Научная статья на тему 'Изучение взаимодействия альбумина с наноалмазными пленками методом КР-спектроскопии'

Изучение взаимодействия альбумина с наноалмазными пленками методом КР-спектроскопии Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

CC BY
188
34
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
КР-СПЕКТРОСКОПИЯ / RAMAN SPECTROSCOPY / БЕЛКИ КРОВИ / PLASMA PROTEINS / АЛЬБУМИН / ALBUMIN / НАНОЧАСТИЦЫ / NANOPARTICLES / НАНОАЛМАЗЫ / NANODIAMONDS / КОНФОРМАЦИЯ БЕЛКОВ / CONFORMATION OF PROTEINS

Аннотация научной статьи по нанотехнологиям, автор научной работы — Брандт Николай Николаевич, Исмагилов Ринат Рамилович, Приезжев Александр Васильевич, Светлакова Анастасия Сергеевна, Чикишев Андрей Юрьевич

Работа посвящена определению возможных структурных изменений молекул одного из основных белков плазмы крови -альбумина -при взаимодействии с наноалмазами. Рассматривается взаимодействие наноалмазных пленок с белковыми пленками, образующимися в результате высыхания растворов. Показана возможность самопроизвольной кристаллизации белка при высыхании раствора на поверхности наноалмазной пленки. Методом КР-спектроскопии установлено, что при взаимодействии с наноалмазной пленкой вторичная структура, структура дисульфидных мостиков и тирозинового дублета белка не меняются по сравнению с этими элементами его структуры в лиофилизованном состоянии, по крайней мере в объеме белковой пленки толщиной 1 мкм. Тем не менее конформационные изменения могут иметь место в достаточно тонком приповерхностном слое пленки белка (порядка 20 нм).

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по нанотехнологиям , автор научной работы — Брандт Николай Николаевич, Исмагилов Ринат Рамилович, Приезжев Александр Васильевич, Светлакова Анастасия Сергеевна, Чикишев Андрей Юрьевич

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Изучение взаимодействия альбумина с наноалмазными пленками методом КР-спектроскопии»

Изучение взаимодействия альбумина с наноалмазными пленками

методом КР-спектроскопии

Н. Н. Брандт1,а, Р. Р. Исмагилов2, А. В. Приезжев1,3,6, А. С. Светлакова1, А. Ю. Чикишев3

Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, физический факультет,

1 кафедра общей физики и волновых процессов; 2 кафедра физики полимеров и кристаллов.

Россия, 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 2.

3 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Международный учебно-научный лазерный центр. Россия, 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 62.

E-mail: a brandt@physics.msu.ru, 6 avp2@mail.ru Статья поступила 10.04.2014, подписана в печать 07.07.2014.

Работа посвящена определению возможных структурных изменений молекул одного из основных белков плазмы крови — альбумина — при взаимодействии с наноалмазами. Рассматривается взаимодействие наноалмазных пленок с белковыми пленками, образующимися в результате высыхания растворов. Показана возможность самопроизвольной кристаллизации белка при высыхании раствора на поверхности наноалмазной пленки. Методом КР-спектроскопии установлено, что при взаимодействии с наноалмазной пленкой вторичная структура, структура дисульфидных мостиков и тирозинового дублета белка не меняются по сравнению с этими элементами его структуры в лиофилизованном состоянии, по крайней мере в объеме белковой пленки толщиной 1 мкм. Тем не менее конформационные изменения могут иметь место в достаточно тонком приповерхностном слое пленки белка (порядка 20 нм).

Ключевые слова: КР-спектроскопия, белки крови, альбумин, наночастицы, наноалмазы, конформация белков.

УДК: 538.958. PACS: 42.62.Fi, 87.14.Ee, 87.15.-v, 87.15.He, 87.15.Nn.

Введение

В последнее время бурно развиваются технологии по применению наночастиц в биомедицине. Одним из перспективных применений наночастиц является направленная доставка лекарств к пораженным или модифицированным органам и тканям. Среди множества наночастиц, наиболее биосовместимыми являются наночастицы алмаза в связи с минимальной токсичностью [1]. Заметим, что они способны флуоресцировать и имеют характерный КР сигнал [2]. Возможна модификация поверхности наноалмазов с образованием функциональных групп атомов и молекул, позволяющая, в частности, осуществлять их конъюгацию с лекарственными препаратами [3, 4]. Предполагается, что наночастицы или их конъюгаты будут распространяться в живом организме по кровеносной системе, однако присутствие наночастиц в кровотоке может приводить к изменению микрореологических свойств крови. Например, в ряде исследований, проведенных в условиях как in vitro, так и in vivo инкубирования (на крысах), показано, что наноалмазы взаимодействуют с мембранами эритроцитов. Хотя это взаимодействие не вызывает гемолиза клеток, оно при определенных концентрациях влияет на другие важные функции эритроцитов, такие как способность агрегировать и деформироваться [5]. Кроме того, в работе [6] была показана возможность адсорбции основного белка плазмы крови альбумина (концентрация в плазме крови 30-50 мг/мл) на поверхности наноалмазов. В работе [7] изучено взаимодействие других компонентов плазмы крови с наноал-мазами и показано, что их адсорбция на наноалмазах не приводит к изменению вторичной структуры белков

плазмы, также наноалмазы не влияют на динамику процесса свертываемости крови.

Поскольку альбумин участвует в минеральном, пигментном, гормональном и других видах обмена веществ [8], то задача определения степени влияния наноалмазов на структуру молекул альбумина на сегодняшний день является весьма актуальной. Наноал-мазные частицы, как правило, агрегируют и образуют микрочастицы, и поэтому в настоящей работе использовались наноалмазы, синтезированные на кремниевой подложке. Цель работы — определение изменений конформационно-чувствительных линий в КР-спектрах альбумина при высушивании его водного раствора на поверхности наноалмазных пленок.

Метод КР микроспектроскопии является эффективным инструментом для изучения состава и строения вещества, и позволяет получать субмикронное пространственное разрешение, что принципиально в задачах исследования взаимодействия альбумина с на-ноалмазами. Основными конформационно-чувствитель-ным линиями в КР-спектрах белков являются амид I (1640 см_1, основной вклад вносит валентное колебание C=O), амид III (1270 см_1, основной вклад дает деформационное колебание N-H), тирозиновый дублет (830-850 см_1) и линии дисульфидных мостиков (500-550 см_1, валентные колебания связей S-S) (см., например, [9]).

1. Материалы и методы

Измерения КР-спектров производились на КР микроскопе DXR Raman Microscope (Thermo Scientific). В качестве источника возбуждения была использована вторая гармоника (532 нм) твердотельного Nd:YAG

лазера с диодной накачкой. Максимальная мощность излучения на образце составляла 10 мВт. Измерения проводились в спектральном диапазоне 50-3500 см-1. Сравнение КР-спектров производилось с помощью программы, предложенной в работе [10]. В программе сравнения используется алгоритм аппроксимации одного спектра другим или суперпозицией спектров с добавлением полинома заданной степени, который позволяет проводить сравнительный анализ спектров, не прибегая к устранению фонового сигнала.

Наноалмазные пленки были получены методом газофазного химического осаждения (CVD) из смеси метана и водорода, активированной разрядом постоянного тока [11]. В качестве подложки для наноалмазной пленки был использован кристаллический кремний. Были получены две наноалмазные пленки (nd_1 и nd_2), отличающиеся по структуре и соотношению между углеродными фракциями, входящими в их состав. Поверхность пленок состоит из глобул, размер которых варьирует в зависимости от времени осаждения. Каждая глобула имеет внутреннюю структуру и состоит из микроалмаза, наноалмаза и графита.

Изображения пленок (рис. 1) получены на сканирующем электронном микроскопе LE0-1430vp (Carl Zeiss). Размер глобул в пленке nd_1 составляет менее 200 нм, а в пленке nd_2 — порядка 1 мкм.

В работе использовался бычий сывороточный альбумин производства компании «MP Biomedicals» (cat. No: 160069): чистота ^ 98%, сульфатная зола < 2%, вода < 6%, тяжелые металлы < 20 ppm. Раствор альбумина (10 мкл) в бидистиллированной деионизованной воде в концентрации 35 мг/мл наносился на наноалмазные пленки и высушивался при комнатной температуре. В результате на поверхности наноалмазной пленки образовывалась пленка белка.

В случае измерения КР-спектров кристаллов альбумина, образовавшихся на поверхности наноалмазной пленки, спектр одного кристалла получался в результате усреднения спектров, полученных в четырех различных областях этого кристалла.

2. Результаты и обсуждение

КР спектры наноалмазных пленок. КР-спектры наноалмазных пленок представлены на рис. 2. Видно, что в спектре пленки nd_1 присутствуют линии на частотах 520, 1140, 1330, 1358, 1470 и 1560 см-1. В спектре пленки nd_2 присутствуют линии на тех же

500

1000

1500

2000

2500

3000

Частота, см"

Рис. 2. КР-спектры наноалмазных пленок (а)

и Ы_2 (б)

частотах, но с другими относительными интенсивностя-ми линий.

Узкая линия на частоте 520 смсвязана с колебаниями кремния, из которого сделана подложка. Линии на частотах 1140 и 1470 смсоответствуют комбинации деформационных колебаний С-Н и валентных колебаний С-С транс-полиацетилена [-СН=СН-] п. Присутствие этих линий говорит о наличии в пленке наноалмазов размером менее 2 нм [12]. Поскольку в пленке пё_2 линия на частоте 1140 смимеет гораздо меньшую относительную интенсивность (присутствует в спектре в виде плеча), то концентрация наноалмазов в этой пленке существенно меньше, чем в пленке пё_1. Линия на частоте 1330 смговорит о присутствии в образце алмазов, размеры которых составляют несколько микрон [12]. Полоса с максимумом в диапазоне 1350-1360 см называется Д-линией графита и соответствует «дыхательной» моде атомов в углеродном кольце. б-линия графита расположена в диапазоне 1560-1590 сми соответствует валентным колебаниям атомов в углеродных цепях и кольцах [12, 13]. Интенсивности линии микроалмаза и графита сравнимы для обеих пленок, следовательно, содержание микроалмаза и графита в обеих пленках приблизительно одно и то же.

Альбумин после нанесения на наноалмазные пленки. Типичное изображение высохшего раствора альбумина на наноалмазной пленке представлено на рис. 3. Белковая пленка является неоднородной по толщине: в центре ее толщина составляет порядка 1 мкм, а на краю — до 10 мкм. Линейный размер молекулы альбумина составляет порядка 8 нм. Таким образом, толщина белковой пленки много больше, чем толщина приповерхностного слоя молекул альбумина.

Альбумин на наноалмазной пленке nd_1. После высыхания раствора альбумина на наноалмазной пленке пб_1, в белковой пленке помимо альбумина в аморфном состоянии были обнаружены кристаллы (рис. 4, 5). При повторении эксперимента результат воспроизводился. В экспериментах по КР-спектроскопии пленок альбумина, высохших на чистых кремниевых подложках (без наноалмазных пленок) кристаллизация белка не наблюдалась.

Существует достаточно много методов кристаллизации белков, к ним относятся метод диффузии в парах

Плёнка альбумина

Рис. 3. Белковая пленка на поверхности наноалмазной пленки

(методы «висящей» и «сидящей» капли), метод свободной диффузии, изогидрическая и изотермическая кристаллизация, кристаллизация путем диализа, затравочная кристаллизация, кристаллизация путем высали-

Рис. 4. Микрофотографии кристалла альбумина при различных фокусировках с помощью объектива х 100:

Z = 0 (а), 5 мкм (б), 10 мкм (в)

Рис. 5. Кристаллы альбумина

1600 1650 Частота, см

1700 1200 1

1300 Частота, см

800 840 880 450 500 550 600

Частота, см

-1

Частота, см

Рис. 6. Результат сравнительного анализа линий амид I (а), амид III (б), тирозинового дублета (в), дисульфидных мостиков (г). Линия — КР-спектр лиофилизованного альбумина; кружки — КР-спектр аморфной фракции пленки альбумина, высохшей на наноалмазной пленке nd_1; треугольники — КР-спектр

кристалла альбумина

вания и др. [14]. Во всех методах зарождение и рост кристаллов происходит в перенасыщенных растворах, вследствие агрегации высокоупорядоченным образом. Однако о кристаллизации белков на твердых поверхностях говорится лишь в единичных работах, например [15]. Насколько нам известно, кристаллизация белков на поверхностях наноалмазных пленок до сих пор не наблюдалась.

Высохшая белковая пленка полностью отслаивается от поверхности пленки nd_1, что позволяет получать КР-спектры белковой пленки без вклада наноалмаз-ного компонента. Сравнение КР-спектров аморфной и кристаллической составляющих белковой пленки с КР-спектром лиофилизованного альбумина не выявило существенных изменений структуры белка (рис. 6). Однако это не означает, что структура альбумина нативная, так как структура белка в растворе может отличаться от его структуры в кристаллизованном состоянии [16]. Кроме того, отсутствие отличий в кон-формаци альбумина в аморфном и кристаллическом состоянии имеет место только в части вторичной структуры, структуры дисульфидных мостиков и тирозинового дублета.

Альбумин на наноалмазной пленке пд_2. Нанесение раствора альбумина на пленку nd_2 не приводит к появлению кристаллов (рис. 7) в отличие от

Рис. 7. Пленка альбумина на поверхности наноалмазной пленки Ы_2

Частота, см"1

Рис. 8. КР-спектры пленки альбумина на поверхности наноалмазной пленки Ы_2 (а), пленки Ы_2 (б)

предыдущего случая. Панорамный КР спектр пленки альбумина на наноалмазной пленке nd_2 представлен на рис. 8. Видно, что помимо белковых линий в спектре присутствуют также полосы, характерные для чистой пленки nd_2 на кремниевой подложке (кривая б на рис. 8). Как и в случае пленки nd_1, не было выявлено существенных изменений вторичной структуры, структуры дисульфидных мостиков и тирозинового дублета альбумина после его адсорбции на нанаоалмазной пленке по сравнению с этими элементами структуры лиофолизованного альбумина (рис. 9).

В результате проведенной работы показана возможность самопроизвольной кристаллизации белка при высыхании раствора на поверхности наноалмазной пленки. Кристаллизация альбумина происходила только на поверхности наноалмазной пленки, в составе которой больше наноалмазной фракции размером менее 2 нм, и не наблюдалась для чистых кремниевых подложек и пленки, состоящей преимущественно из микроалмаза и графита.

Рис. 9. Результат сравнительного анализа линий амид I (а), амид III (б), тирозинового дублета (е), дисульфидных мостиков (г). Линия — КР-спектр пленки альбумина, высохшего на поверхности наноалмазной пленки Ы_2; кружки — линейная комбинация КР-спектров лиофилизованного альбумина и пленки Ы_2

Заключение

Отсутствие спектральных отличий во вторичной структуре, структуре дисульфидных мостиков и тиро-зинового дублета для альбумина в лиофилизованном состоянии и в пленке на наноалмазной основе говорит о сохранении структуры белка, по крайней мере в объеме белковой пленки толщиной 1 мкм. Однако нельзя исключить изменения конформации альбумина при взаимодействии с наноалмазными пленками в достаточно тонком приповерхностном слое пленки белка (порядка 20 нм). В качестве косвенного подтверждения такого рода взаимодействия можно рассматривать кристаллизацию альбумина на наноалмазной поверхности.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 13-02-01177-а) и Программы развития Московского университета.

Список литературы

1. Fu C.-C., Lee H.-Y., Chen K. et al. // Proc. of the National Academy of Sci. of the USA. 2007. 104, N 3. P. 727.

2. Mochalin V.N., Shenderova O., Ho D., Gogotsi Y. // Nature Nanotechnology. 2012. 7.

3. Krueger A. // Chem. Eur. J. 2008. 14, N 5. P. 1382.

4. Ho D. Nanodiamonds: Applications in Biology and Nanoscale Medicine. Springer, 2009.

5. Lin Y.-C., Tsai L.-W., Perevedentseva E.V. et al. // J. of Biomed. Optics. 2012. 17, N 10. P. 101512.

6. Переведенцева Е.В., Су Ф.-И., Су Т.-Х. и др. // Квантовая электроника. 2010. 40. № 12. C. 1089.

7. Mona J., Kuo C.-J, E. Perevedentseva E.V. et al. // Diamond and Related Materials. 2013. 39. P. 73.

8. Пшенкина Н.Н. // Биомед. журн. Фармакология. 2011. 12. С. 1067.

9. Carey P.R. Biochemical Applications of Raman and Resonance Raman Spectroscopes. N.Y., 1982.

10. Brandt N.N., Chikishev A.Y. // Laser Physics. 2004. 14, N 11. P. 1386.

11. Obraztsov A.N., Zolotukhin A.A., Ustinov A.O. et al. // Carbon. 2003. 41, N 4. P. 836.

12. Zolotukhin A.A., Dolganov M.A., Obraztsov A.N. // Diamond and Related Materials. 2013. 37. P. 64.

13. Ferrari A.C., Robertson J. // Philosophical Transactions of the Royal Society. A. 2004. 362. P. 2477.

14. McPherson A. Crystallization of biological macromolecules. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.

15. Fermani S., Falini G., Minnucci M., Ripamonti A. // J. of Crystal Growth. 2011. 224, N 3-4. P. 327.

16. Брандт Н.Н., Чикишев А.Ю., Сотников А.И. и др. // Докл. РАН. 2001. 376, №5. C. 687.

Raman spectroscopy of albumin interaction with nanodiamond films

N.N. Brandt1a, R.R. Ismagilov2, A. V. Priezzhev13b, A. S. Svetlakova1, A.Yu. Chikishev3

1 Department of General Physics and Wave Processes;

2 Department of Polymer and Crystal Physics, Faculty of Physics;

3 International Laser Center,

M. V. Lomonosov Moscow State University, Moscow 119991, Russia. E-mail: a brandt@physics.msu.ru, b avp2@mail.ru.

This study is focused on finding the possible structural changes of molecules of one of the principal proteins of blood plasma (albumin) that occur upon their interaction with nanodiamonds. The interaction between nanodiamond films and protein films that form after solutions dry up is analyzed. A possibility of spontaneous protein crystallization after the solution dries up on the surface of a nanodiamond film is demonstrated. It is found by means Raman spectroscopy that the secondary structure, the structure of disulfide bridges, and the structure of the tyrosine doublet of the protein do not change (with respect to the corresponding structures in the lyophilized state) upon the interaction of the protein with a nanodiamond film, at least in the bulk of a protein film with a thickness of 1 цm. However, conformational changes may occur in a fairly thin (about 20 nm) near-surface layer of the protein film.

Keywords: Raman spectroscopy, plasma proteins, albumin, nanoparticles, nanodiamonds, conformation of proteins. PACS: 42.62.Fi, 87.14.Ee, 87.15.-v, 87.15.He, 87.15.Nn. Received 10 April 2014.

English version: Moscow University Physics Bulletin 6(2014). Сведения об авторах

1. Брандт Николай Николаевич — канд. физ.-мат. наук, доцент; тел.: (495) 939-11-06, e-mail: brandt@physics.msu.ru.

2. Исмагилов Ринат Рамилович - канд. физ.-мат. наук, науч. сотрудник; тел.: (495) 939-41-26, e-mail: ismagil@polly.phys.msu.ru.

3. Приезжев Александр Васильевич — канд. физ.-мат. наук, ст. науч. сотрудник, доцент; тел.: (495) 939-26-12, e-mail: avp2@mail.ru.

4. Светлакова Анастасия Сергеевна — студентка; тел.: (495) 939-26-12, e-mail: svetlakova.anastasiya@physics.msu.ru.

5. Чикишев Андрей Юрьевич — доктор физ.-мат. наук, доцент; тел.: (495) 939-11-06, e-mail: ach58@yandex.ru.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.