CC BY
67
К серодиагностике бактериальных инфекций методом радиального гемолиза
Ф.Э.Садыхова, Р.А.Мамедбекова, Н.Ф.Муталибова,
С.Г.Керимов, Э.А.Дадашев
Азербайджанский Государственный институт усовершенствования врачей им. А.Алиева;
Республиканская противочумная станция им. С.Имамалиева, г.Баку
Настоящий период развития микробиологической науки в сочетании с проблемами диагностики инфекционных заболеваний характеризуется особой сложностью.
Отмеченное обусловлено новейшими данными об эволюции микроорганизмов и, в частности, об уникальной изменчивости бактериальных патогенов в различных ее проявлениях, что и обуславливает отмеченные выше затруднения в диагностике инфекции [1], что разумеет необходимость совершенствования методов диагностики с применением современных информативных методов, но с возможным более широким внедрением в практику диагностики и испытанных серологических методов диагностики, признанных и утвержденных ВОЗ с модификациями.
Задача заключается в том, чтобы установить природу микроба, а также диагностику инфекционного заболевания в том случае, когда выделенный микроб имеет некоторые измененные свойства. Кроме того, известны факты отсутствия изоляции микроорганизмов при наличии клиники выраженной патологии, что требует применения дополнительных презентативных методов детекции микроорганизмов, в частности патогенов из "вторичных" культур, содержащих, так называемые, "некультивируемые", "персистентные", "покоящиеся" клетки [2, 3].
Кроме того, установлен факт выделения "транзиторных" патогенов при применении общепринятых культуральных методов с определением их высокой антибиотикочувствительности к тому или иному антибиотику, но которые оказываются совершенно неэффективными при лечении, что объяснимо в настоящем персистентным состоянием "покоящихся" клеток, но с возможной активацией их, которые и могут быть истинными возбудителями инфекционного процесса. Активация их патогенных возможностей происходит под воздействием цитокинов, провоцированными отмеченными выше транзиторными патогенами [4].
Исходя из вышеизложенного, чтобы диффе-
ренцировать и установить этиологическую роль тех или иных патогенов - истинных возбудителей, будь то патогены, выделенные культуральными методами или активированными "некультивируемы-ми" патогенами правомерно было бы проведение исследования по выявлению соответствия аутоан-тител к выделенному возбудителю, а в перспективе исследованием парных сывороток с сероконвер-сией в 4 и более раз во 2-ой порции [5].
Но, имеющиеся и утвержденные ВОЗ серологические методы довольно трудоемки и не находят широкого применения в диагностической практике.
Исходя из вышеизложенного, целью исследования была отработка метода радиального гемолиза (МРГ) по детекции бактериального патогена с использованием соответствующих типоспецифи-ческих сывороток.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Реакцию радиального гемолиза (РРГ) ставили по методу Schild et а1 (1974 г.) [6].
Реакция радиального гемолиза (РРГ) - система пассивного гемолиза для определения антител (или антигена), основанная на пассивном гемолизе эритроцитов, сенсибилизированных добавлением частиц выделенного патогена. Сенсибилизированные эритроциты лизировали при 37°С в присутствии антител к патогену и комплемента.
Эритроциты барана (или человека О-группы) отмывали в физиологическом растворе и хранили в декстрозо-желатино-вероналовом буферном растворе (ДЖВБ).
Сенсибилизацию 10% суспензии эритроцитов проводили при 4°С в течение 10 минут.
Использовали 1% агарозу марки "Б" Олайнского завода химреактивов.
Иммунопластины для РРГ готовили путем внесения 1,5 мл смеси расплавленной агарозы, комплемента (ФБС-фильтрат бычьей сыворотки) и сенсибилизированных эритроцитов.
Антиген-агарозные матриксы готовили в чашках Петри или в полистироловых панелях с крышками, размером 2,0х7,0 см типа Hylland, выпускаемых Московским опытно-экспериментальным заводом "Медтехни-ка". Иммунопластины для РРГ готовили путем введе-
Таблица 1. Сопоставление титров антител в реакции радиального гемолиза (РРГ) и в реакции
агглютинации (РА)
Антигены Антисыворотки к антигенам Титры антител
РА (в разве д.) РРГ (в мм)
1 .Диагностикум из шигелл Флекснера Агглютинирующая адсорбированная поливалентная сыворотка к шигеллам Флекснера 1:400 5-8
2 .Диагностикум эшерихиозный Поливалентная агглютинирующая эшерихиозная сыворотка ОКА 1:400 4-10
ния 0,3 мл эритроцитов, обработанных испытуемыми патогенами (антигенами) и 0,1 мл неразведенного комплемента - ФБС (фильтрат бычьей сыворотки)- в 2,6 мл агарозы (1% агарозный гель - 70 мг агарозы +7,5 мл физ. р-ра) при 37°С.
Конечная концентрация эритроцитов в геле равна 2%, а концентрация комплемента - 1:30. Эту суспензию затем перемешивали для равномерного распределения эритроцитов и наносили на покровные стекла или на пластиковые иммунопластины Hylland.
В геле вырезали лунки диаметром 2 мм и вносили по 5 мкл, известные типоспецифические сыворотки с известными титрами. После инкубации пластин в течении 16 часов при 37°С определяли зоны полного или частичного гемолиза. Титр сыворотки в РРГ определяли по диаметру зоны гемолиза.
В качестве определяемых антигенов и соответствующих антисывороток использованы: диагности-кум из шигелл Флекснера; агглютинирующая адсорбированная поливалентная сыворотка к шигеллам Флекс-нера; диагностикум эшерихиозный; поливалентная агглютинирующая эшерихиозная сыворотка ОКА.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Нами была предпринята попытка найти условия, обеспечивающие выявление антител к бактериальным микроорганизмам в аутосыворотках методом радиального гемолиза (МРГ) в реакции радиального гемолиза (РРГ), т.е, косвенное определение этиологической значимости выявленных патогенов по наличию аутоантител в испытуемых сыворотках к соответствующим антигенам с определением соответствия титров в РА диаметру зоны гемолиза в миллиметрах.
С этой целью в опыт были взяты известные антигены с антисыворотками к ним. Выявлено следующее соответствие для антисывороток.
Исходя из вышеизложенного применением МРГ возможно определение бактериального антигена по антисывороткам к ним, что полагает возможность детекции антигена ("некультивируемо-го") по сероконверсии в парных сыворотках от больных.
Метод обладает определенными преимуществами: МРГ не зависит от ингибиторов, более прост в постановке и экономичен во времени, так как исключает необходимость раститровки испытуе-
мых сывороток, освобождения от ингибиторов.
Использованием иммунопластин в РРГ возможно применение данного метода для исследований и в полевых условиях в экстренных эпидемиологических ситуациях с использованием готовых иммунопластин.
Отработанный метод требует расширения спектра бактериальных антигенов для составления таблиц соответствия титров антител в РА и зон гемолиза в РРГ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бехало В.А., Бондаренко В.М., Сысолятина Е.В., Нагурская
E.В. Иммунологические особенности бактериальных клеток медицинских биопленок // ЖМЭИ, 2010, №4, с.97-104.
2. Пахомов Ю.Д., Блинкова Л.П., Дмитриева О.В., Стоянова Л.Г. Особенности динамики роста и образования некультивируемых форм у Lactococcus Lactis // ЖМЭИ, 2013, №3, с.92-96
3. Емцев В.Т., Мишустина Е.Н. Морфология и ультраструктура клеток бактерий. Другие "покоящиеся формы // Микробиология, М.: Юрайт, 2014, с.3-432.
4. Поздеев О.К. Покоящиеся (некультивируемые) формы бактерий // Медицинская микробиология М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010, с.7-736; с.79-80.
5. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология / Под ред. А.А.Воробьева. М.: МИА, 2008, с.14-695. "Критерии этиологической значимости выделенной чистой культуры" с.670-671.
6. Schild G.C., Pereira H.G, Rothwell D., Berryman J.L. Procеeding of the International Conference on Standardization of Diagnostic Materials. Atlanta, Georgia: Center for Disease Control, p.243.
SUMMARY
About serodiagnosis of bacterial infections method of radial hemolysis
F.Sadikhova, R.Mamedbekova, N.Mutalibova, S.Kerimov, E.Dadashev
A.Aliyev's Azerbatjan State Physicians Improvement Institute, S. Imamaliev's Republican Antiplague Station, Baku
The article presents the results of the development of the radial hemolysis (MRG) method for the detection of a bacterial (true) pathogen of the infectious process by the presence of autoantibodies in a diagnostic titer.
Поступила 23.04.2018
