CC BY
9
б системах обучения и повышения квалификации санитарных врачей с целью выработки критического и максимально осознанного подхода к излишне подчеркиваемым достоинствам и нередко замалчиваемым недостаткам биотестирования.
Литература
1. Альтернативные методы исследований (экспресс-методы) для токсиколого-гигиенической оценки материалов, изделий и объектов окружающей среды /Под ред. Л. Г. Подуновой. — М., 1999.
2. Грушко Я. М. Вредные неорганические соединения в промышленных сточных водах. — Л., 1979.
3. Грушко Я. М. Вредные органические соединения в промышленных сточных водах: Справочник. — Л., 1982.
4. Еропкин М. Ю. //Токсиколог, вестн. — 1999. — № 5. - С. 7-13.
5. Жмур Н. С. // Там же. - № 3. - С. 7-13.
6. Захарченко М. П., Ткачук С. М., Яковлева Л. Е. и др. // Гиг. и сан. - 1994. — № 9. - М. 3-4.
7. Иванова Л. А., Там акын 10. Н., Коршун М. П., Савченко М. В. // Там же. - 1991. - № 11. - С. 66-67.
8. Каюмов Р. И., Еськов А. П. Экспресс-оценка общей острой токсичности методом in vitro с использова-
нием спермы быка в качестве клеточного тест-объекта. - М., 1997.
9. Лукьянов А. С., Лукьянова Л. Л., Чернавская Я. М.у Гилязов С. Ф. Биоэтика. Альтернативы экспериментам на животных. — М., 1996.
11. Методические рекомендации по применению биотестирования для оценки качества воды в системах хозяйственно-питьевого водоснабжения MP № ЦОС ПВ Р 005-95. - М., 1995.
12. Пожаров А. В., Рахманин Ю. А., Шелемотов С. А Михайлова Р. И. // Гиг. и сан. — 1994. — № 8. — С. 18-21.
13. Сергеева М. Г., Туржова Е. Б. // Гиг. и сан. — 1992. - № 5-6. - С. 71-72.
14. Сидорин Г. И., Фролова А. Д., Луковникова Л. В. // Тезисы докл. 1-го съезда токсикологов России. — М., 1998. - С. 317.
15. Туржова Е. Б., Сороколетова Е. Ф.} Попов В. Б., Архангельская И. Б. // Гиг. и сан. — 1993. — № 3. — С. 63-64.
16. Филенко О. Ф. // Водные ресурсы. — 1985. — N 3. — С. 130-134.
17. Этлин С. Лахонина Г\ М., Ирлина И. С. и др. // Гиг. и сан. - 1987. - № 9. - С. 80-82.
18. Canadian Water Quality Guidelines. — Ottawa, Ontario,
1989.
Поступила 25.02.2000
© Г. П. КАШКАРОВА, А. И. ДОРОДНИКОВ, 2000 УДК 613.31:579.68]-07
Г. П. Кашкарова, А. И. Дородников
К МЕТОДУ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИ-ФАГОВ В ПИТЬЕВОЙ ВОДЕ
Аналитический центр контроля качества воды ЗАО "Роса", Москва
Отдел биологических методов анализа Аналитического центра контроля качества воды ЗАО "Роса" проводит систематические исследования воды на коли-фаги с мая 1994 г. За прошедший период исследовано более 4 тыс. проб по методикам, рекомендованным лля природных и питьевых вод (MP 2885-81, MP № 15-6/27 от 16.09.91, № 01-19/12-13 от 11.09.92).
С сентября 1997 г. отдел работает по внедряемым МУК 4.2.671—97 [9], предусматривающим принципиальные методические изменения при определении коли-фа-гов в сравнении с рекомендованными ранее методами. В данной статье мы излагаем опыт, накопленный при работе с новым документом.
Для обнаружения коли-фагов в МУК 4.2.67J—97 [9] предлагается использовать 2 методики: основную — тит-рационного обогащения и ускоренную — прямого посева. Предлагаемый титрационный (НВЧ) метод включает в себя 3 этапа: инкубацию 6 объемов анализируемой воды с культурой Escherichia coli и питательным бульоном, бактериальную деконтаминацию хлороформом и высев на питательный агар для визуального обнаружения зон лизиса бактериального газона.
В отличие от предыдущих методов анализа питьевой воды [5, 6] объем пробы уменьшился в 10 раз и соответствует нормативному — 100 мл [12]. Количество объемов НВЧ увеличилось на 1, но общее количество чашек Петри с питательным агаром уменьшено в 5 раз, так как капли бульона теперь наносятся непосредственно на поверхность питательного агара. Изменен тип бактериальной культуры-хозяина — Е. coli F~ на Е. coli KI2F+. В результате титрационный метод оказался более удобным в исполнении, менее трудоемким и требующим меньшего расхода питательных сред.
Вместе с тем мы столкнулись с тем, что капли, нанесенные на сектора подсушенного агара, растекались, вызывая неупорядоченный лизис, что затрудняло количественный учет коли-фагов. Было проведено сравнение
капельного способа с посевом продольным штрихом бактериологической петлей. В табл. 1 представлены качественные преимущества посева продольным штрихом в сравнении с капельным способом.
Количественная оценка [1] сравнения различных способов посева показала (табл. 2), что при посеве каплями в 60% проб количественный учет оказался невозможным из-за сливного лизиса. Наличие посторонней микрофлоры отмечалось примерно с равной частотой — 21 и 31% соответственно, реже при посеве штрихом. Лабораторный совет ГСЦЭН Минздрава РФ счел целесообразным использовать в титрационном методе высев продольным штрихом [2].
Несомненным достоинством прямого (экстренного) метода являются простота и относительно быстрый ответ анализа. Более того, как показала практика работы по
Таблица 1
Учет результатов при посеве продольным штрихом и каплями
Сравнивае-
мые пара- Продольный штрих Капля
метры
Форма зоны лизиса
Расположение зоны лизиса
Учет "стертого" лизиса (отсутствие бляшек)
Потребность в материалах
Полоса шириной 3— 20 мм и длиной 30— 40 мм
Зона лизиса привязана к определенному сектору
П р о с м атр и ва юте я границы между зоной "стертого" лизиса и зоной неинфициро-ванного роста Е. coli
Чашка Петри — 1 шт. (6 секторов)
От овальной бляшки диаметром 10—15 мм до бесформенного лизиса, захватывающего все сектора
При бесформенном лизисе соотнести с определенным сектором невозможно
Учет затруднен из-за нело-кализованного характера "стертого" лизиса
Чашки Петри — 6 штук, пипетки — 6 штук
МУК, предварительный учет результатов в прямом посеве возможен уже через 4—5 ч инкубации. Методические сложности возникали при попытке, как это рекомендуется, смешать в чашке Петри 20 мл питьевой воды и 30 мл охлажденного до 45°С 2% питательного агара. Выполняя это условие, трудно получить гомогенную смесь, вследствие чего содержимое чашки застывает неоднородно. Из-за несвязанной воды агар при переворачивании выскальзывает из чашки Петри. Обильный конденсат, образующийся при инкубации неперевернутой чашки, и неоднородно застывший агар приводят к неравномерному росту газона Е. coli, что делает визуальный учет лизиса практически невозможным.
Приемлемое качество посевов достигалось при снижении объема воды до 10 мл на 1 чашку, хорошее — до 5 мл. На пробу в этом случае требуется 10 (20) чашек Петри диаметром 90 мм. Как нам кажется, это не идеальное, но необходимое для получения считываемых результатов решение. Стандарт ISO 8199:1988, определяющий общие требования к проведению количественного учета микроорганизмов, в подобных случаях рассматривает как максимальный объем .5 мл [13]. Но 20 чашек — нереальный вариант для широкого практического использования.
Методические документы рекомендуют различные штаммы бактерий-хозяина для определения кол и-фагов, не указывая причину выбора того или иного типа кишечной палочки. Так, МУ № 2285—81 [8] предлагают использовать штамм Е. coli, выделенный из контролируемого водоема, методические рекомендации от 1986 г. — культуры Е. coli В-АТСС 11303, Adams [4], MP от 16.09.91 91 № 15-6/27 и MP от 11.09.92 № 01-19/12-13 (для питьевой воды) - Е. coli В [5, 6], МУК 4.2.671-97 -
штамм Е. coli K12F+, информационно-методическое
письмо к СанПиН 2.1.4.559—96 — Е. coli K12F+ стрепто-мицинрезистентный [10].
В международном методе обнаружения бактериофагов штамм Е. coli K12F+ рекомендован для контроля степени чувствительности штамма Stm 49 F+ к РНК-овым F-специфическим бактериофагам [14].
МУК 4.2.671—97 предусматривают проверку культуры Е. coli на отсутствие лизогении путем прямого внесения бактериальной взвеси в питательный агар. Учитывая, что основой анализа является методика титрацион-ного обогащения, мы с каждой серией проб дополнительно ставили отрицательный контроль процедуры анализа в целом. Для этого пробирку со стерильной водопроводной водой (10 мл) подвергали анализу методом обогащения аналогично пробиркам с натуральной водой. По нашему мнению, проведение подобного контроля позволяет с большей надежностью исключать контами-национный лизис (связанный с неадекватно проводимыми манипуляциями или загрязнением посуды, хлороформа, субкультур и питательных сред), а также спонтанный лизис культуры Е. coli F+, обладающей новыми
Таблица 2
Сравнение эффективности выделения коли-фагов при высеве обогащенных проб воды продольным штрихом и каплями
Способ высева Всего проб Число положительных проб Процент выделения фага Процент проб, в которых количественный учет невозможен Всего исследовано объемов (секторов) Процент обнаружения посторонней микрофлоры
Посев
петлей 53 28 53 2 318 21
Посев
каплей 53 28 53 60 318 31
Статистическая достоверность различий по критерию t Стыо-дента (при р = 0,01, '>2,5)
Различие су
щественно
(/=8,20)
Различие
существен
но
(/ = 2,89)
генетическими свойствами, подвергающейся пассажам и воздействию хлороформа в ходе анализа.
В целом необходимо подчеркнуть, что международный и зарубежные методы обнаружения РНК-овых F-специфических бактериофагов и соматических коли-фагов существенно отличаются от методик МУК 4.2.671 — 97. В частности, стандарты ISO предъявляют жесткие требования к содержанию и контролю тест-культур для обеспечения стабильности их свойств. Пересевы замороженных рабочих тест-культур ведутся только в пределах одной серии проб. Все операции проводятся с различными для соматических коли-фагов и РНК-овых F-специ-фических бактериофагов типами Е. coli, в обязательном порядке осуществляется контроль чувствительности к инфекции специфическим фагом и т. д. [14, 15]. Следует отметить, что требования стандартов ISO по ведению тест-культур в основных позициях согласуются с рекомендациями ГИСК им. Л. А. Тарасевича [3].
Упомянутые стандарты ISO [14, 15] предусматривают стандартные прописи питательных сред для обнаружения соматических и РНК-овых Р+-бактериофагов, обеспечивая таким образом единые условия развития. В связи с особенностью настоящего времени методические указания предлагают более свободный подход в выборе питательных сред, поэтому вопрос работы на единых, разработанных специально для выделения бактериофагов питательных средах остается открытым.
Рабочая программа контроля качества питьевой воды предполагает определение коли-фагов и в исходной воде
[7]. Для исследования водоисточников "Методические указания по внедрению и применению СанПин 2.1.4.559—96" предлагают руководствоваться "Методическими указаниями по санитарно-микробиологическому контролю поверхностных водоемов" 1981 г. № 2285—81
[8]. Различие предлагаемых практике методик обнаружения, размерности показателя и культур хозяина осложняет сопоставление результатов исследования питьевой воды и воды водоисточника. Основу анализа питьевой воды составляет методика обогащения [9], речной — прямой посев [8]. Питьевая вода исследуется в нормируемом объеме — 100 мл, водоисточника — 3 мл с последующим пересчетом результата на 1000 мл. Анализируемый по МУ 1981 г. объем не соотносится с нормативом коли-фагов — 100 БОЕ/л [8, 11], так как позволяет обнаружить только 333 БОЕ/л и более.
Избежать этих разночтений можно, сочетая схему анализа методических рекомендаций 1991 и 1992 гг. [5, 6] и ход исследования по МУК 4.2.671—97, т. е. одновременный анализ исследуемой воды прямым (4 объема по 5 мл) и титрационным (100 мл) методами.
В доступных методических документах характеристика зон лизиса и ее дифференциальная диагностика дается в очень сжатой форме. В идеальном случае зоны лизиса в проходящем свете обычно выглядят (за счет отсутствия газона Е. coli) прозрачными пятнами питательного агара. Лизис стрептомицинрезистентной культуры Е. coli
K12F+ практически всегда выглядел не прозрачным, а
%
мутным пятном. В целом при посеве методом агаровых слоев фаги проявляются в виде негативных круглых бляшек разных размеров и морфологической структуры. При посеве обогащенной пробы воды пипеткой бляшки имели круглую или произвольную форму, при посеве бактериологической петлей (штрихом) — прямоугольную, совпадающую с отечатком петли. Иногда картина лизиса спорная. Так, после высева обогащенной культуры отмечались случаи "стертого" лизиса, выглядевшего чуть менее мутным по сравнению с контролем, газоном культуры Е. coli, за счет роста клеток, устойчивых к инфекции. При прямом посеве отмечался лизис, маскируемый негомогенно застывшим агаром, а при исследовании воды источников — закрытый сопутствующей микрофлорой, устойчивой к хлороформу. И наоборот, капли конденсата, остаточные количества хлороформа и негомогенно застывший при прямом посеве агар приводят к
формированию участков газона Е. coli (или агара), визуально напоминающих лизис.
Во всех сомнительных случаях мы использовали методику подтверждения фаговой природы лизиса, изложенную в МР № 1 — 19/12—13 от 1992 г. Следуя этой методике, важно после обогащения выйти на разведение, дающее изолированные бляшки (около —6 при посеве 0,1 мл разведения), так как при высоких концентрациях фага картина лизиса может быть неоднозначной — возможен сплошной лизис (чистая поверхность агара либо с единичными колониями Е. coli, "ажурным" за счет слившихся негативных колоний фага или уже описанным — мутным — "стертым"). Чтобы сократить количество расходных материалов при том же количестве разведений мы использовали высев петлей на сектора питательного агара. Четкая локализованность лизиса позволяла сравнивать участки посева с окружающим газоном, что облегчало учет результатов. Лизис на любом из секторов расценивался как наличие фага.
В заключение следует сказать, что с выходом МУК 4.2.671—97 практическим лабораториям предложены методы обнаружения коли-фагов, выгодно отличающиеся от ранее разработанных методических документов. Очевидно, что широкое использование во всех регионах страны внедряемых методов обнаружения коли-фагов позволит получить обширную информацию для совершенствования практики контроля качества питьевой воды с использованием данного показателя и методического обеспечения норматива коли-фагов в питьевой воде.
Литература
1. Аишарин П. И., Воробьев Л. А. // Статистические методы в микробиологических исследованиях. — М., 1962.
2. Ежемесячный информационный бюллетень МЗ РФ, ФЦГСЭН. - 1998. - № 4 (61). - С. 20-23.
3. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. — М., 1980.
4. Методические рекомендации по контролю и оценке вирусного загрязнения объектов окружающей среды МЗ СССР 4146-86. - М., 1986.
5. Методические рекомендации по проведению эпидемиологического и санитарно-вирусологического надзора за качеством воды водоисточников, питьевой воды в системе водоснабжения с целью профилактики заболеваемости гепатитом А и другими кишечными вирусными инфекциями. МЗ РФ № 15-6/ 27 от 16.09.91 // Сборник важнейших официальных материалов по санитарным и противоэпидемическим вопросам. — М., 1994. — Т. 7.
6. Методические рекомендации по проведению эпидемиологического и санитарно-вирусологического надзора за качеством воды водоисточников, питьевой воды в системе водоснабжения с целью профилактики заболеваемости гепатитом А и другими кишечными вирусными инфекциями. МЗ РФ № 1-19/ 12-13 от 11.09.92. - М., 1992.
7. Методические указания по внедрению и применению санитарных правил и норм СанПиН 2.1.4.559-96 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества". МУ 2.1.4.682-97.- МЗ России. - М., 1997.
8. Методические указания по санитарно-микробиоло-гическому контролю поверхностных водоемов. № 2285-81. - МЗ СССР. - М., 1981.
9. Методы санитарно-микробиологического анализа питьевой воды. МУК 4.2.671-97. — МЗ России. — М., 1997.
10. О дополнительных мерах по осуществлению контроля качества питьевой воды по микробиологическим и паразитологическим показателям. Информационно-методическое письмо. Департамент Госсанэпиднадзора МЗ РФ 1100/1670-98-111. - М., 1998.
11. СанПиН охраны поверхностных вод от загрязнения. № 4630-88. МЗ СССР. - М., 1998.
12. СанПиН 2.1.4.559-96 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества" МЗ России. - М., 1996.
13. ISO 8199: 1988.
14. ISO 10705-1: 1995 (Е).
15. ISO/CD 10705-2: 1996.
Поступила 25.06.99
© С. Ф. ТЮТИ КОВ, А. 10. ГУРОВ, 2000 УДК 614.774-074]:599.73
С. Ф. Тютиков, А. 10. Гуров
МЕТОДИКА ЗООИНДИКАЦИИ МИКРОЭЛЕМЕНТНОГО СТАТУСА ТЕРРИТОРИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДИКИХ КОПЫТНЫХ
ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН, Балашиха
Наряду с экологическим мониторингом окружающей среды по уровням тяжелых металлов экологическая оценка микроэлементного статуса как крупных регионов, так и небольших по площади агропедоценозов в настоящее время становится неотъемлемой частью охраны природы и рационального природопользования [2, 3, 7, 8]. В отличие от тяжелых металлов микроэлементы обладают четко выраженной биологической ролью, обусловленной их участием в физиологических процессах растительного и животного организмов. В процессе интенсивного промышленного производства из агропедоценозов (почвенно-растительный комплекс полей, сенокосов и т. п.) выносится значительное количество подвижных форм микроэлементов, вследствие чего происходит обеднение угодий. Исходя из сказанного, можно констатировать, что оценка микроэлементов статуса хотя и сложное, но необходимое мероприятие, позволяющее адекватно судить о ситуации и дающее возможность выбора тех или иных путей ее улучшения. С этой точки зрения предлагаемая методика является частью региональ-
иого экологического мониторинга окружающей природной среды и одновременно практическим руководством в области интенсивного агропроизводства.
Сущность предлагаемого метода сводится к определению микроэлементов статуса территории региона посредством экологического мониторинга с использованием органов и тканей диких копытных [4), аналогичного мониторинга агропедоценоза с использованием сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот, овцы, свиньи) [5] и последующей интегральной оценки наблюдаемой ситуации. В случае кризисной оценки нами предлагается комплекс мероприятий, направленный на коррекцию микроэлементов статуса агропедоценоза в зависимости от степени экологического неблагополучия.
Оценку экологического статуса микроэлементов целесообразно начать с определения их уровней в мышечной ткани диких копытных животных. Микроэлементы в отличие от тяжелых металлов обладают как верхним, так и нижним критическим уровнем. Иными словами, качество продукции ухудшается как в случае повышен-
