CC BY
67
УДК 611.018.51+611.018.18
ИЗУЧЕНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ СВЕТОДИОДНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ
АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ IN VITRO
О.В. СТОЛБОВСКАЯ, Р.М. ХАЙРУЛЛИН
Ульяновский государственный университет, ул. Л. Толстого, 42, г. Ульяновск, 432017
Аннотация: авторы исследовали упруго-вязкостные свойства цитоплазматической мембраны эритроцитов здоровых доноров и больных сахарным диабетом методом атомно-силовой микроскопии. Воздействие светодиодным излучением красного диапазона в условиях in vitro на эритроциты приводит к изменениям упруговязкостных свойств цитоплазматической мембраны. Выявлены различия структурно-функционального состояния плазматической мембраны эритроцитов здоровых доноров и больных сахарным диабетом.
Ключевые слова: эритроциты, атомно-силовая микроскопия, светодиодное излучение красного диапазона
THE STUDY OF LIGHT-DIODE RADIATION EFFECT ON STRUCTURAL AND FUNCTIONAL STATE OF THE CYTOPLASMIC MEMBRANE OF HUMAN BLOOD ERYTHROCYTES BY THE METHOD OF ATOMIC FORCE
MICROSCOPY IN VITRO
O.V STOLBOVSKAYA, R.M KHAYRULLIN
Ul'yanovsk State University
Abstract: the authors studied the elastic-viscous properties of the cytoplasmic membrane of red blood cells obtained from healthy donors and patients with diabetes mellitus by the atomic force microscopy. The impact of red LED-light in vitro on red blood cells leads to changes in the elastic-viscous properties of the cytoplasmic membrane. The study found differences in the structural and functional state of the plasmic membrane of red blood cells of the healthy donors and patients with diabetes.
Key words: red cells, atomic force microscopy, light-diode radiation.
Светодиодное излучение красного диапазона внедряется в клиническую практику наряду с лазерным излучением при лечении различных заболеваний. Светодиодное (некогерентное) излучение красного диапазона (СДИКД) обладает идентичным низкоинтенсивному лазерному излучению биологическим действием на различные клеточные и тканевые структуры, что определяет успех его применения при коррекции функциональных нарушений [3,4]. В основе действия низкоинтенсивного лазерного излечения красного света на биологические объекты лежит обратимая модификация пространственной структуры компонентов клетки, переориентация молекул мембран и как следствие - изменение их регуляторных функций [3,4,7]. Выраженные биологические эффекты красного светодиодного некогерентного излучения требуют теоретического обоснования и раскрытия механизмов его действия на молекулярном и клеточном уровнях. В механизме действия СДИКД на клетку важную роль играют молекулярные изменения биологической мембраны, оказывающие существенное влияние на способность к деформациям, на активность мембранно-связанных ферментов и т.д. Одним из наиболее общих интегральных показателей структурно-функционального
состояния мембран на молекулярном уровне являются упруго-вязкостные свойства отражающие способности клеток обратимым деформациям и адгезии в норме и патологии [2,5,8,9].
Цель исследования - изучение воздействия светодиодного излучения красного диапазона на упруго-вязкостные свойства цитоплазматической мембраны эритроцитов здоровых доноров и больных сахарным диабетом, в условиях in vitro методом атомно-силовой микроскопии.
Материалы и методы исследования. В экспериментах использовали эритроциты крови, которые традиционно служат моделью для оценки глубины повреждения мембран на молекулярном уровне при патологических процессах, протекающих в организме [2,8]. Эритроциты крови здоровых доноров, больных инсулинзависимым сахарным диабетом (ИЗСД) и инсулиннезависимым сахарным диабетом (ИНСД) выделяли по стандартной методике [8]. Первую группу обследованных составили больные ИЗСД (20-35 лет); вторую группу - пациенты с ИНСД (49-71 г.). Возраст здоровых доноров в первой контрольной группе составлял от 20 до 35 лет, а во второй - от 49 до 60 лет. Из каждой исследуемой группы были взяты пробы крови. Диагноз сахарного диабета ставился на осно-
вании клинико-лабораторного обследования в отделении эндокринологии ГУЗ «Ульяновская областная клиническая больница № 1». Больные с ИЗСД получали человеческий рекомбинантный инсулин в индивидуальной дозе по интенсифицированной схеме. На все виды исследований были получены разрешения этической комиссии Ульяновского госуниверси-тета. Исследования проводились с соблюдением прав и свобод определённых законодательством РФ, этическими нормами и принципами в соответствии с Декларацией Хельсинки со всеми последующими дополнениями и изменениями, регламентирующих научные исследования на человеке, а также международным руководством для биомедицинских исследований с вовлечением человека (International ethical guidelines for biomedical research involving human subjects) Совета международных организаций медицинских наук (CIOMS). Все первичные результаты исследований были обезличены в соответствии требованиями п. 3 ст. 6 действующего Федерального закона РФ 152-ФЗ «О персональных данных».
Упруго-вязкостные свойства клеточной мембраны эритроцитов оценивали с помощью модуля изометрического сжатия мембраны (модуля Юнга), характеризующего способность клетки к деформациям, возникающим при взаимодействии мембраны с вершиной зонда АСМ, и чем больше его значения, тем меньше упругие деформации клетки. Модуль Юнга (MPa) клеточной мембраны эритроцитов измеряли методом атомно-силовой спектроскопии. Для расчета модуля Юнга использовали модель Герца [1,6]. Для исследования поверхности эритроцитов использовали сканирующий зондовый микроскоп Solver P47-PRO (ЦНТИМ). Использовались неконтактные кремниевые зонды серии NSG10 (NT-MDT) с жесткостью 5,5 Н/м, резонансной частотой приблизительно 150 кГц, радиусом закругления 10 нм, высота зонда 10-20 мкм [2,4]. Проводили сканирование 50 клеток из каждой исследуемой группы в контактном режиме на воздухе.
Эритроциты облучали некогерентным светодиодным излучением красного диапазона (СДИКД) в условиях in vitro, затем высушивали на воздухе [2]. В качестве источника СДИКД использовали прибор типа «карандаш». Излучающим устройством являлись светоизлучающие диоды (n=5), представляющие собой арсенид-галлий-алюминиевые кристаллы красного цвета свечения (длина волны 620-680 нм). Источник характеризуется следующими параметрами: средняя мощность излучения - 2,5 мВт; импульсная мощность излучения - 5 мВт; частота повторения импульса - 50 Гц; длительность импульса - 5 мсек. Время экспозиции эритроцитов в условиях in vitro составляло 2, 5 и 10 мин, соответственно, доза облучения - 1,69 Дж/см2, 4,23 Дж/ см2, 8,46 Дж/см2 [4].
Полученные экспериментальные данные анализировали в программе Nova, Matlab. Статистическую
обработку данных проводили с использованием лицензионной компьютерной программы «Statistica 6.0» StatSoft Inc. (США) с использованием непараметрической статистики по правилам, рекомендованным международным комитетом редакторов биомедицинских журналов (ICMJE). Достоверность различий оценивали на основе U-критерия Манна-Уитни, за достоверность принимали различия на уровне значимости 95% (p<0,05).
Результаты и их обсждение. Морфометрический анализ результатов сканирования АСМ поверхности цитоплазматической мембраны эритроцитов нормальной дисковидной формы здоровых доноров первой и второй контрольной групп, а также эритроцитов больных ИНЗД и ИНСД показал, что значения среднего диаметра эритроцитов исследуемых групп практически не отличаются друг от друга (табл. 1). В условиях воздействия СДИКД на эритроциты in vitro не происходило существенных изменений в диаметре эритроцитов, как доноров, так и больных сахарным диабетом (p>0,05) (табл. 1).
Таблица 1
Показатели морфометрических параметров эритроцитов здоровых доноров и больных ИЗСД и ИНСД при воздействии СДИКД (рш)
Анализ результатов атомно-силовой спектроскопии упругих деформаций эритроцитов доноров, позволил выявить особенности упруго-вязкостных свойств цитоплазматической мембраны эритроцитов. Показатели модуля Юнга эритроцитов доноров обеих контрольных групп значительно выше в периферической части дискоцита по сравнению с центральной частью. В первой контрольной группе (2035 лет) модуль упругости на 77,4% выше чем, в области центрального углубления, а во второй - на 63,3% (p<0,05) (табл. 2, 3).
В условиях прямого воздействия СДИКД на эритроциты доноров первой контрольной группы in vitro в дозе 1,69 Дж/см2, модуль Юнга периферической зоны эритроцитов снижается на 32,3%, в дозе
4,23 Дж/см2- на 77,4%,(p<0,05), что отражает увеличение упруго-вязкостных свойств клеточной мембраны, а следовательно, повышение плотности упаковки липидов. В центральном углублении эритроцитов плотность упаковки липидов практически не изменяется по сравнению с контролем (табл. 2). При уве-
№ Эритроциты Диаметр (|ат) Доза облучения СДИКД
1<б9 Дж/см2 4,23 Дж/см2 8,4б Дж/см2
1. Контрольная группа 1 8,03±0,09 8,11±0,09 8,29±0,12 7,91±0,08
2. ИЗСД 8,48±0,08 8,33±0,07 8,50±0,09 8,17±0,09
3. Контрольная группа 2 8,27±0,12 8,37±0,1 8,72±0,17 8,3±0,12
4. ИНСД 7,45±0,15 7,31±0,13 7<5б±0<11 7,28±0,13
Примечание: достоверные отличия p>0,05
личении дозы облучения до 8,46 Дж/см2 происходит резкое снижение упругих свойств мембраны, уменьшение плотности упаковки липидов, о чем свидетельствует увеличение значения модуля Юнга, соответственно, на 67,7 и 80% (p<0,05) (табл. 2).
Таблица 2
Показатели модуля Юнга (MPa) , характеризующие упруго-вязкостные свойства цитоплазматической мембраны эритроцитов здоровых доноров и больных ИЗСД при воздействии различных доз облучения СДИКД
Примечание: * - достоверные отличия опытной группы от группы без облучения р<0,05; Л -достоверные отличия в пределах опытной группы в отношении дозы облучения 1,69 Дж/см2 р<0,05; v - достоверные отличия в пределах опытной группы в отношении дозы облучения 4,23 Дж/см2 р<0,05; " - достоверные отличия между вогнутой и выпуклой частью эритроцита в пределах группы р<0,05
Таблица 3
Показатели модуля Юнга (MPa), характеризующие упруго-вязкостные свойства цитоплазматической мембраны эритроцитов здоровых доноров и больных ИНСД при воздействии различных доз облучения СДИКД
Примечание: * - достоверные отличия опытной группы от группы без облучения р<0,05; ~ - достоверные отличия в пределах опытной группы в отношении дозы облучения 1,69 Дж/см2 р<0,05; ~ - достоверные отличия в пределах опытной группы в отношении дозы облучения 4,23 Дж/см2 р<0,05
При воздействии СДИКД в дозах 1,69 Дж/см2 4,23 Дж/ см2, 8,46 Дж/см2 на эритроциты доноров второй контрольной группы наблюдается снижение модуля Юнга, соответственно, на 93,3%, 90%, 96,7%, (р<0,05) увеличиваются упругие свойства мембраны, повышается плотность упаковки липидов цитоплазматической мембраны эритроцитов (табл.3).
Показатели модуля Юнга мембраны эритроцитов больных ИЗСД в периферической части и в области центрального углубления эритроцитов крови практически не отличаются между собой (табл.2). Модуль упругости клеточной мембраны периферической зоны эритроцитов больных ИЗСД ниже значений соответствующего показателя у эритроцитов первой контрольной группы на 77,4% (p<0,05) (табл. 2). Клеточная
мембрана эритроцитов при ИЗСД характеризуется более высокой упругостью, плотностью упаковки молекул липидов по сравнению с нормальными эритроцитами.
В условиях воздействия СДИКД in vitro на эритроциты крови больных ИЗСД в дозах 1,б9 Дж/см2
4.23 Дж/ см2, 8,4б Дж/см2 модуль Юнга периферической части клеточной мембраны увеличивается на 30%, 89,2%, 89,3% (Р<0,05), соответственно. В центральном углублении эритроцитов модуль упругости увеличивается на 4б,7, б0, 87,9% в зависимости от дозы воздействия (p<0,05) (табл.2).
Показатели модуля изометрического сжатия мембраны эритроцитов крови больных ИНСД в периферической части поверхности эритроцита, и в области центрального углубления практически не отличаются, аналогично показателям у больных ИЗСД (табл. 3). Значения модуля Юнга
периферической части и центральной клеточной мембраны эритроцитов ИНСД ниже показателей второй контрольной группы, соответственно на 93,3 и 81,8% (Р<0,05) (табл. 2, 3). Цитоплазматическая мембрана эритроцитов при ИНСД, также как и при ИЗСД, характеризуется более высокой упругостью, плотностью упаковки молекул липидов по сравнению с нормальными эритроцитами.
В условиях воздействия СДИКД in vitro на эритроциты крови больных ИНСД в дозах 1,б9 Дж/см2,
4.23 Дж/ см2, модуль Юнга
периферической части эритроцитов увеличивается на 33,3 и б0% (Р<0,05), соответственно. В дозе 8,4б Дж/см2 показатель такой же как в эритроцитах при ИНСД, не подвергавшихся воздействиям красного излучения. В центральной области диска
эритроцитов после влияния СДИКД в дозе 1,б9 Дж/см2, 4,23 Дж/см2 модуль Юнга не изменяется (табл. 3). Повышение модуля Юнга мембраны эритроцитов происходит только при облучении дозой 8,4б Дж/см2, однако, не достигает нормальных показателей соответствующих контрольной группе.
Выводы. Использование метода атомно-
силовой спектроскопии для исследования цито-
№ Доза облучения (Дж/см2) Эритроциты здо ровых доноров Эритроциты больных ИЗСД
Периферическая часть поверхности эритроцита Центральное углубление поверхности эритроцита Периферическая часть поверхности эритроцита Центральное углубление поверхности эритроцита
1 Интактные 0,0031±0,001” 0,0007±0,0003" 0,0007±0,00003" 0,0008±0,00005"
2 1<б9 Дж/см2 0,001±0,0002 0,0008±0,0002 0,001±0,00007* 0,0015±0,0003*
3 4,23 Дж/см2 0,0007±0,0002 0<000б±0<0002 0<00б5±0<004*- 0,002±0,0004*
4 8<4б Дж/см2 0<009б±0<003*-“ 0,0035±0,0007*'“ 0<00бб±0<0027 0,00бб±0,0027
№ Доза об-луче-ния (Дж/см2) Эритроциты здоровых доноров Эритроциты больных ИНСД
Периферическая часть поверхности эритроцита Центральное углубление поверхности эритроцита Периферическая часть поверхности эритроцита Центральное углубление поверхности эритроцита
1 Интактные 0,003±0,03 0,0011±0,009 0,0002±0,0003 0,0002±0,0002
2 1,б9 Дж/см2 0,0002±0,0009* 0,0001±0,0002* 0,0003±0,0007* 0,0002±0,0004
3 4,23 Дж/см2 0,0003±0,0004л 0,0002±0,0003л 0,0005±0,0009 0,000б±0,0014*л
4 8,4б Дж/см2 0,0001±0,0002л 0,0002±0,0005л 0,0002±0,0003“ 0,0002±0,0005“
плазматической мембраны эритроцитов доноров и больных сахарным диабетом позволило выявить более высокие значения модуля изометрического сжатия мембраны по периферии диска эритроцитов, по сравнению с областью центрального углубления, что отражает различия в упруго-вязкостных свойствах цитоплазматической мембраны эритроцитов контрольных групп доноров. Показатели модуля Юнга эритроцитов у больных ИЗСД и ИНСД значительно ниже, чем у эритроцитов доноров контрольных групп. Воздействие СДИКД в условиях in vitro на эритроциты доноров носит преимущественно дозозависимый характер, сопровождается понижением показателя модуля Юнга, увеличением упруговязкостных свойств и плотности молекулярной упаковки клеточной мембраны. В тоже время влияние СДИКД на эритроциты больных сахарным диабетом приводит к увеличению значений модуля Юнга, понижению упруго-вязкостных характеристик мембраны и уменьшению плотности упаковки липидов. Повышение или понижение значений модуля Юнга отражает изменения пространственной организации молекулярной структуры цитоплазматической мембраны, происходящие под влиянием красного светодиодного излучения, а также показывает возможность ее коррекции в норме и патологии.
Литература
1. Гущина, Ю.Ю. Исследование различий морфологических параметров клеток крови человека методом сканирующей зондовой микроскопии / Ю.Ю. Гущина, С.Н. Плескова, М.Б. Звонкова // Поверхность. Ренгеновские, cинхронные и нейтронные исследования.- 2005.- № 1.- С. 48-53.
2. Карандашов, В.И. Фототерапия (светолечение): Руководство для врачей / В.И. Карандашов, Е.Б. Петухов, В.С. Зродников.- М.: Медицина, 2001.- 392 с.
3. Колосова, М.В. Состав липидов мембран эритроцитов и их биофизические характеристики у детей с инсулинзависимым сахарным диабетом в процессе терапии / М.В. Колосова, В.В. Новицкий, Е.А. Степовая // Клиническая лабораторная диагностика-2001.- № 1.- С. 1-12.
4. Молекулярные нарушения мембраны эритроцитов при патологии разного генеза являются типовой реакцией организма: контуры проблемы /
B.В. Новицкий [и др.] // Бюллетень сибирской медицины.- 200б.- № 2.- С. б2-б9.
5. Лагутина, А.А. Состояние клеточных мембран при сахарном диабете и его изменение под воздействием гипербарического кислорода / А.А. Лагутина, А.А. Белявский, С.А. Белявский // Анестезиология и реаниматология.- 2004.- № 3.- С. 57-58.
6. Лебедев, Д.В. Измерение модуля Юнга биологических объектов в жидкой среде с помощью специального зонда атомно-силового микроскопа / Д.В. Лебедев, А.П. Чукланов, А.А. Бухараев, О.С. Дружинина // Письма в ЖТФ. 2009.- Т.35.- №8.-
C. 54-б1.
7. Столбовская, О.В. Функциональная активность нейтрофилов крови при сахарном диабете и ее коррекция некогерентным светодиодным излучением красного диапазона in vitro / О.В. Столбовская, Р.М. Хайруллин, Т.К. Куликова // Морфологические ведомости.- 2005.- № 1-2.- С. 232-232.
8. Федорова, М.З. Использование атомносиловой микроскопии для оценки морфометрических показателей крови / М.З. Федорова, Н.А. Павлов, Е.В. Зубарева, С.В. Надеждин, В.В. Симонов, Н.А. Забиняков, Е.С. Тверигина // Биофизика-2008.- Т. 53.- вып. б.- С. 1014-1018.
9. Francis, L.W. Atomic force microscopy comes of age / L.W. Francis, P.D. Lewis, C.J. R.S. Conlan // Biology Cell.- 2010.- Vol. 102.- № 2.- Р. 133-143.
УДК 614.8.086.52
ВЛИЯНИЕ АНТИОКСИДАНТА ЛИГАНД НА ДИНАМИКУ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ У
ОБЛУЧЕННЫХ КРЫС
Р. А. ТАРУМОВ, А.А. АНТУШЕВИЧ
Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова, улица академика Лебедева, 6, г. Санкт-Петербург, 194044
Аннотация: целью исследования явилось изучение радиозащитной эффективности литиевой соли глута-тиона (литана) на модели экспериментальной радиационно-индуцированной гемодепрессии у крыс. Оценку ра-диозащитной эффективности литана проводили путем изучения изменения динамики содержания лейкоцитов, тромбоцитов и эритроцитов периферической крови в различные сроки после воздействия ионизирующего излучения. Установлено, что применение литана в лекарственной форме или виде субстанции в течение 5 сут после рентгеновского облучения в дозе 5 Гр по одному разу в день способствовало существенному снижению глубины падения количества тромбоцитов и лейкоцитов.
Ключевые слова: облучение, антиоксиданты, литан, гемостимулирующая активность, периферическая кровь.
