CC BY
81
УДК 615.015.12: 615.015.12
К МЕХАНИЗМУ ДИУРЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФУРОСЕМИДА. РОЛЬ ГИДРОФОБНОГО СЕГМЕНТА МОЛЕКУЛЫ
И.В. Смирнов1, А.А. Бондарев1, В.М. Брюханов1, П.С. Постников2, В.Д. Филимонов2
1ГОУ ВПО Алтайский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России, Барнаул Национальный исследовательский Томский политехнический университет E-mail: postnikov@tpu.ru
THE MECHANISM OF FUROSEMIDE DIURETIC ACTIVITY. THE ROLE OF MOLECULE HYDROPHOBIC SEGMENT
I.V. Smirnov1, A.A. Bondarev1, V.M. Brukhanov1, P.S. Postnikov2, V.D. Filimonov2
11Altai State Medical University, Barnaul 2National Research Tomsk Polytechnic University
Цель исследования: изучение зависимости между величиной гидрофобного сегмента молекулы фуросемида и фармакологической активностью диуретика. Квантово-химические расчеты выполнялись неэмпирическим методом DFT B3LYP/6-311G* с помощью пакета программ GAMESS. Фармакологические исследования проведены на крысах-самцах Wistar массой 220-250 г. Животные были разделены на 2 группы: I группа - крысы, которым вводили фуросемид в дозе 15 мкмоль/кг; крысам II группы вводили йод-фуросемид в эквимолярной дозе. После расчета структур, который показал, что введение в фурановый цикл фуросемида атома йода мало изменяет зарядовые и конформационные характеристики основных фрагментов молекулы, произведен синтез йод-фуросеми-да. В опытах на крысах проведена сравнительная оценка мочегонной активности обоих веществ. В эквимолярной дозе йод-фуросемид вызывал значительно большее увеличение диуреза по сравнению с фуросемидом (в 1,8 раза). Примерно в такой же степени вновь созданный аналог превышал эффекты фуросемида в отношении экскреции с мочой ионов натрия и калия. Исследование показало, что увеличение величины гидрофобного сегмента молекулы фуросемида введением в фурановый цикл атома йода существенно увеличивает активность нового соединения. Подтверждено предположение о том, что при создании высоко активных и селективных мочегонных препаратов, наряду с введением в структуру ключевых полярных групп, способных к образованию прочной водородной связи с белками в водной среде, следует учитывать величину гидрофобного сегмента молекулы.
Ключевые слова: фуросемид, мочегонное действие, гидрофобный эффект.
The purpose of research: to study the dependence between the quantity of hydrophobic segment of furosemide molecule and its pharmacology activity. The quantum chemical analysis was done using non-empirical method DFI B3LYP/6-311G. The calculation was done with a help of GAMESS program. The pharmacology researches were carried out on male WISTAR rats weighing 220-250 g. Animals were divided in two groups: first group included rats, which were injected with furosemide in a dose of 15 mcM/kg; 2nd group included rats injected with iodine-furosemide in equimolar dose. Structure calculation showed, that the injection of iodine atom in furan cycle of furosemide changes slightly charge and conformation characteristics of the main part of molecule. The iodine furosemide was synthesized from furosemide. Comparative assessment of urinative activity of both substances was made. Iodine furosemide in equimolar dose promoted significantly diuretic activity (1.8 times more) in comparison with furosemide. The isolation of sodium with impact of iodine-furosemide also increased diuretic activity practically twofold (1.9) then furosemide. The ion potassium acted the same compared to furosemide. The study showed, that hydrophobic segment of the molecule furosemide was one of the basic fragments of molecule, which provide its diuretic activity. The atom of iodine in furan cycle rose hydrophobic segment and iodine activity. The experiment showed, that when producing high active and select diuretic preparations, along with polar groups, which originate hydrogen links with water and protein the quantity of hydrophobic segment of molecule must be also considered.
Key words: furosemide, diuretic action, hydrophobic effect.
Введение
Ранее нами была показана ключевая роль карбоксильной группы в обеспечении диуретической и салуретичес-кой активности фуросемида. Замещение активного атома водорода этой группы на гидрофобный метильный и этильный радикалы полностью лишало фуросемид возможности влиять на функцию почек в эксперименте у крыс [1]. В последующих работах нами было установлено, что изменения геометрии молекулы фуросемида, вызывающие выраженные стерические затруднения при
образовании водородной связи с активным атомом водорода карбоксильной группы, приводят к потере мочегонной активности препарата. Было также показано, что пространственное строение молекулы фуросемида в значительной степени зависит от наличия в его структуре внутримолекулярной водородной связи между кислородом карбоксильной группы и водородом аминогруппы. Разрыв этой связи приводит к существенным изменениям пространственных характеристик вещества [5]. Био-
логическая активность лекарственных веществ, действующих по принципу межмолекулярного взаимодействия с биологическими мишенями, реализуется двумя основными механизмами:
1) образованием прочных водородных связей между
полярными группами лиганда и мишени;
2) гидрофобным эффектом при наличии в молекулах
гидрофобных сегментов.
В связи с этим большинство эффективных и высокоселективных лекарственных веществ, являющихся сложными органическими соединениями, в своих молекулах содержат необходимый набор полярных групп, способных образовывать в водной среде прочные водородные связи с белками и гидрофобный сегмент. Гидрофобные участки молекул повышают селективность лигандов и дополнительно к полярным группам увеличивают прочность комплекса лиганд-мишень за счет энергии гидрофобного эффекта. Цель работы: изучение зависимости между величиной гидрофобного сегмента молекулы фу-росемида и его мочегонной активностью.
Материал и методы
Объектами исследования являлись диуретическое средство фуросемид, его производное йод-фуросемид и лабораторные крысы. Квантово-химические расчеты выполнялись неэмпирическим методом DFT B3LYP/6-31G** (d, p) с обменным функционалом Беке В3 и корреляционным функционалом Ли, Янга и Пара (LYP). Расчеты осуществлены с помощью программного комплекса PC GAMESS (Firefly), версия 7.1.С, разработанного под руководством проф. АА. Грановского в лаборатории химической кибернетики МГУ и содержащего все основные вычислительные алгоритмы, необходимые для теоретического исследования химических систем [2, 3]. В качестве вычислительного ядра для квантово-химических расчетов применялся 30-узловой вычислительный кластер на базе ЭВМ IBM PC под управлением ОС ASPLinux 12.0. Геометрия молекулы фуросемида была полностью оптимизирована, отсутствие мнимых частот колебаний подтверждало ее стационарный характер.
Фармакологические исследования проведены в осенний период на крысах-самцах Wistar массой 220-250 г, которых содержали на стандартной диете в естественном световом режиме. Животные находились в индивидуальных клетках, приспособленных для сбора мочи. Подопытные крысы были разделены на 2 группы: I группа (n=12) - крысы, которым вводили фуросемид; животным II группы (n=12) вводили йод-фуросемид. После определения контрольных показателей в каждой группе всем животным однократно подкожно был введен 1 мл
0,9-процентного раствора хлорида натрия в качестве контрольного вещества. Собирали мочу за сутки, определяя величину диуреза, экскрецию ионов натрия и калия. На следующий день животным I группы ввели подкожно фуросемид в дозе 15 мкмоль/кг в 1 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия; крысам II группы - йод-фуросемид в эквимолярной дозе. Через сутки вновь определяли указанные параметры экскреторной функции почек. Ионы натрия и калия определяли методом плазменной фотометрии на фотометре ПАЖ-3. Исследования на животных проводили в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приказ МЗ СССР №75 от 12.08.1987 г.) и Федеральным законом РФ “О защите животных от жестокого обращения” от 01.01.1997 г. Результаты обрабатывали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента с определением среднего арифметического значения М и его стандартной ошибки m. Анализ данных выполнен с использованием программы Biostat для Windows.
Результаты
Проведены квантово-химические расчеты пространственной и электронной структуры фуросемида и йод-фуросемида. Полученные молекулярные модели фуросемида и йод-фуросемида представлены на рисунках 1 и 2, а сравнение пространственных и электронных характеристик этих соединений - в таблице 1.
Эффективные заряды практически не изменяются, за исключением атомов, связанных с атомом йода или находящихся в непосредственной близости от этого заме-
Рис. 1. Структура молекулы фуросемида, рассчитанная методом функционала плотности (DfT - B3LYP) в базисе 6-31G** (d, p)
Рис. 2. Структура молекулы йод-фуросемида, рассчитанная методом функционала плотности (БКТ - В3£УР) в базисе 6-3Ю** (^ Р)
Таблица 1
Эффективные заряды на атомах по Милликену
Фуросемид Йод-фуросемид Фуросемид Йод-фуросемид
атом заряд атом заряд атом заряд атом заряд
1 O -0,521 1 O -0,519 17 C 0,в4б 17 C 0,в40
2 O -0,519 2 O -0,51В 1В C -0,102 1В C -0,04б
в H 0,29В в H 0,299 19 N -0,б40 19 N -0,б41
4 H 0,в00 4 H 0,в00 20 C 0,5б9 20 C 0,571
В N -0,711 5 N -0,711 21 O -0,529 21 O -0,529
б S 1,179 б S 1,1В0 22 O -0,479 22 O -0,47б
7 O -0,441 7 O -0,4в0 23 H 0,1бб 2в H 0,1бВ
В C 0,1в5 В C 0,092 24 Cl 0,044 24 Cl 0,17в
9 C -0,1вб 9 C -0,102 25 H 0,11б 25 H 0,117
10 C -0,1вб 10 C -0,1вб 2б H 0,вв0 2б H 0,вв2
11 C 0,25б 11 C 0,257 27 H 0,117 27 H 0,122
12 C -0,050 12 C -0,051 2В H 0,104 2В H 0,11в
1в C 0,027 1в C 0,0в2 29 H 0,10в 29 H 0,140
14 C -0,10В 14 C -0,115 в0 H 0,1в5 в0 H 0,1в4
1В C -0,170 15 C -0,1в2 в1 H 0,1в1 в1 H 0,в02
1б C -0,11В 1б C -0,в42 в2 H 0,в01 в2 I 0,075
Таблица 2
Структурные параметры молекул
Фуросемид Йод-фуросемид
параметр значение параметр значение
Двугранный угол С13-С17-С11-07 -45,9В Двугранный угол С13-С17-С11-07 -4б,70
Двугранный угол N19-02-01-07 -б0,1б Двугранный угол N19-02-01-07 -б0,в9
Двугранный угол Н32-М9-С11-07 -41,20 Двугранный угол Н31-Ж9-С11-07 -41,7в
Двугранный угол С14-С15-56^5 4,04 Двугранный угол N5-56-05-04 2,75
Двугранный угол С17-С13-С20-021 0,4в Двугранный угол С17-С13-С20-021 0,б2
Водородная связь 021-Н32 1,915 Водородная связь 021-Н31 1,911
Межъядерное расстояние Н32-07 2,б1в Межъядерное расстояние Н31-07 2,б2б
Межъядерное расстояние 021-Н26 0,972 Межъядерное расстояние 021-Н26 0,972
Межъядерное расстояние М9-Н32 1,010 Межъядерное расстояние Ж9-Н31 1,010
Рис. 3. Фармакологическая активность фуросемида и йод-фу-росемида
стителя. Также практически не изменилось распределение зарядов на атомах карбоксильной и сульфаниламидной групп, способных образовывать водородные связи с субстратом и участвующих в специфической сольвата-
ции (табл. 2).
Основные геометрические параметры, углы между плоскостями бензольного кольца и фуранового цикла, а также углы между плоскостью кольца, карбоксильной и сульфаниламидной группами практически идентичны в этих молекулах. В целом геометрия не претерпела существенных изменений, за исключением самого заместителя - йода, обладающего большим Ван-дер-Ваальсовым радиусом. Сравнительный анализ структур этих молекул показал, что их геометрические параметры практически одинаковы, а различия в длине связей незначительны. Распределение заряда на основных функциональных группах, участвующих в специфических взаимодействиях с белковым субстратом, также не претерпело существенных изменений. Это позволяет предположить, что основную роль в повышении биологической активности молекулы играет само наличие объемного заместителя - йода, в значительной степени увеличивающего гидрофобный эффект. Так, по литературным данным, введение йода приводит к увеличению aG гидрофобного эффекта для йод-бензола в сравнении с бензолом на 3,7 кДж/моль [4]. Теоретически это приводит к увеличению константы прочности комплекса с белковыми молекулами в 4,2 раза при температуре 310 К.
Результаты проведенных сравнительных фармакологических исследований диуретической и салуретической активности фуросемида и йод-фуросемида приведены на рисунке 3.
Представленные на рисунке 3 изменения основных показателей экскреторной функции почек выражены в
процентах по отношению к контрольным значениям. Эквимолярная доза йод-фуросемида вызывала увеличение диуреза в 1,8 раза большее по сравнению с фуросе-мидом. Экскреция ионов натрия под влиянием йод-фу-росемида превысила эффекты фуросемида в 1,9 раза, а экскреция калия - в 1,8 раза.
Обсуждение
Для экспериментального подтверждения результатов квантово-химических расчетов нами было синтезировано производное фуросемида - йод-фуросемид. В полученном соединении во втором положении фуранового цикла фуросемида атом водорода был замещен на атом йода. Поскольку атом йода имеет значительно больший радиус, чем водород, и к тому же он неполярен, то полученное соединение должно было иметь существенно больший гидрофобный сегмент, чем исходный фуросемид. Проведенное экспериментальное исследование показало, что введение в молекулу фуросемида атома йода с целью увеличения площади гидрофобного сегмента фуранового цикла молекулы фуросемида повышает диуретическую и салуретическую активность препарата. Проведенное теоретическое исследование показало, что основные характеристики электронного строения фуросемида и йод-фуросемида не имеют существенных отличий, что также позволяет предполагать наличие у модифицированного соединения аналогичных фуросемиду фармакодинамических характеристик, однако с существенно большей активностью. Следует отметить, что атом йода не способен образовывать водородные связи, его роль заключается только в увеличении энергии гидрофобного эффекта.
Заключение
Полученные результаты свидетельствуют о существенной роли гидрофобного сегмента в реализации мочегонного эффекта фуросемида. Повышение мочегонной активности препарата прямо пропорционально увеличению площади гидрофобного сегмента его структуры. Уве-
личение площади гидрофобного сегмента фуросемида за счет введения атома йода не оказывает сколько-нибудь значимого влияния на электронное строение диуретика. Этот факт позволяет предположить наличие идентичного фуросемиду механизма мочегонной активности у вновь полученного соединения. Проведенное исследование показало потенциальную возможность создания новых мочегонных препаратов с более высокой активностью. Это позволит существенно снижать их терапевтическую дозу, что приведет к резкому уменьшению выраженности многочисленных побочных эффектов этой группы лекарственных средств. В случае с фуросемидом основным побочным эффектом является выраженная гипокалиемия, особенно при курсовом применении препарата.
Литература
1. Смирнов И.В., Брюханов В.М., Бондарев А.А. и др. О роли карбоксильной группы в молекуле фуросемида // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т. 7, Ч. 2. - С. 1952-1953.
2. Соломонов Б.Н., Седов И.А. Методы расчета энергии Гиббса гидрофобного эффекта и специфического взаимодействия неэлектролитов в водных растворах // Журнал физической химии. - 2008. - Т. 83, № 7. - С. 1259-1263.
3. Постников П.С., Бондарев А.А., Смирнов И.В. и др. Исследование влияния модификации аминогруппы фуросемида на диуретическую активность с применением экспериментальных и теоретических методов // Создание новых лекарственных препаратов : матер. конференции / под ред. Е.Д. Гольдберга. - Томск : Изд-во Том. ун-та, 2007. - С. 76-78.
4. Granovsky A.A. PC GAMESS/Firefly version 7.1 [Электронный ресурс]. - URL: http://classic.chem.msu.su/gran/gamess/ index.html.
5. Schmidt M.W., Baldridge K.K., Boatz J.A. et al. General atomic and molecular electronic structure system // J. Comput. Chem. - 1993. - No. 14. - С. 1347-1363.
Поступила 12.05.2010
