CC BY
83
Оригинальные исследования
185
К ПРОБЛЕМЕ ЛИПИДНОГО КОДИРОВАНИЯ ГЕНОМНОЙ ДНК: ОСОБЕННОСТИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ КОМПЛЕКСОВ ДНК С ФОСФОЛИПИДОМ
Р.И. Жданов 1 г, Р.Х. Аюпов 1, Г.В. Андрианов 1, Н.И. Акберова 1, М.Я. Ибрагимова 1
1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
2 Московский государственный гуманитарный университет им. М.А. Шолохова, Москва, Россия
Оп the problem of lipid coding of genomic DNA: molecular dynamics peculiarities of DNA-phospholipid complexes
R.I. Zhdanov12, RKh. Aupov1, G.V. Andrianov1, N.I. Akberova 1, M.Ya. Ibragimova 1
1 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
2 MA. Sholokhov Moscow State University for the Humanities, Moscow, Russia
Липиды могут специфически связываться с нуклеиновыми кислотами, образуя в геномной ДНК кодовую последовательность и участвуя в реализации языка генома. Методом молекулярной динамики изучено взаимодействие олигонуклеотида ДНК (dA)20-(T)20 с фосфатидилэтанола-мином. Комплекс получен в ходе молекулярного докинга, и липид располагается в малой бороздке ДНК, энергия связывания комплекса равна 6,3 ккал/моль. Показано образование водородных связей, взаимодействий, предшествующих подобным связям, и ряда других взаимодействий между фосфолипидом и ДНК. В ходе молекулярной динамики количество подобных взаимодействий колеблется от 175 до 337. Основную роль в стабилизации комплекса ДНК-фосфолипид, наряду с водородными связями, играют ван-дер-ваальсовы и гидрофобные взаимодействия. Показана роль этаноламинной группы на комплексообразование фосфолипида с ДНК.
Ключевые слова: олигонуклеотиды ДНК, фосфати-дилэтаноламин, ДНК-липидные взаимодействия, докинг, молекулярная динамика, межатомные расстояния.
Хотя липидомика активно развивается в масштабных проектах [1—4], исследованию фосфолипидов клеточного ядра, в частности, ДНК-связанным липидам, в них уделяется недостаточно внимания [5]. Вместе с тем, существуют фракции фосфолипидов, прочно связанные с геномной ДНК [6, 7], которые связываются с ДНК сиквенс-специфично [8]. Предполагается, что такие липиды могут образовывать в геномной ДНК новый информационный уровень [9]. ДНК-мембранные и ДНК-липидные взаимодействия и комплексы [10] реализуются в ДНК-мембранных контактах, контактах Байера прокариот, в хроматине эукариот, располагающемся на внутренней ядерной мембране вокруг ядерных пор, при передаче сигнала, а также в митохондриях [11]. В частности, было обнаружено, что ДНК-связанные липиды Shigella sonnei (термолабильный штамм) содержат как нейтральные липиды (0,92 вес.% от массы сухих клеток (мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, ММСК), так и фосфолипиды (0,14 вес.% от ММСК), причем фосфолипиды этих бактерий представлены кардиолипином и фосфатидилэтано-ламином (ФЭ) [12]. Нами были проведены компьютерные вычисления в рамках подхода молекулярной механики для оценки стабильности комплексов ДНК с олеиновой и других С18 жирных кислот в малой или большой бороздках [13, 14]. Из этих результатов и по данным компьютерных экспериментов методом молекулярного докинга [15] следует, что наиболее стабильны комплексы ДНК с жирными кислотами
Lipids can be bound to nucleic acids forming coding sequence at genomic DNA, and participating in realization of language of genome. Interaction of DNA oligonucleotide(A)20-(T)20 is studied with by moleculat dynamics method. The complex is prepared as a result of molecular docking, phospholipid molecule being located at DNA minor groove. Binding energy is equal to — 6.3 kcal/mol. Formation of hydrogen binding, interactions leading to those bonds, and some other interactions between DNA and phospholipid. The number of those interactions due to molecular dynamics is varied between 175 and 337. The key role in stabilization of DNA-phospholipid complex play also van-der-vaals and hydrophobic interactions along with hydrogen binding. The role of ethanolamine grouping in complexation between DNA and phospholipid is demonstrated.
Key words: DNA oligonucalotides, phosphatidyl-
ethanolamine, DNA-lipid interactions, docking, molecular dynamics, interatomic distances.
в малой бороздке. Такой же результат был получен при исследовании молекулярной динамики и свободной энергии связывания ДНК с линолевой кислотой [16, 17]. Целью данной работы является исследование взаимодействия ФЭ с олигонулеотидом ДНК (A)20-(T)20 методами докинга и молекулярной динамики. Впервые для комплексов ДНК-фосфолипид нами показано, что связывание обоих жирнокислотных остатков по малой бороздке приводит к стабилизации комплекса. Обнаружено, в частности, образование водородной связи между ФЭ и пиримидиновым кольцом.
Материал и методы
Структура лигандов и комплексов для расчетов. Данные о строении ФЭ с двумя остатками линолевой кислоты (нейтральная форма) были получены из базы данных HIC-Up [18], а его структура построена с помощью редактора молекул Avogadro. Структура двухцепочечного олигонуклеотида, состоящего из 20 A-T пар (dA)20-(dT)20, была сгенерирована с помощью утилиты NAB из пакета программ AmberTools (Case et al., AMBER 11, University of California, San Francisco, 2010). Координаты атомов комплексов даны в соответствии с принятыми в номенклатуре.
Молекулярный докинг. Для выявления энергетически выгодного положения фосфолипида ФЭ в бороздках ДНК и для получения начальных структур комплексов был проведен молекулярный докинг
е-mail: [email protected]
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
186
Оригинальные исследования
ФЭ в ДНК (в их кристаллографических конфигурациях) с помощью программы AutoDock c приложением vina.exe [19].
Молекулярная динамика. Комплекс был растворен в прямоугольной ячейке периодичности с использованием Т1Р3Р-модели молекул воды, так, чтобы расстояние между периодическими образами комплекса составляло не менее 15 А. Для обеспечения электронейтральности системы было добавлено необходимое количество ионов натрия. Для получения структуры была выполнена минимизация энергии с помощью метода сопряженных градиентов в программе NAMD [20]. Траекторию молекулярной динамики рассчитывали с помощью программного пакета NAMD как описано ранее [16]. При генерировании структуры ДНК использовали параметры силового поля AMBER99 [21]. Для характеризации лигандов применяли параметры GAFF [General Amber Force Field) c зарядами AM1-BCC как было использовано ранее [16]. Длины связей были фиксированы с помощью алгоритма SHAKE, что позволило использовать шаг расчета траектории, равный 2 фс. Все траектории рассчитывались для температуры 300 К. Перед расчетом свободной энергии связывания и сбором параметров система была приведена к равновесию в течение 200 пс. Полученные траектории анализировали с помощью программного пакета VMD, а также дополнительных скриптов, написанных на языке Python. При анализе нековалентных контактов между атомами жирных кислот и олигонуклеотида, рассматривали атомы, расстояние между которыми не превышало 3,4 А.
Результаты
Ранние работы по изучению взаимодействия ДНК и олеиновой кислоты подтвердили лишь сам факт комплексообразования [13, 14]. Связывание олеиновой кислоты по малой бороздке ДНК было нами показано как методами спектроскопии [8], так и с помощью компьютерного моделирования [14]. Взаимодействие фосфолипидов с ДНК ранее методами молекулярной динамики и докинга не изучалось. В наших компьютерных экспериментах результатом докинга молекулы ФЭ с олигомером ДНК [dA)20-[T)20 (см.раздел методы) стало перемещение ФЭ из большой [стартовое положение) в малую бороздку ДНК, причем энергия связи равняется 6,3 ккал/моль. На рис. 1 приведена структура В-формы олигомера ДНК с молекулой ФЭ в малой бороздке ДНК, полученная в результате докинга. Мы рассчитали траектории атомов в комплексе ФЭ с двумя остатками линолевой кислоты с олигомером ДНК методами молекулярной динамики как было описано ранее в работах для комплексов ДНК с линолевой кислотой [16]. На рис. 2 представлены результаты изменения среднеквадратичного отклонения координат структур (RMSD) ^ временем. Поскольку в значениях параметра RMSD для ФЭ не наблюдаются существенные изменения, вклад в колебания значения RMSD для ДНК могут вносить и участки, не связанные с фосфолипидом. При оптимизации динамики комплекса ФЭ и [dA)204T)20 ДНК было рассчитано количество пар атомов, расстояние между которыми меньше 3,4 А [при 700 сохраненном шаге), их оказалось 198 пар атомов. Интерес представляют следующие группы пар атомов [в скобках указано количество обнаруженных пар): O и
H [33 пары), N и Н [9 пар), O и O [1 пара), N и N [0 пар), O и С [1 пара), N и C [0 пар), O и N [0 пар), а также возможные пары с P [1 пара P и H); всего 45 пар атомов [рис. 3А). Анализ последнего шага динамики показал следующий результат: было обнаружено 248 пар атомов, расстояние между которыми меньше 3,4 А. Среди них 48 представляет интерес: O и H [36 пар), N и Н [7 пар), O и O [3 пары), N и C [1 пара), с P [1 пара P и H). На рис. 3Б представлен диапазон этих расстояний. Изменения расстояний между парами атомов, расстояния между которыми на 700 шаге динамики были меньше 3,4 А, представлены на рис. 4. Было подсчитано также число межатомных взаимодействий, т.е. количество пар атомов, расстояние между которыми в ходе динамики было меньше 3,4 А [рис. 5).
Рис. 1.
Структура олигомера ДНК (dA)20^(T)20 с молекулой фосфатидилэтаноламина в малой бороздке в качестве лиганда
Рис 2. Изменение среднеквадратичного отклонения координат структур (RMSD) молекулы и лиганда в комплексе ДНК (dA)20^(T^20 и ФЭ на каждом сохраненном шаге динамики.
По X — шаг динамики, по Y — изменение в А (см. раздел «Материал и методы»)
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
Оригинальные исследования
187
А Б
Рис. 3. Расстояния между парами атомов:
А — между 45 парами атомов, представляющими интерес, на 700 сохраненный шаг; Б — диапазон расстояний между интересующими парами атомов в конце динамики
Рис. 4. Изменение расстояний между парами атомов, которые на 700 шаге динамики были меньше 3,4 А. Оси X — шаг динамики, ось Y — расстояние между парами атомов в А.
Рис. 5. Количество пар атомов (число межатомных взаимодействий), расстояние между которыми меньше 3,4 А, в ходе молекулярной динамики
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
188
Оригинальные исследования
Наибольшее количество таких пар атомов оказалось на 39 сохраненный шаг динамики, а именно, 337 пар атомов. Наименьшее число межатомных взаимодействий пришлось на 1221 сохраненный шаг динамики — 175 пар атомов. Было выявлено 10 пар атомов, расстояние между которыми меньше 3,4 А и на первом и на последнем сохраненных шагах динамики.
Для анализа взаимной ориентации молекул в комплексе ДНК — ФЭ нами были выбраны шесть пар атомов ДНК и ФЭ (рис. 6). Из данных рис. 6 следует, что координаты пары O4'(166)-H4(1331) сильно колеблются и, по-видимому, она могла оказаться в этой выборке случайно (так как необходимое между ними расстояние, меньше 3,4 А, наблюдается несколько раз в начале и в конце динамики). Из рис. 7 показано, что атом водорода (LIG41:H46) липида расположен между двумя атомами ДНК: атомом азо-
та (DA8:N3) (среднее расстояние по всей динамике 3,3 А) и атомом кислорода (DT34:O2) (2,6 А). При этом из данных рис. 7 следует, что атом водорода липида расположен ближе к кислороду, вследствие большей его электроотрицательности по сравнению с атомом азота. Подобное соперничество за кислород липида (LIG41:O2) наблюдается между водородом (DA9:H1') (3,1 А) и водородом (DA10:H5'1) (3,7 А), и в этом случае координируется атом водорода (DA9:H1') вследствие большей свободы колебаний (кольцо дезоксирибозы), а не атом водорода (DA10:H5'1), связанный со скелетом ДНК. Следует отметить, что в конце динамики картина начинает меняться: расстояние между водородом (DA10:H5'1) и кислородом (LIG41:O2) становится короче, а водородом (DA9:H1') и кислородом (LIG41:O2) увеличивается. Возможно, при более длительной динамике можно было бы увидеть сдвиги атомов.
Рис. 6. Изменение расстояний между парами атомов в ходе динамики, расстояние между которыми были меньше 3,4 А в первом и последнем шаге динамики
Рис. 7.
Структура комплекса олигомера ДНК и ФЭ (нейтральная форма). Ориентация цепи ДНК изменена для обеспечения лучшего угла обзора комплекса
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
Оригинальные исследования
189
Обсуждение
Результаты изучения молекулярной динамики указывают на то, что этот комплекс является устойчивой структурой, причем динамика комплекса ФЭ-ДНК характеризуется невысокой конформационной подвижностью лиганда ФЭ в ДНК. Основным объяснением этому, по-видимому, является тот факт, что фосфолипид связан с молекулой ДНК двумя остатками жирных кислот.
Энергия связи ФЭ в малой бороздке олигодезо-ксирибонуклеотида (A)20-(T)20 равняется — 6,3 ккал/ моль. Структура комплекса ДНК с молекулой ФЭ в малой бороздке (см. рис. 1) получена впервые, не имеет аналогов в литературе, и представляет собой первый пример структуры молекулярных комплексов ДНК и фосфолипида. До компьютерного эксперимента можно было представить три альтернативных расположения ФЭ в двойной спирали ДНК: в большой бороздке, либо в малой бороздке или по одному жирнокислотному остатку в малой и в большой бороздках. Минимизация энергии комплекса ДНК-ФЭ показала, что в структуре с минимальной энергией оба остатка линолевой кислоты располагаются в малой бороздке (см. рис. 1). Хотя в значениях параметра RMSD для молекулы ФЭ в комплексе ДНК-ФЭ не наблюдаются значительные изменения, тем не менее имеются участки, в которых существуют симметричные изменения величин RMSD ДНК и ФЭ: так, на 1270 шаг приходится спад кривой этого параметра для ДНК (1 А), причем для липида величина такого падения небольшая (0,2 А) (см. рис. 2).
Количество и типы взаимодействующих атомов на начальных и конечных шагах динамики отражают переход структур к более стабильному комплексу, от 198 до 248 пар атомов, максимум в промежуточных шагах равен 337. Качественный анализ показывает увеличение числа O-H пар. Стоит отметить, что расстояния между парами атомов ДНК и ФЭ на начальных шагах динамики претерпевают изменение в ходе всей динамики (см. рис. 4). Несмотря на это, некоторые пары атомов колеблются в незначительных диапазонах в течение всей динамики (см. рис. 6).
Взаимодействия жирных кислот (нейтральной и анионной формы линолевой и олеиновой кислот) [16, 22] и ФЭ (рис. 8) с ДНК были проанализированы по реперным точкам. Результаты показали, что вследствие наличия у ФЭ двух жирных кислот, расстояние между атомами его жирных кислот и атомами ДНК снижаются более, чем на 2 ангстрема, по сравнению со свободными жирными кислотами. Предположительно это объясняется именно наличием у ФЭ двух жирнокислотных остатков, связанных через остов глицерофосфата. Однако, у данного взаимодействия есть и недостаток: наличие у фосфолипида этаноламинной полярной группы приводит к увеличению расстояний между атомами кислорода (проанализирован лишь один кислород) сложноэфирной связи и атомом кислорода остатка фосфорной кислоты при тимидине (34-й остаток). При взаимодействии свободной жирной кислоты расстояние между схожими в пространстве атомами жирной кислоты и ДНК меньше более, чем на 2,5 ангстрема. Это объясняется стерическими препятствиями, создаваемыми этаноламинной группой, то есть близкий контакт гидрофильной головки липида осложнен
этаноламином, в то время как гидрофобные хвосты наоборот плотно взаимодействуют с ДНК. Полярная группа ФЭ-этаноламин тоже взаимодействует с ДНК, на рисунке 8 отмечено, что расстояние между водородом этой группы и атомом кислорода остатка фосфорной кислоты тимина (35 остаток) равно 1,7 А. Как и в случае взаимодействия ДНК с жирными кислотами [16, 22], в компьютерных экспериментах с комплексом ДНК с ФЭ мы подтвердили вклад не только водородных связей, но и ван-дер-ваальсовых и гидрофобных взаимодействий, в стабилизации комплекса ДНК-ФЭ. Участие двух последних типов взаимодействий было предположено ранее при изучении комплексообразования нуклеиновых кислот с липидными монослоями [23].
Рис. 8.
Структура комплекса жирных кислот и ФЭ, взаимодействующих с ДНК
Таким образом, при изучении структурных особенностей комплексов ДНК с ФЭ и другими фосфолипидами, которые были обнаружены в надмолекулярных комплексах ДНК [24, 25], могут стать понятны принципы липидного кодирования геномной ДНК, структурные особенности комплексов ДНК с липидами и их роль в экспрессии. С учетом этой информации может стать возможным создание новых типов лекарственных препаратов, связывающихся с ДНК [26]. Полученные нами впервые результаты позволяют предсказать взаимодействие ДНК с молекулой фосфатидилэтаноламина по малой бороздке ДНК в водных растворах; эти данные дополняют и развивают результаты предыдущих работ.
Впервые определены структурные параметры комплекса фосфолипида с ДНК, объяснены отличия по сравнению с взаимодействием ДНК со свободной жирной кислотой. Показаны особенности расположения молекулы фосфатидилэтаноламина в малой бороздке ДНК, исходя из структурных особенностей этой молекулы.
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
190
Оригинальные исследования
Благодарности
Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере
ЛИТЕРАТУРА:
1. Bischoff G., Zhdanov R.I. Lipidomic — lipids take part in complexity of human genome. Chem. Ingen. Tech. 2002; 74 (5): 714.
2. Lagarde M., Geloen A., Record M. et al. Lipidomics is emerging. Biochim. Biophys. Acta. 2003; 1634: 61.
3. Wenk M.R. The emerging field of lipidomics. Nat. Rev. 2005; 4: 594-610.
4. Carvalho M., Sampaio J.L., Palm W. et al. Effects of diet and development on the Drosophila lipidome. J. Molecular Syst. Biol., 2012; 8 (1): 600-5.
5. Albi E., Magni M.P. The role of intranuclear lipids. Biol. Cell. 2004; 96 (8): 657-67.
6. Struchkov V.A., Strazhevskaya N.B., Zhdanov R.I. Specific natural DNA-bound lipids in post-genome era. The lipid conception of chromatin organization. Bioelectrochem. 2002; 56 (1-2): 195-8.
7. Zhdanov R.I., Shmyrina A.S., Zarubina T.V. et al. Nature of DNA-bound fatty acids in Pseudomonas aurantiaca. FEMS Microbiol. Lett. 2006; 265: 151-8.
8. Zhdanov R.I., Strazhevskaya N.B., Jdanov A.R. et al. A Spectroscopic and surface plasmon resonance study of oleic acid/DNA complexes. J. Biomol. Str. Dynamics. 2002; 20 (2): 231—241.
9. Zhdanov R.I., Ibragimova M.Y. New informational level at genomic DNA: lipids specifically bound to DNA. Genetics and Chemistry Sharing a Language of Discovery: Cell Symposium series, May 23-25, 2012, Boston, USA. Book of abstracts 2012; 29.
10. Hianik T., Zhdanov R.I., editors. Special issue devoted to lipid-nucleic acid interactions and complexes. Bioelectrochem. 2002; 58
(1): 121 pp.
11. Struchkov V.A., Strazhevskaya N.B., Zhdanov R.I. DNA-bound lipids of normal and tumor cells: retrospective and outlooks for functional genomics. Bioelectrochem. 2002; 58 (1): 23-30.
12. Шепелев А.П., Шестопалов А.В., Рындич А.А. и др. Связанные с ДНК липиды терморезистентных и термолабильных штаммов Shigella sonnei. Бюллет. Эксп. Биол. Мед. 1995; 120(2): 332-33.
13. Жданов Р.И., Дьячков Е.П., Стручков В.А. и др. ДНК-связанные липиды: компьютерное моделирование взаимодействия ДНК со стеариновой и ненасыщенными кислотами. Изв. Акад. Наук. Сер.хим. 2003; 52 (9): 1794-800.
14. Жданов Р.И., Е.П. Дьячков, Стражевская Н.Б. и др. Структура и стабильность комплексов олигомеров ДНК и жирными кис-
научной деятельности, а также поддержана грантом РФФИ № 12-03-97089-р_поволжье. Р.И.Ж. — реципиент гранта Фонда им. А. фон Гумбольдта (Бонн, Германия).
лотами согласно данным молекулярной механики. Докл. Акад.наук. 2003; 390 (4): 548-52.
15. Дьячков Е.П., Ибрагимова М.Я., Дьячков П.Н. и др. Исследование взаимодействия ДНК с жирными кислотами методом молекулярного докинга. Ученые записки Казанского Университета. Серия Естеств. Науки 2011; 153(1): 86-96.
16. Тарасов Д.С., Ибрагимова М.Я., Изотова Е.Д. и др. Молекулярная динамика и свободная энергия связывания линолевой кислоты с ДНК в водном растворе. Доклады Акад. Наук. 2012; 446 (2): 226-31.
17. Ibragimova M.Y., Akberova N.I., Tarasov D.S. et al. Fatty acid regulation of gene expression: bioinformatics view to structure and dynamics of DNA-fatty acid complexation FEBS J. 2013; 280 (Supl.1): 560.
18. Kleywegt G.J. Acta Cryst. 2007; D63: 94-100 (CCP4 Proceedings).
19. Trott О., Olson A.J. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading. J. Comp. Chem. 2010; 31: 455-61.
20. Phillips J.C., Braun R., Wang W. et al. Scalable molecular dynamics with NAMD. J. Comput. Chem. 2005; 26: 1781-1802.
21. Wang J., Wolf R.M., Caldwell J.W. et al. Development and testing of a general amber force field. J. Comput. Chem. 2004; 25: 1157-74.
22. Жданов Р.И., Тарасов Д.С., Изотова Е. и др. Особенности комплексообразования ДНК с олеиновой кислотой по данным молекулярной динамики и спектров ЯМР. Докл. Акад. Наук 2015. [в печати].
23. Michanek A., Yanez M., Wacklin H. et al. RNA and DNA association to
zwitterionic and charged monolayers at the air-liquid interface. Langmur. 2012; 28 (25): 9621-33.
24. Жданов Р.И., Лоренц В., Керн Д. и др. Жирнокислотный состав ДНК^вязанных липидов Pseudomonas aurantiaca по данным масс-спектрометрии. Цитология 2014; 56 (6): 437-8.
25. Жданов Р.И., Керн Д., Лоренц В. и др. Жирнокислотный и липидный профиль ДНК-связанных липидов Pseudomonas aurantiaca по данным масс-спектрометрии. Микробиология 2014; 84(1): 50-7.
26. Bischoff G., Hoffmann S., Zhdanov R. DNA binding of drugs in medicinal therapies. Frount. Med. Chem. 2004; 1: 619-54.
Поступила 16.09.2014
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
