CC BY
8
УДК 614.777:828.3:57».))
Профессора Г. А. Багдасарьян и Ю. Г. Талаева, кандидаты биол. наук А. Н. Захаркина и Т. 3. Артемова,
кандидаты мед. наук В. В. Колесникова, А. Е. Недачин и В. И. Немыря, доктор биол. наук: И. Даубнер, Д. Тот
ИЗУЧЕНИЕ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В ВОДЕ В УСЛОВИЯХ ЗАГРЯЗНЕНИЯ БЫТОВЫМИ И ПРОМЫШЛЕННЫМИ СТОЧНЫМИ ВОДАМИ
Институт общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина ЛМН СССР, Москва; Институт экспериментальной биологии и экологии САН ЧССР, Братислава
Задачей данной работы являлась количественная оценка влияния некоторых часто встречающихся в водоемах химических веществ на процессы жизнедеятельности и взаимодействия санитар-но-показательных и патогенных бактерий и вирусов.
Экспериментальные исследования выполнены на модели, максимально приближенной к натурным условиям: нативная вода с добавлением химических веществ, имитирующих фекальный сток, и изучаемых микроорганизмов в количествах и соот-Дношениях, близких к таковым в местах выпуска сточных вод.
Работа проведена на 500 искусственных водоемах с водой из водохранилищ (или речной), предварительно профильтрованной через ватно-марле-вые фильтры и исследованной на содержание микроорганизмов и химических веществ. Последние изучены в следующих концентрациях: медь (CuS04-5H„0) — I, 0,1, 0,05, 0,03, 0,02 и 0,01 мг/л, свинец IPb(N03)2l — 50, 10, 1, 0,5 и 0,1 мг/л, цинк (ZnSOJ — 1, 0,1 мг/л, вторичный алкилсУлыЬат натрия (CMC) — 100, 50, 10, 5, I и 0,5 мг/л*. Концентрацию вещества рассчитывали по основному действующему компоненту (катиону металла, детергенту и др.), а в случае действия на микрофло-, ру всех компонентов веществ — по его полному составу. При выборе концентраций исходили из общих принципов — изучать вещества на уровне их ПДК в воде, максимально встречающихся, и в действующих концентрациях, установленных опытным путем.
Индексы тест-микроорганизмов были следующими: сапрофитные бактерии — 108, A. hydrophi-la — 103, Ps. fluorescein — 10s, Ps. fragi — 10s, бактерии группы кишечных палочек (БГКП) — 107, Е. coli — 10', С. freunaii — Ю4, Е. cloacae — 104, энтерококки (S. faecal is, S. faecium. S. du-rans), Ent. faecalis—10е, сальмонеллы (S. typ-himurium) — 10"--6, вирусы (полиомиелита I типа ZS c2ab) — 106-6.
Для исключения штаммовой чувствительности использовали по 3—5 штаммов каждого вида микроорганизмов, предварительно исследованных на типичность свойств. При выборе штаммов предпочтение отдавали свежевыделенным из сточных вод и фекалий.
Указанные микроорганизмы изучали как при изолированном контакте с химическими веществами, так и в вирусно-бактериальных ассоциациях, что позволяло определить характер сочетанного воздействия — биологического и химического — на каждый из видов. Контролем служили модельные водоемы с теми же концентрациями микроорганизмов при отсутствии химических веществ в воде. Опыты проводились при 20±2 °С.
Контрольные высевы из зараженных модельных сосудов производили в следующие сроки: сразу после внесения микроорганизмов для определения их концентрации, после внесения химических веществ через 1/2, 1, 4 и 24 ч и далее ежесуточно в течение 2 нед (срок, в течение которого наиболее четко проявляется взаимодействие биологических и химических факторов среды). При изучении выживаемости сроки исследований удлиняли до получения трехкратных отрицательных результатов высевов. Посевы инкубировали 24—48 ч при 37 °С. Для выделения санитарно-показатель-ных микроорганизмов использовали элективные среды, для выделения патогенных — и накопительные питательные среды.
Физиологическое состояние клеток устанавливали по числу и виду колоний (чашечный метод), методом микроколоний на мембранных фильтрах, по «пестрому ряду», используемому для идентификации БГКП. Кроме того, определяли биодеградацию алкилсульфата с метиленовым синим (Соой-по\у и Нагпяоп), скорость синтеза белка — методом меченых аминокислот и в некоторых случаях — респирационную и трансгидрогеназную активность бактериальной клетки.
Количество вирусов подсчитывали путем титрования по цитопэтическом у действию в 1с>§ ТЦД«,/,,, на перевиваемой линин клеток МК-2, выделение и титрование бактериофага — методом агаровых слоев в бляшкообразующих единицах па 1 мл по Грация. Определяли цитопатическую и бляшкообра-зующую активность вирусов и фагов, серологические свойства и вирулентность патогенных энтеро-бактерий.
Исследования показали, что изученные химические вещества указывают разнонаправленное действие на микроорганизмы различных видов. Установлено, что медь в концентрации от 0,02 до 1 мг/л не оказывает существенного действия на общую
Инкорпорация 14С-валина микроорганизмами под влия-нием алкилсульфата «Прогресс» (100 мг/л).
По оси абсцисс — длительность инкорпорации (в ч); по оси ординат — интенсивность счета (в ими/мин); / — Ps. fluorescens — контроль (без ПАВ): 2 — Ps. fluorescens с ПАВ; 3 — Ps. fregl — контроль: 4 — Ps. frag! с ПАВ: 5 — А. hydrophile (контроль); 6 —А. hydrophile с ПАВ.
микрофлору при выраженном угнетении Е. coli. Энтерококки более устойчивы к солям меди, и только при 0,05 мг/л происходит их инактивация. Заметное угнетающее действие на физиологические свойства Е. coli оказывает свинец. По сравнению с кишечной палочкой вирус полиомиелита I типа и фаг Т, более устойчивы к химическим веществам. Вирулицидное действие меди проявляется только при концентрации 0,1 мг/л.
Цинк в концентрации 0,01 мг/л оказывает небольшое стимулирующее влияние на размножение Е. coli, видимо, как микроэлемент. При 0,05— 0,1 мг/мл цинка заметного действия на кишечную палочку не отмечено. В более высоких концентрациях он угнетает физиологическую активность (рост, размножение, респирацию, синтез белка, трансгидрогеназный капацитет) данных бактерий. Одновременно обнаружено изменение биохимических свойств Е. coli: в течение суток наблюдалась утрата способности образовывать индол и отрицательная реакция с метиленовым красным. Аналогичные данные получены под влиянием свинца. Интересно, что дальнейшее повышение концентрации тяжелых металлов (50 мг/л) не вызывает увеличения изменений в биохимических свойствах тест-мнкроорганизмов. На энтерококки цинк в концентрации 1 мг/л не оказывает заметного влияния.
Поверхностно-активные вещества (ПАВ) типа вторичного алкилсульфатл натрия в количестве более 0,5 мг'л стимулируют размножение общей микрофлоры, сапрофитных видов бактерий, БГКП, в частности Е. coli, и сальмонелл, причем степень активации роста и размножения бактерий возрастает с увеличением концентрации вещества от долей до 50—100 мг/л. При этом наибольший эффект действия ПАВ при его однократном введении в во-
ду отмечен через 48—72 ч (у фагов через 96—120 ч) после начала контакта с ним микроорганизмов — срок вполне достаточный для значительного разложения в нативнон воде указанного биологически «мягкого» вещества, а также для адаптации микроорганизмов к этому веществу и продуктам метабо- . лизма. После повторной добавки ПАВ его разложение бактериями ускоряется.
ПАВ типа вторичного алкилсульфата натрия влияет на скорость синтеза белка микробной клеткой и биодеградацию этого субстрата. На рисунке представлены результаты исследования инкорпорации 14С-валина у 3 видов сапрофитных бактерий: у Ps. fluorescens и Ps. fragi ПАВ в концентрации до 100 мг/л стимулирует, у А. hydrophila слабо подавляет физиологическую активность клетки. Об усвоении алкилсульфата как энергетического источника клетками Ps. fluorescens свидетельствует и то, что после деградации этого вещества скорость инкорпорации 14С-валина резко снижалась.
Высокая чувствительность к алкилсульфату в пресной воде обнаружена у энтерококков: при концентрации на уровне ПДК (0,5 мг/л) и тем более 1—5 мг/л ПАВ не выделялся из воды модельных водоемов через сутки. Алкилсульфат не влияет^ на вирус полиомиелита I типа даже при превышении ПДК в 100 и 200 раз.
Экспериментально установлено, что ПАВ до определенной концентрации увеличивает сроки выживания в воде сапрофитных и санитарно-показа-тельных микроорганизмов . Например, сальмонеллы сохранялись в воде в 1%—2 раза дольше по сравнению с контролем, что при определенных условиях в водоемах может повышать эпидемическую опасность воды. Сроки выживаемости кишечной палочки превышали контрольные показатели в воде, а концентрация бактерий была больше на IVj порядка.
На свойства микробной клетки химические вещества оказывают различное действие. Так, ал- ( килсульфат в концентрации 0,5—5 мг/л не изменяет биохимических, культуральных и морфологических свойств Е. coli. При концентрации 100 мг/л и длительном (более 6—25 сут) контакте с ним бактерий количество измененных штаммов было на 9% больше, чем в контроле (соответственно 32,5 и 23,5%). Изменения заключались в основном в снижении способности к газообразованию. В соответствии с данными наших предыдущих работ (Daubner), непостоянными являлись также образование индола, НгБ-сбраживание сахарозы.
Наши исследования (В. В. Колесникова) показали, что при длительном вегетированин сальмонелл в воде с ПАВ изменяются морфологические свойства, снижается способность агглютинироваться Н-сыворотками, а в некоторых случаях — переход штамма из S- в R-форму. Через 3 мес из воды с 0,5 мг/л алкилсульфата выделен вариант, резко отличающийся по морфологическим и культураль-ным свойствам от исходных штаммов S. typhimu-
rium. На мясо-пептон ном агаре вырастали мутные колонии с шероховатой поверхностью и нечеткими краями. В жидких средах на дно выпадал осадок в виде крошковидных хлопьев. Часть штаммов, выделенных из воды с ПАВ, сохранила способность * агглютинироваться специфическими 0-4 и 0-5 сыворотками, а штамм, перешедший в R-форму, эту способность утратил. Способностью агглютинироваться не обладали и другие штаммы, выделенные из воды: 6 штаммов не агглютинировались Н-сыворотками на среде № 1, 21 штамм — на среде № 2. Вариант, выделенный из аналогичной воды через 3'/2 мес, обладал склонностью к агглютинации и склеиванию, имел слабую подвижность.
При концентрации алкилсульфата 50 мг/л и более уменьшался срок выделения фага Т, (15 сут против 70 сут в контроле). Однако потеря бляшка-образующен способности оказалась обратимой: при пассаже кишечного фага, подвергшегося воздействию указанных концентраций ПАВ, в бульоне Хоттннгера при 37 °С с взвесью свежевыделен-ной культуры Е. coli через 18 ч отмечена реверсия его бляпрообразующей способности. Видимо, при больших концентрациях ПАВ нарушался только ^механизм адсорбции фага на клетке микроба-хозяина. Об этом свидетельствовали и данные электронной микроскопии на УЭМ-К при увеличении 140 000, показавшие отсутствие морфологических различий в контрольных и опытных препаратах (А. Е. Недачин).
Действие меди носило фагоцитный характер. При пассаже фага, утратившего способность к бляшко-образованпю, в бульоне Хоттингера с Е. coli не отмечено ее восстановления в течение 18—48 ч.
В токсикологических исследованиях (В. В. Ше-лакова и соавт.) на животных установлено, что поступление ПАВ с водой, содержащей сальмонеллы S. typhimurium способствует снижению LDW (до 5—0 раз), более тяжелому течению инфекционного процесса, ускоряя его и увеличивая (до 2V« раз) ' гибель подопытных животных. Види'ло, ПАВ способствует более быстрому проникновению сальмонелл через стенки кишечника и в связи с этим более быстрому распространению их по организму, т. е. усиливает повреждающее действие указанных бактерий на организм.
ПАВ (алкилсульфат) может снижать бактерицидное действие меди, видимо, вследствие образования менее токсичного соединения ПАВ с медью (А. Н. Захаркина и соавт.). В присутствии химических веществ с выраженным токсическим действием (медь) и ПАВ динамика инактивации фага более интенсивна, чем у вируса полиомиелита. Действие комплекса ПАВ и меди на сапрофитные и еанитарно-показательные микроорганизмы (БГКП, Е. coli, сальмонеллы) зависит от концентрации последней, а действие на энтерококки определяет наличие алкилсульфата (ПАВ).
Таким образом, действие комплексов веществ за-
висит от чувствительности микроорганизмов к каждому из компонентов смеси.
В вирусно-бактериальиых ассоциациях отмечена разная выживаемость перечисленных ранее тест-микроорганизмов. В ряде экспериментов вирусы по сравнению с бактериями отмирали более интенсивно, а выживаемость фагов была более длительной. Не исключено, что в условиях искусственного водоема происходила не только адсорбция фагов бактериями, но и их лизис с выходом новых частиц фага.
В ходе экспериментов сравнивали сроки воздействия химических веществ, обеспечивающих инактивацию тест-микроорганизмов на 99%. Установлено, что наибольшая экспозиция инактивации в присутствии меди (0,1 мг/л) имеется у вируса полиомиелита (37 сут). У фага она составляет 12 сут, а у Е. coli — всего 3 сут. Такая же разница отмечена и в присутствии смеси меди и ПАВ. Во всех случаях наибольшая устойчивость оказалась у сапрофитных бактерий.
Полученные данные подтвердили, что по устойчивости к химическим веществам в экспериментальных условиях микроорганизмы располагаются в следующем порядке: сапрофитные бактерии, полиовирус, бактериофаг, Е. coli и сальмонеллы. В зависимости от вида химических веществ энтерококк может занимать промежуточное место между фагом и Е. coli, а в присутствии ПАВ — последнее место.
Влияние санитарно-показательных микроорганизмов на стабильность ПАВ /вторичного алкил сульфата) изучено на модели Е. coli. Установлено что в водопроводной воде, предварительно стери.'е зованной, а затем зараженной Е. coli, распад ПАК происходит медленно: только на 41-й день его кои центрация снижается на 30—40 %. В речной натив-ной воде такой же эффект наблюдался на 2-е сутки опыта. Эти данные позволяют предположить, что Е. coli в распаде ПАВ (алкилсульфата) практически не участвует, а разложение их в натнв-ной воде происходит за счет естественной микрофлоры воды (А. Н. Захаркина и соавт.; Е. А. Мо-жаев и соавт.).
Таким образом, выявлена зависимость между концентрациями химических веществ и выживаемостью санитарно-показательных (БГКП, энтерококков, фагов кишечных палочек), сапрофитных и патогенных (сальмонелл, энтеровируссв) микроорганизмов при изолированном и совместном веге-тированин в воде. В силу неодинаково!1 видовой устойчивости микроорганизмов к химическ! м веществам может изменяться первоначальное их соотношение в воде. Кинетика роста и сроки выживаемости микроорганизмов зависят от природы х имических веществ, их концентрации и продолжительности воздействия, а также от биологических особенностей микроорганизмов и микробного ценоза.
ЛИТЕРАТУРА
Захаркина А. Н., Можаев Е. А., Корш Л. Е. — Гиг. и сан., 1977, № 3, с. 108—109.
Колесникова В. В. — В кн.: Гигиенические аспекты охраны окружающей среды. М., 1976, вып. 4, с. 75—76.
Можаев Е. А., Корш Л. £., Захаркина А. Н. и др. —Гиг. и сан., 1972, № 10, с. 12—14.
Недачин А. Е. — В кн.: Гигиенические аспекты охраны окружающей среды. М., 1976, вып. 3, с. 90—92.
Недачин А. Е. — Там же, вып. 4, с. 91—92. Шелакова В. В., Пивоваров Ю. П., Бычко H.A. — Труды 2-го Моск. мед. ин-та, 1976, т. 56, вып. 7, с. 14—16. Daubner I. Verh. Int. Ver. theor. angew. Limnol, 1975,
Bd 19, S. 2650—2657. ,
Goodnow R. A., Harrison A. P. — Appl. Microbiol. 1972. v. 24, p. 555—560,
Поступила 28/1X 1979 г.
УДК 614.771:615.285.7
Т. И. Куюмджиева, Ив. С. Льочев
О ГИГИЕНИЧЕСКОМ НОРМИРОВАНИИ ГЕРБИЦИДА ТРЕФЛАН
В ПОЧВЕ
Медицинская академия. Институт гигиены и профессиональных заболеваний, Болгария, София
Трефлан представляет собой гербицидный препарат с активным действующим веществом три-флоралнном ^2,6-динитро-4-трифторметил-М,Г^-дн-пропиланилин), который используется в практике в виде эмульсий (24 и 48 об. %). Он малотоксичен.
Исследование проводили по разработанной нами методике (Ьогеху* и соавт.), которую позднее привели в соответствие с «Теоретическими основами гигиенического нормирования вредных веществ в почве» (В. М. Перелыгнн).
Исследовали 3 типа почвы: черноземную, алюви-ально-лугоБую и корнчнево-псевдоподзолнстую. Наблюдение за устойчивостью и миграцией трефлз-на осуществляли в стеклянных колонках высотой 60 см, диаметром 6 см. Динамику распада пестицида изучали на 10, 30 и 90-й дни опыта, миграцию определяли в трех почвенных горизонтах — 0—20, 20—40 и 40—60 см. Фнтотоксическое воздействие трефлана устанавливали путем фенологических наблюдений за растениями, выращиваемыми в посуде, в которой содержались те же типы почвы и те же количества токсического агента, как и в колонках. В качестве индикаторных растений использовали перец и салат, для защиты которых используется трефлан.
Определение остаточных количеств трефлана в различных почвенных образцах и растениях проводили методом газожндкостной хроматографии (Г. Георгиев и соавт.). Чувствительность метода составляет 0,010 мг'кг, точность 85—92%.
Результаты исследований показали, что основная часть пестицида распадается через 1 мес, через 3 мес и при всех трех концентрациях наблюдается значительный распад — от 60 до 75%.
Наши данные совпадают с гигиенической классификацией, согласно которой трефлан относится к умеренно устойчивым пестицидам (Н. Мельников).
Для изучения миграции трефлана в зависимости от профиля почвы определяли его остаточные количества в трех горизонтах почвы: 0—20, 20—40
и 40—60 см. Обобщенные результаты проведенных экспериментов приведены в таблице. Приведенные данные показывают, что основная часть внесенного пестицида (свыше 95%) аккумулируется в поверхностных горизонтах почвы (0—20 см), что можно, вероятно, объяснить слишком малой раствори-* мостью трефлана в воде (ниже 1 мг-'л).
Фенологические наблюдения показали, что в условиях эксперимента растения прорастали нормально, однако в последующем появились различия в росте, обусловленные как типом почвы, так и концентрацией пестицида Перец сначала быстрее всего развивался на элювиальной почве, но затем , он начал отставать в развитии от растений, которые выращивались на смольнице. В этом варианте он дал наиболее обильное плодоношение. Перец, выращиваемый на коричневой почве, очень слабо развивался. Аналогичная картина наблюдалась и в развитии салатов.
Установлены значительные различия в развитии растений в зависимости от концентрации пести- i ц ид а. Они были более выраженными, при выращивании на элювиальной почве. Отставание в развитии по сравнению с контрольными растениями наблюдэлось уже при внесении первой концент-рзции, при этом с повышением ее замедление в развитии растений проявлялось более резко. На смоль-ниие отстзвэние в развитии растений, наглядно проявлялось только после внесения третьей дозы.
При выращивании салата из почве с внесенным трефланом в рззличных дозах проявлялись подобные изменения, но различия были менее выраженными ввиду листовидной формы плодоносящего рзстения.
На основании фенологических наблюдений можно утверждать, что трефлан оказывает фито- < токсическое действие, но это проявляется при концентрациях, превышающих допустимые arpo- * технические нормы. Только на элювиальной почве при агротехнической дозе отмечается некоторое подавление развития растений.
