циклов в режиме: денатурация при 94°С - 30 с; отжиг при соответствующей температуре - для каждого праймера - 30 с.; элонгация при 72°С -1 мин; финальная элонгация при 72°С - 3 мин.
Фотографии ISSR гелей анализировали с помощью программы Cross Checker [18] с составлением матрицы, в которой наличие или отсутствие в ISSR спектрах одинаковых по размеру фрагментов соответствовало значениям 1 или 0. Предварительный анализ полученной матрицы проводили в программе Microsoft Exel. Анализ методом главных координат проводили в программе PAST 2.0 [19] с использованием расстояния Жаккара.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ
Проведенное обследование указываемых в литературе [3-5,9] местонахождений H. ucrainicum в окрестностях хут. Большеголубинский и Мало-набатовский Калачевского района Волгоградской области не дало положительного результата - этого вида нам обнаружить не удалось. В гер-барных фондах Волгоградской области (ГБУ ВО «Волгоградский региональный ботанический сад», гербарий ФГБОУ ВПО «ВГСПУ») образцы H. ucrainicum также отсутствуют. Единственным подтверждением произрастания H. ucrainicum на территории Волгоградской области оказались 2 экземпляра с этикеткой «Волгоградская область, меловые обнажения в устье реки Голубой, х. Малонабатовский Калачевского района, овраг к юго-востоку от села, пологий склон, покрытый мелкой щебенкой, по продольным бороздкам, 24.08.1973, Володина Н.Г. (MHA)», хранящиеся в гербарии ГБС РАН. Однако внимательное морфологическое изучение этих образцов позволило
идентифицировать их, как Н. еШаееит.
По различным диагностическим ключам Н. исгаМсит и Н. стЛасвит имеют сходные между собой признаки, такие как жизненная форма, высота растения, окраска цветков, внешние признаки стебля, листовой пластинки и цветоносных побегов. Отличительными признаки данных видов являются наличие и отсутствие шипика на флаге венчика (у Н. ств1асвит он отсутствует), соотношение зубчиков к трубке чашечки (Н. ст^асвит - зубцы в 2-3 раза короче трубки, Н. истаМсит - зубцы чашечки в 2-3 раза длиннее трубки); внешними признаками плода (Н. ст^асвит - членики бобов продолговато-эллиптические, коротко прижато волосистые, без шипиков, нередко отделяющиеся перетяжками, грубо-сетчатые, у Н. истаМсит - членики бобов округло-яйцевидные, малоопушенные, но с острыми мелкими шипиками). Таким образом, оба вида достаточно хорошо отличаются друг от друга по размерам элементов цветка и характеру опушения плода (рис. 2).
Н. истаМсит близок к Н. ¿¡твМии ЬЫеЬ., от которого отличается цветками отклоняющимися и отчасти поникающими при отцветании (а не прижатыми кверху). Ещё ближе к казахстанскому Н. зквШаиит Кп)азеу, от которого отличается более коротким опушением (волоски около 0.5 мм дл., а не 1-1.5 мм дл.) на стеблях, черешках, чашечках, в среднем более узкими листочками.
Тем не менее, полученные нами данные подтверждаются анализом состава ^БЯ маркеров методом главных координат, который показывает, что образцы, собранные в Волгоградской области и определенные, как Н. истаМсит, группируются вместе с другими образцами Н. стЛасвит из Волгоградской области, а не с образцами настоящего Н. истаМсит из Белгородской области (рис. 3).
ВЫВОДЫ
Таким образом, Н. истаМсит приводился для Волгоградской области по ошибочным определениям образцов, относящихся к Н. ств1асвит. На самом деле этот вид не заходит так далеко на
Известия Самарского научного центра Российской академии наук, т.18, №5(2), 2016
Цветок
Плод
Цветок
Плод
Нес^уэагит сге1асеит Небуэагит исгат/сит
Рис. 2. Внешний вид венчика и плода Н. cretaceum и Н. ucrainicum
? •
■
...............................1 ■ .а ■ ■. Ч ■ ■
> . 1 ■ .. ,ГТ|....................
1....................................... ■ т ■ и 1 Р*
координата 1
- И. сгеШсеит
□
- «Н. исгаШсит» (Волгоградская область)
- Н. исгаШсит (Луганская область)
Рис. 3. Результаты анализа образцов Н. с^асеит и Н. исгаМсит из 12 локальных популяций методом главных координат (РСоА) (анализ сделан по молекулярным данным (данные ^БЯ-маркеров)
восток, оставаясь узколокальным эндемиком бассейна р. Айдар. Растения, ранее определявшиеся, как Н. исгаМсит, следует относить к Н. с^асеит.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Кашменский Б.Ф. Hedysaram исгаШсит (эр.п.) и смежные с ним виды / Б.Ф. Кашменский // Известия Петербургского бот. сада. 1905. Т. 5. № 2. С. 57-65.
2. Киселева К.В. Копеечник украинский (Hedysarum исгаМсит КаэсЬт.) // Красная книга Российской Федерации (растения и грибы). Москва. 2008. С. 244-245.
3. Володина Н.Г. К флоре меловых обнажений Волгоградской области // Бюллетень МОИП. 1978. Т. 83. Вып. 4. С. 142-148.
4. Володина Н.Г. Флора меловых обнажений Волгоградской области , дис. ...канд. биол. наук. Москва.
9.
1979. 215 с.
Володина Н.Г. Флора меловых обнажений Волгоградской области // Флора степей и полупустынь (На примере Нижнего Поволжья). Волгоград. 1982. С. 34-46.
Федченко Б.А. Копеечник - Hedysarum Ь. // Флора СССР. Изд-во АН СССР. Москва, Ленинград. 1948. Т. 13. С. 301-318.
Васильева Л.И. Род Hedysarum Ь. // Флора Европейской части СССР, том VI, Покрытосеменные, двудольные. Издательство «Наука», Ленинградское отделение. Ленинград. 1987. С. 87-93. Голицин С.В. Сниженные альпы» и меловые ис-сопники Среднерусской возвышенности // Докл. о работах, предст... канд. биол. наук. Воронеж, 1965. 16 с.
Матвеев Д.Е. Копеечник украинский - Hedysarum исгаМсит КавсЬт. // Красная книга Волгоградской области. Т. 2: Растения и грибы. Волгоград, 2006а. С. 118.
10. Матвеев Д.Е. Клинкова Г.Ю. Копеечник меловой - Hedysarum cretaceum Fisch. // Красная книга Волгоградской области. Т. 2: Растения и грибы. Волгоград, 2006б. С. 114.
11. Абрамова Т.И. Растительность меловых обнажений степной части бассейна реки Дона в Ростовской и Волгоградской областях // Ботанический журнал. 1973. Т. 58. № 4. С. 562-570.
12. Doyle J.J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull. 1987. V. 19. P.11-15.
13. Wolfe A.D., Xiang Q.-Y., Kephart S.R. Assessing hybridization in natural populations of Penstemon (Scrophulariaceae) using hypervariable inter-simple sequence repeat (ISSR) bands // Mol. Ecol. 1998. Vol. 7. N 9. P. 1107-1125.
14. ArchibaldJ.K., Wolfe A.D., Johnson S.D. Hybridization and gene flow between a day and night-flowering species of Zaluzianskya (Scrophulariaceae s.s., tribe Manuleeae) //
Am. J. Bot. - 2004. Vol. 91. N 9. P. 1333-1344.
15. Шанцер И.А., Войлокова В.Н. Сколько видов, родственных Rosa majalis, растет в европейской части России? // Бот. журн. 2008. Т. 93. № 11. С. 1690-1704.
16. Шанцер И.А., Вагина А.В., Остапко В.М. Критическое исследование шиповников (Rosa L.) заповедника «Хомутовская степь» // Бюлл. МОИП. Отд. биол. 2011. Т. 116. Вып. 3. С. 38-48.
17. Супрун Н.А., Шанцер И.А. Генетическая изменчивость видов родства Hedysarum grandiflorum Pall. (Fabaceae) по данным ISSR маркирования // Бюл. ГБС РАН. №4. 2013. С. 42-49.
18. Buntjer J.B. Cross Checker: computer assisted scoring of genetic AFLP data // Plant & Animal Genome VIII Conference. San Diego, CA, January 9-12. 2000.
19. Hammer О., Harper D.A., Ryan P.D. PAST: Palaeontological Statistics software package for education and data analysis // Palaeontologia Electronica. 2001. Vol. 4. N 1. 9 pp.
ON THE EXTENSION OF HEDYSARUM UCRAINICUM KASCHM. IN THE VOLGOGRAD REGION
© 2016 N.A. Suprun \ I.A. Schanzer 2
1 Volgograd Regional Botanical Garden 2 Main Botanical Garden of Russian Academy of Sciences, Moscow
On the basis of morphological and genetic studies of rare plant species Hedysarum ucrainicum Kaschm. and H. cretaceum Fisch. using morphology and ISSR markers indicates, that H. ucrainicum should be excluded from the list of rare and endangered species of Volgograd Province, since it does not occur in this area. Keywords: rare species, Hedysarum cretaceum, Hedysarum ucrainicum, Volgograd Region, Middle Don, ISSR-method.
Natalia Suprun, Candidate of Biological Science, Head of Scientific Department. E-mail: n.suprun@mail.ru. Ivan Schanzer, Doctor of Biology, Professor, Leading Research Fellow. E-mail.: ischanzer@gmail.com
