CC BY
48
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616.932-078:615.45
А.Б. мазрухо1, О.А. Татаренко1, Л.П. Алексеева1, В.В. Агафонова1, О.А. Шалу1, Р.В. Писанов1, Г.В. Айдинов2, Н.А. Ступина2
изучение возможности использования новых препаратов для серологической диагностики возбудителя холеры в работе специальных противоэпидемических бригад
1ФКУз Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора; 2ФБУз Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области, Ростов-на-Дону
В ходе тактико-специального учения с развертыванием подразделений на базе мобильного комплекса (МК СПЭБ) проведена апробация разработанных в институте диагностических препаратов на основе моноклональных антител (МКА). Установлено, что диагностические агглютинирующие и флюоресцирующие моноклональные иммуноглобулины по чувствительности не уступают поликлональным коммерческим препаратам и могут быть использованы на этапах лабораторной диагностики холеры как в условиях стационарной лаборатории, так и в работе мобильного комплекса СПЭБ. Метод дот-иммуноанализа на основе МКА наравне с общепринятыми методами МФА, слайд-агглютинация, ПЦР может быть использован в комплексе методов для ускоренной диагностики холеры.
Ключевые слова: специализированные противоэпидемические бригады, моноклональные антитела, холерный вибрион, диагностика
A.B. Mazrukho, O.A. Tatarenko, L.P. Alekseyeva, V.V. Agafonova, O.A. Shalu, R.V. Pisanov, G.VAiydinov, N.A. Stupina THE ANALYSIS OF POSSIBILITY TO APPLY NEW PREPARATIONS IN SEROLOGIC DIAGNOSTIC OF AGENT OF CHOLERA IN WORKING ACTIVITY OF SPECIALIZED ANTI-EPIDEMIC BRIGADES
The Rostov-on-Don antiplague institute of Rospotrebnadzor, Rostov-on-Don, Russia; The center of hygiene and epidemiology in the Rostov oblast, Rostov-on-Don, Russia
The approbation of diagnostic preparations on the substrate of monoclonal antibodies developed in the institute was carried out during tactical specialized exercise with building up of units on the basis of mobile complex of specialized anti-epidemic brigades. It is established that diagnostic agglutinating and fluorescent monoclonal immunoglobulins by their sensitivity are equal to polyclonal commercial preparations and can be used at the stages of laboratory diagnostic of cholera both in conditions of stationary laboratory and mobile complex of specialized anti-epidemic brigades. The method of dot immunoanalysis on the substrate of monoclonal antibodies can, on a par with such common methods as immunofluorescence, slide-agglutination and polymerase chain reaction, be applied in complex of methods of express-diagnostic of cholera.
Key words: specialized anti-epidemic brigades, monoclonal antibodies, сomma bacilus, diagnostic
Холера продолжает оставаться одной из актуальных социально значимых опасных инфекционных болезней. Прогноз по этой инфекции для России остается неблагоприятным, а эпидемиологическая обстановка оценена как неустойчивая, что диктует необходимость привлечения в лабораторную диагностику холеры новых препаратов, отвечающих современным требованиям, и оценку возможности их применения в работе специализированных противоэпидемических бригад (СПЭБ) - сил оперативного реагирования по ликвидации санитарно-эпидемиологических последствий чрезвычайных ситуаций различного характера.
В настоящее время в России отсутствуют зарегистрированные препараты на основе моноклональных антител (МКА) для диагностики холеры, что определяет актуальность исследований, касающихся оценки МКА как диагностических реагентов и возможности их использования в работе СПЭБ.
Сотрудниками лаборатории гибридом Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института разработаны новые препараты: набор реагентов «Иммуноглобулины моноклональные диагностические флюоресцирующие сухие для серологической идентификации Vibrio cholerae О1 и О139 (in vitro) методом РИФ" и набор реагентов "Иммуноглобулины моноклональные диагностические агглютинирующие сухие для серологической идентификации Vibrio cholerae О1 и О139 (in vitro)
методом слайд-агглютинации" - они прошли испытание на большом числе гомологичных и гетерологичных штаммов и будут представлены для государственной регистрации.
В зарубежной практике для детекции холерных вибрионов широко используются различные варианты им-муноферментного анализа [5, 7], однако они до сих пор не нашли применения в отечественной схеме лабораторной диагностики холеры. Особого внимания заслуживает дот-иммуноанализ (ДИА), который является одним из наиболее эффективных и доступных экспресс-методов и характеризуется высокой чувствительностью, быстротой выполнения и визуальной оценкой результатов.
Цель настоящей работы - апробация в ходе тактико-специальных учений СПЭБ диагностических препаратов для обнаружения холерных вибрионов серогрупп О1 и О139 в методах прямой иммунофлюоресценции, слайд-агглютинации, и оценка возможности использования ДИА в схеме лабораторной диагностики холеры.
Материалы и методы. При проведении тактико-специального учения СПЭБ на исследование поступило 20 проб (нумерация проб № 1-20): 10 из реальных объектов окружающей среды (вода поверхностных водоемов и стоков) и 10 учебных проб (7 из них были искусственно контаминированы штаммом V. Ло1егае еИюг 5879 до конечной концентрации возбудителя в пробе 103—107 микробных клеток (м.к.) на 1 мл).
Поступившие пробы исследовали с применением
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 5, 2013
МФА и ПЦР. После приготовления мазков из учебных проб, контаминированных возбудителем холеры О1, их обрабатывали следующими препаратами: коммерческими - «Иммуноглобулины диагностические флюоресцирующие холерные, адсорбированные лошадиные» (ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов); экспериментальными - «Иммуноглобулины диагностические флюоресцирующие холерные О139 адсорбированные кроличьи» (ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов), - набор реагентов «Иммуноглобулины моноклональные диагностические флюоресцирующие сухие для серологической идентификации Vibrio cholerae О1 и О139 (in vitro) методом РИФ" (ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора).
Все 20 проб, в том числе и из объектов окружающей среды (ООС), подрощенные во втором пептоне (третий этап диагностики), исследовали с помощью МФА и непрямого ДИА. Постановка ДИА включала нанесение на нитроцеллюлозную мембрану - НЦМ (Bio-Rad) материала второго пептона из всех исследуемых проб в дозе 2 мкл на точку. Диагностические МКА О1, МКА О139 брали в рабочем разведении 1:1000. Визуализацию реакции проводили с помощью антимышиного пероксидазного конъюгата и 3,3-диаминобензидина-4-гидрохлорида - ДАБ (Sigma, США). Отмывание НЦМ и внесение реагентов осуществляли согласно протоколу для ДИА [6].
Постановку реакции агглютинации на стекле проводили с помощью коммерческих препаратов: - лошадиных диагностических агглютинирующих О-сывороток (ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб", Саратов), кроличьей агглютинирующей сыворотки (ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб", Саратов). Также апробированы экспериментальные серии набора реагентов "Иммуноглобулины моноклональ-ные диагностические агглютинирующие сухие для серологической идентификации Vibrio cholerae О1 и О139 (in vitro) методом слайд-агглютинации" (ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора).
Результаты и обсуждение. В ходе тактико-специального учения на тему "Выдвижение, развертывание и организация работы СПЭБ на базе мобильного комплекса (МК СПЭБ) в автономных условиях по индикации и идентификации холерных вибрионов", состоявшегося в 2010 г., проведена апробация разработанных в институте диагностических препаратов на основе МКА. На первом этапе исследования в соответствии с МУК 4.2.2218-07 по лабораторной диагностике холеры мазки из учебных проб, содержащих разное количество возбудителя холеры О1, исследованы в МФА с поли-клональными флюоресцирующими иммуноглобулинами и экспериментальными сериями ФИТЦ-МКА О1 и ФИТЦ-МКА О139. Диагностические поли- и монокло-нальные препараты сопоставимо выявляли возбудителя холеры О1 в одних и тех же пробах (№ 11, 12, 13, 20), но ФИТЦ-МКА обеспечивали более яркое свечение по сравнению с поликлональными флюоресцирующими иммуноглобулинами. Результат МФА получен через 3 ч от начала исследования, а через 3,5 ч ПЦР анализ подтвердил наличие токсигенных холерных вибрионов в тех же пробах, кроме пробы № 14, которая по данным МФА была сомнительной, а по данным ПЦР - отрицательной (см. таблицу). Исследование проб из ООС предполагает вначале первичное накопление вибрионов - посев I и II
пептонов (согласно МУК 4.2.2218-07) и их дальнейший анализ с помощью диагностических препаратов. Все 20 проб после подращивания, начиная со II пептона, исследовали с помощью поликлональных флюоресцирующих иммуноглобулинов и экспериментальных серий ФИТЦ-МКА О1 и ФИТЦ-МКА О139. Для анализа этих же проб привлечен метод ДИА, который на сегодняшний день не включен в перечень регламентированных методов лабораторной диагностики холеры. Зарегистрирована положительная реакция МКА О1 с пробами из воды поверхностных водоемов № 6, 9, 10, а также с пробами № 11-14, 20, инфицированными клетками токсигенного штамма (см. таблицу). Результаты ДИА подтверждены в МФА на основе поликлональных и моноклональных ФИТЦ-препаратов. При взаимодействии клеток вибрионов испытуемых проб с поли- и моноклональными препаратами, специфичными в отношении Vibrio cholerae О139, свечения не наблюдалось ни в ДИА, ни в МФА.
На следующем этапе работы подозрительные колонии, отобранные со щелочного агара через 12-18 ч инкубации после высева на него материала проб № 6, 9-14, 20, взятого со II пептона, исследовали в реакции слайд-агглютинации с регламентированными поликлональными агглютинирующими сыворотками и аналогичными экспериментальными препаратами на основе МКА. В реакции слайд-агглютинации эти препараты с культурами из проб № 6, 9-14, 20 образовывали хлопья специфического агглютина-та. По данным ПЦР в пробах № 9-14, 20, подозрительных в отношении Vibrio cholerae О1, обнаружено наличие ампли-фиката, соответствующего гену холерного токсина (ctx+), т.е. выделенные штаммы представляют эпидемическую опасность. В пробе № 6 амплификата, соответствующего гену холерного токсина, не обнаружено - выделенный штамм атоксигенный (ctx-). Данные о наличии холерных вибрионов в учебных пробах, полученные при постановке серологических методов МФА, слайд-агглютинации, ДИА с использованием поликлональных препаратов и препаратов на основе МКА подтверждены результатами выделения из данных проб культур Vibrio cholerae.
В рамках плановых учений для решения тактической задачи мобильной лаборатории СПЭБ на базе автошасси нами наряду с коммерческими апробированы экспериментальные препараты на основе МКА для ускоренной диагностики возбудителя холеры серогрупп О1 и О139. На основании результатов, полученных с помощью МФА и ПЦР, через 3,5 часа от начала исследования выдан первый устный ориентировочный положительный ответ о возможном наличии эпидемически опасного (ctx+) варианта возбудителя холеры серогруппы 01 в учебных пробах, № 11-14 и 20. Экспериментальные серии ФИТЦ-МКА О1, ФИТЦ-МКА О139 обладают чувствительностью на уровне 105 м.к/мл, т.е. аналогично коммерческим диагностическим флюоресцирующим холерным иммуноглобулинам. Проведенные ранее исследования свидетельствуют о строгой специфичности флюоресцирующих и агглютинирующих иммуноглобулинов, что подтверждается отсутствием перекрестной реактивности с препаратами близкородственных и ге-терологичных микроорганизмов [1, 3, 4]. На сегодняшний день различные варианты иммуноферментного метода не входят в схему лабораторной диагностики холеры [2]. Для анализа учебных проб привлечен метод ДИА, постановка которого не требует специального приборного оснащения, продолжительность анализа составляет 2,5-3 ч, оценка визуальна и чувствительность порядка 105-106 м.к/мл. Использование дот-ИФА при анализе учебных проб, начиная со II пептона, позволило получить ответ через 13 ч от начала исследования и выявить наличие возбудителя Vibrio
результаты выявления холерных вибрионов в пробах, исследованных в ходе учений
Материал для исследования № пробы Анализ учебных проб в методах: Анализ проб после подращивания (II пептон) в методах: Результаты выделения культуры V. cholerae О1 бактериологическими методами
МФА ДИА ПЦР МФА ДИА ПЦР Бакгруппа мобильной лаборатории СПЭБ Бакгруппа стационарной лаборатории
Пробы из ООС
Пробы искусственно контаминиро-ванные токсиген-ным штаммом V. cholerae eltor 5879
15
16
17
18
19
20
Исследования не проводились в связи с низкой концентрацией клеток
6 + + - + +
7 - - - - -
8 - - - - -
9 + + + + +
10 + + + + +
11 + + + + + + + +
12 + + + + + + + +
13 + + + + + + + +
14 +/- + - + + - + +
+
+
+
+
+
+
+
+
cholerae 01 в тех же пробах, в которых он обнаружен с помощью МФА и ПЦР.
Взаимодействие чистых культур, выделенных из учебных проб, с поликлональными и моноклональными агглютинирующими иммуноглобулинами сопровождалось образованием в обоих случаях четкого крупного агглюти-ната. Применение в лабораторной практике высокоспецифичных агглютинирующих МКА более перспективно, так как позволяет исключить перекрестные реакции с представителями холерных вибрионов не О1/ не О139, среди которых в последние годы увеличивается число штаммов, агглютинирующихся холерной сывороткой О1, что затрудняет дифференциацию соответствующих культур [1]. Привлечение в реакцию слайд-агглютинации моноклональных иммуноглобулинов позволит исключить постановку развернутой реакции агглютинации, что значительно сократит время анализа и материальные расходы.
Апробация в ходе тактико-специального учения СПЭБ экспериментальных диагностических препаратов на основе МКА, используемых в различных серологических реакциях, показала их высокую эффективность, что дает возможность в перспективе дополнить алгоритм исследования на холеру новыми, надежными диагностическими тестами.
Выводы. 1. В результате проведенных испытаний в ходе тактико-специального учения СПЭБ установлено, что разработанные специалистами Ростовского-на-Дону противочумного института диагностические агглютинирующие и флюоресцирующие моноклональные иммуноглобулины по чувствительности не уступают по-ликлональным коммерческим препаратам и могут быть
использованы на этапах лабораторной диагностики холеры как в условиях стационарной лаборатории, так и в работе МК СПЭБ.
2. Использование дот-иммуноанализа при исследовании проб показало, что ДИА на основе МКА наравне с общепринятыми методами МФА, слайд-агглютинация, ПЦР может быть использован в комплексе методов для ускоренной диагностики холеры.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алексеева Л.П., Кругликов В.Д., Ломов Ю.М., Евдокимова В.В., АвдееваЕ.П., Фатеева О.Ф., ЯговкинМ.Э. Клиническая лабораторная диагностика. 2010; 11: 53-6.
2. Алексеева Л.П., Телесманич Н.Р., Ломов Ю.М., Храмов М.В., Кругликов В.Д., Агафонова В.В. и др. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2010; 6: 88-93.
3. Фатеева О.Ф., Алексеева Л.П., Кузьмина Г.А., Яговкин М.Э., Кругликов В.Д., Архангельская И.В., Григоренко Л.В. В кн.: Холера и патогенные для человека вибрионы: Материалы пробл. комиссии. Ростов н/Д., 2011; 24: 180-3.
4. Кретенчук О.Ф., Алексеева Л.П., Маркина О.В., Яговкин М.Э., Бурша О.С. В кн.: Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения: Материалы Всероссийской науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов Роспотреб-надзора. Пермь, 2012; 1: 334-8.
5. Colwell R.R., Hanas J.A., HuqA., Loomis L., Siebeling R.J., Torres M. et al. FEMS Microbiol. Lett. 1992; 76(3): 215-9.
6. SupawatK., HuttayananontS., KusumM. et al. Asian Pac. J. Allergy Immunol. 1994; 12(2): 155-9.
7. Qadri F., Chowdhury A., Hossain J., Chowdhury K., Azim T., Shi-mada T. et al. J. Clin. Microbiol. 1995; 33: 509-10.
Поступила 10.10.12
