CC BY
14Ye.A.Saratovskikh, N.B.Kozlova STUDIES ON ACCUMULATION OF PESTICIDES IN FATTY PHASE
Institute of Problems of Chemical Physics, Russian Academy of Sciences, Chernogolovka, Moscow Region Institute of Chemical Physics, Russian Academy of Sciences, Moscow
Partition constants of otanol/water for a number of pesticides widely used in the agricultural practice were determined. These pesticides include Lontrel, Sencor, Basagran, Roundup, Kusagard, Sethoxydim. It was shown that compounds under consideration accumulate in the fatty layer. The kinetics of their accumulation was studied; accumulation rates in a non-polar phase which correlate with values of the complex-formation constants of the same compounds were estimated. The formation of complexes with a fatty phase (lipid portion) in cellular membranes induces bioaccumulation of toxicants. The process of transition of toxicants under consideration into the non-polar phase prolonged at a significant speed over all the time of observation — 18 months.
УДК 615.099:615.9:577.472
В.Б.Долго-Сабуров, Н.П.Подосиновикова, В.В.Петров, В.В.Трефилов, В.А.Беляев К СРАВНИТЕЛЬНОЙ ОЦЕНКЕ ТОКСИЧНОСТИ КСЕНОБИОТИКОВ
ФГУН«Институт токсикологии» ФМБА России, С.-Петербург
Проведено исследование токсического действия ряда физиологически активных веществ на гидробионтов Daphnia Magna Straus. Анализ токсикометрических кривых — времени гибели дафний как функции обратной концентрации токсиканта — выявил у всех исследованных препаратов в широком диапазоне концентраций наличие от одного до нескольких прямолинейных участков, допускающих простую аппроксимацию.
Ключевые слова: токсикометрия, дафнии, ксенобиотики.
Введение. При исследовании токсичности химических соединений, как правило, используется определение средних доз или концентраций, вызывающих гибель определенного процента животных за фиксированный промежуток времени. Подобная информация часто оказывается недостаточной для сравнительной оценки действия препаратов и отбора средств фармакологической коррекции. В настоящем исследовании рассмотрен подход к оценке токсического действия, состоящий в анализе зависимости времени гибели от уровня токсического воздействия в широком диапазоне концентраций и в выявлении участков, допускающих линейное описание.
Материалы и методы исследования. Опыты были поставлены на гидробионтах Daphnia magna Straus. Разведение дафний осуществляли в соответствии с требованиями международного стандарта по биотестированию воды [1]. Дафний в возрасте 7 суток помещали в лабораторные стаканчики с растворами тестируемых препаратов различной концентрации по одной особи в каждую пробу объемом 40 мл. Фиксировали время от внесения дафнии в пробу до момента её гибели. При наблюдении более двух суток дафний кормили. Исследуемые концентрации изменялись с шагом 0,1 по логарифмической шкале. Каждую концентрацию исследовали, как правило, не менее чем на 10 дафниях. Все иссле-
дованные концентрации вызывали 100% гибель дафний, что позволяет корректно рассчитывать среднее время гибели.
Результаты исследований представлены в виде графиков зависимости среднего времени гибели (Т, мин) от величины обратной концентрации токсиканта (1/С, л/моль) [2]. Выбор обратных величин по оси абсцисс является принципиальным моментом: именно такой масштаб позволяет выявить на графиках прямолинейные участки, допускающие содержательную интерпретацию.
Т, мин
г' г
А
0 Х=1/С, л/моль
0 500 1000 1500 2000 2500
Рис. 1. Среднее время гибели дафний при различных разведениях (обратных концентрациях) ареколина.
Пунктиром показана аппроксимирующая прямая
Т, мин
]
100 ■ .{Л"-""
Г
tx=1/c, л/моль
_ -,-,-,-,-,—
0 200 400 600 000 1000
Рис. 2. Среднее время гибели дафний при различных разведениях гидропероксида. Пунктирными линиями показаны две аппроксимирующие прямые
Результаты и обсуждение. Оценка токсического действия была проведена для ряда препаратов, представляющих различные группы физиологически активных соединений: лиганда холинер-гической медиаторной системы ареколина, ли-ганда дофаминергической системы дофамина и экзогенных токсикантов — препарата ^метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП), вызывающего у млекопитающих снижение до-фаминергической иннервации, и прооксиданта гидропероксида.
У всех исследованных препаратов на графиках зависимости среднего времени гибели тест-объекта (Т, мин) от величины обратной концентрации токсиканта (X = 1/С, моль-1) достоверно выявляется от одного до нескольких линейных участков. Поскольку величина X = 1/С широко используется в дальнейшем, удобно присвоить ей собственное название — разведение. В используемых координатных осях соответствующие линейные зависимости описываются уравнением прямой Т = а + Ь/С. Коэффициент Ь характеризует угол наклона прямой. Коэффициент а определяет условное «минимальное время реализации летального эффекта», т. е. время гибели при бесконечно высокой концентрации токсиканта при условии, что данная линейная зависимость справедлива в области 1/С ^ 0.
Диапазоны концентраций, соответствующие прямолинейным участкам, для всех исследованных препаратов достаточно широки и составляют от половины десятичного порядка до порядка и более. Структура токсикометрической кривой в целом специфична для каждого препарата и может иметь различную степень сложности.
Наиболее простая зависимость получена у ареколина. Диапазон исследованных концентраций для него составил от 2,5-10-3 до 4,0-10-4 моль/л (что соответствует диапазону разведений от 400 до 2500 л/моль). На рис. 1 представ-
Т, мин
J-Íí"'
0 ti ^ Х=1/С, л/моль
0 1 2 3 4 5
Рис. 3. Среднее время гибели дафний при различных разведениях МФТП. Пунктиром показана аппроксимирующая прямая
лен график, показывающий среднее время гибели дафний.
Полученные результаты соответствуют известному закону Габера: экспериментальные точки с высокой достоверностью ложатся на прямую, описываемую уравнением Т = Ь/С (Ь = 0,245 мин-моль). Такая форма зависимости впервые была обнаружена при ингаляционном токсическом поражении. В условиях используемой нами методики токсикант присутствует в постоянной концентрации в среде содержания тест-объекта и, по существу, кинетика поступления здесь такая же.
Закон Габера можно интерпретировать так: гибель наступает, когда организм набирает летальную токсическую экспозицию, которая численно как раз равна коэффициенту Ь. Коэффициент Ь фактически характеризует «степень токсичности»: чем он меньше, тем меньшая концентрация токсиканта нужна для обеспечения летального эффекта за заданное время, тем сильнее его действие.
Однако такая простая зависимость — скорее исключение, чем правило. Так, гидропероксид демонстрирует более типичную форму. Для него исследованный диапазон концентраций составил от 1,0 до 0,001 моль/л, полученные результаты представлены на рис. 2.
Экспериментальные точки с высокой достоверностью укладываются на ломаную линию, образованную двумя отрезками прямых. При малых разведениях от 1 до 20 л/моль — в диапазоне концентраций от 1,0 до 0,05 моль/л — график соответствует обычному закону Габера Т = Ь/С (Ь = 2,97 мин-моль). При больших разведениях наклон прямой резко меняется и появляется значимая постоянная составляющая. Уравнение прямой здесь имеет вид Т = а + Ь/С (а = 74,2 мин, Ь = 0,244 мин-моль).
Такой вид графика можно интерпретировать
так. Предположим, в организме дафнии имеются две мишени токсического действия. Первая довольно устойчива к неблагоприятным воздействиям (требуется высокая экспозиция для её поражения), но её выход из строя вызывает незамедлительную гибель. Вторая мишень более чувствительна, ей опасны значительно меньшие экспозиции, но её поражение, даже полное, не вызывает гибели сразу, а требует времени для реализации летального исхода.
При высоких концентрациях поражаются обе мишени, однако летальный эффект связан с первой из них, так как проявляется тут же. При снижении концентрации время, необходимое для поражения первой мишени, становится сопоставимым с временем наступления летального эффекта при поражении второй. Наконец, при ещё более низких концентрациях поражение первой мишени даже не успевает наступить, и летальный эффект целиком обязан поражению второй мишени.
Наличие нескольких прямолинейных участков оказалось характерным и для других токсикантов. Однако нередко картина оказывается более сложной. Два следующих препарата, дофамин и МФТП, выявляют наличие переходных участков. МФТП был исследован при концентрациях от 80 до 0,2 моль/л, полученные результаты представлены на рис. 3.
Видно, что основная масса экспериментальных точек ложится на прямую Т = а + Ь/С (а = 720 мин, Ь = 645 мин-моль). Однако при высоких концентрациях от 80 до 5,0 моль/л время гибели дафний не меняется и составляет 6—8 мин; при дальнейшем снижении концентрации оно возрастает, но вплоть до 2,0 моль/л зависимость имеет нелинейный вид.
При анализе исходных данных выявилась следующая картина: на этом участке часть дафний погибает очень быстро, за 8—16 мин, другая часть — значительно позже, через 300—700 мин. При снижении концентрации доля первых сокращается, вторых увеличивается. Это можно объяснить тем, что здесь проявляются два механизма летальности. С понижением концентрации «быстрый» механизм постепенно перестаёт действовать и замещается другим, приводящим
к гибели в значительно более отдалённые сроки.
Похожая по форме зависимость обнаруживается и у дофамина. Он был исследован в дозах от 0,03 до 0,004 моль/л. В области больших разведений от 125 до 250 л/моль характер графика соответствует закону Габера: T = b/C (b = 2,82 мин-моль). При самых малых разведениях — 30, 40 и 50 л/моль — время гибели удерживается на уровне 8—9 мин. В промежуточном диапазоне отмечается аналогичное нелинейное поведение.
Заключение. Экспериментальные данные, полученные для ряда токсических веществ, убедительно свидетельствуют, что графики зависимости времени гибели T от величины обратной концентрации 1/C содержат, как правило, один или несколько линейных участков, в пределах которых данная зависимость выражается линейной формулой T = a + b/C. Коэффициенты a и b можно рассматривать как показатели токсического действия данного вещества в некотором диапазоне концентраций; их значение позволяет рассчитывать ожидаемый токсический эффект.
Каждый линейный участок, по всей видимости, соответствует определённому, доминирующему в данном диапазоне концентраций, механизму токсического действия, реализующему летальный эффект.
Авторы полагают, что предложенный подход может быть особенно полезен при отборе средств фармакологической коррекции для каждого из механизмов токсического действия, соответствующих отдельным линейным участкам.
Работа выполнена при частичной поддержке грантом РФФИ № 06-04-48639.
Список литературы
1. Международный стандарт. Качество воды. Определение угнетения подвижности Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacera). ИСО 6341, 1987.
2. Петров В.В., Подосиновикова Н.П., Долго-Сабуров В.Б. Патент на изобретение № 2256910 от 19.06.2003 г. Способ определения чувствительности гидробионтов Daphnia magna Straus к токсическому воздействию водорастворимых химических веществ.
Материал поступил в редакцию 27.03.07.
V.B.Dolgo-Saburov, N.P.Podosinovikova, V.V.Petrov, V.V.Trefilov, V.A.Belyaev ABOUT COMPARATIVE ASSESSMENT OF TOXICITY OF XENOBIOTICS
Federal State Scientific Establishment «Toxicology Institute», St. Petersburg
Toxic effects of a number of physiologically active substances on hydrobios Daphnia Magna Straus were studied. The analysis of toxicometric curves showing the time of death of Daphnia as a function inverse to a toxicant concentration revealed the presence of one to several rectilinear sections with all preparations investigated within a large range of concentrations which makes it possible to use a simple approximation.
