CC BY
15УДК: 619:615.28:579.842.1/.2:636.52/.58.033
изучение влияния цитринина на возникновение
дисбактериоза и полирезистентности микроорганизмов семейства enterobacteriaceae
'В.Н.Афонюшкин - кандидат биологических наук, зав. сектором; 1Н.А.Донченко - доктор ветеринарных наук, директор; Ю.Н.Козлова - кандидат биологических наук, мл.н.с.;
2Н.А.Давыдова - кандидат ветеринарных наук, ст.н.с.; 2В.С.Черепушкина - мл.н.с.;
3О.А.Фролова - мл.н.с.
1Сибирский Федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук, р.п.Краснообск (630501, Новосибирская область, Краснообск, e-mail: lisocim@mail.ru).
2Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, г.Новосибирск (630090, Новосибирск, пр. Ак.Лаврентьева, 8, e-mail: niboch@niboch.nsc.ru). 3Красноярский научно-исследовательский институт животноводства - обособленное подразделение Федерального исследовательского центра Красноярского научного центра Сибирского отделения Российской академии наук, г.Красноярск (660049, Красноярск, пр.Мира, 66, а/я 25524, e-mail: kristal_o@bk.ru).
У цыплят-бройлеров после употребления цитринина с кормом наблюдали, статистически достоверное, снижение концентрации лактобактерий в кишечнике на 0,61 Log10 КОЕ/грамм (Р=0,03). Контакт микрофлоры кишечника с цитринином привел к снижению концентрации бактерий, чувствительных к энрофлоксацину, и вызвал увеличение удельной доли бактерий, устойчивых к энрофлоксацину. На основании культуральных данных биоразнообразие микробиоты кишечного содержимого у цыплят опытной и контрольной групп не различалось. Среди доминантных микроорганизмов сем. Enterobacteriaceae превалировали два морфотипа - колонии синего цвета (Enterobacter spp.) и розового цвета (E.coli) (на среде уриселект 4), т.е. продуцирующие глюкуронидазу и галактозидазу, соответственно. Статистически достоверно в опытной группе была снижена концентрация бактерий, образующих колонии синего цвета на среде без энрофлоксацина и при концентрации энрофлоксацина 0,2 мкг/мл. При концентрации энрофлоксацина 4 мкг/мл количество выросших колоний у цыплят контрольных и опытных групп не различалось. Следовательно, число резистентных к энрофлоксацину форм бактерий у цыплят опытных и контрольных групп не менялось. Корреляционный анализ позволил установить отрицательную корреляцию между концентрацией эн-рофлоксацина и концентрацией микроорганизмов (Enterobacter spp.) в кишечнике (r=-0,805 и -0,90 для опытной и контрольных групп, соответственно), что также подтверждает меньшее влияние энрофлоксацина на снижение количества бактерий после обработки цитринином. Второй доминантный вид бактерий кишечной микробиоты E.coli характеризовался отсутствием зависимости между концентрацией энрофлоксацина в питательной среде и концентрацией бактерий. Таким образом, и в контрольной и в опытной группах цыплят, все бактерии данного морфотипа были резистентны к энрофлоксацину вне зависимости от контакта с цитринином. Подтверждена гипотеза об отрицательном влиянии повышенного уровня цитринина на микробиоту кишечника. Влияния цитринина на устойчивость кишечной палочки к энрофлоксацину не обнаружено. Контакт микробиоты кишечника птицы с мико-токсинами, в частности с цитринином, может приводить не только к развитию дисбактериоза, но и способствовать накоплению антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов.
КЛючЕВЫЕ СЛОВА: цитринин, цыплята, сальмонеллы, кишечная палочка, антибиотикорезистент-ность, антибиотикочувствительность.
0 беспечение, как безопасности продуктов питания, так и здоровья животных требует противодействия патогенным микроорганизмам. Без антибиотиков это невозможно. Тем не менее, проблема устойчивости бактерий к антибиотикам встречается и в ветеринарии. Что безопаснее - снижать концентрацию опасных для человека бактерий в пищевых продуктах, используя антибиотики в животноводстве, или ограничить потребление антибиотиков в ветеринарии, повысив потребление антибиотиков населением? Это вопрос остается нерешенным. Однако, необходимость борьбы с антибиотико-резистентными формами бактерий совершенно очевидна.
Антибиотико-устойчивые штаммы сальмонелл часто обнаруживаются в пищевых продуктах животного происхождения [1, 2]. В последние годы наблюдается рост числа штаммов сальмонелл, устойчивых к фтор-хинолонам и цефалоспоринам [3-5]. Согласно сообщению NARMS от 2010 г. возросла частота выделения полирезистентных штаммов сальмонелл, например, серовара Typhimurium устойчивого к ампициллину, хлорамфениколу, стрептомицину, сульфаметоксазо-лу /ульфисоксазолу и тетрациклину (ACSSuT), а также сальмонелл серовара Enteritidis, устойчивых к на-лидиксовой кислоте. Серовары Newport, Heidelberg, Dublin, также часто характеризуются устойчивостью
к антибиотикам различных групп. Среди полирезистентных сальмонелл (более 5 антибиотиков) наиболее часто встречаются сальмонеллы эпидемически значимых сероваров: Typhimurium, Heidelberg, Dublin, Paratyphi B, and I4 [6]. Хотя S.Enteritidis широко распространена у населения, штаммы этого серовара считаются менее резистентными в сравнении с другими сероварами. Механизмы устойчивости сальмонелл к антибиотикам включают ферменты деградирующие антибиотики (бет-лактамазы), эффлюкс - помпы (системы, обеспечивающие выведение широкого спектра антибиотиков из бактериальной клетки) [7, 8].
Цитринин-органическое соединение, поликетид, антибиотик-хинон, микотоксин, вторичный метаболит, продуцируемый микроскопическими плесневыми грибами рода Пеницилл (в частности Penicillum citrinum) и в меньшей степени рода Аспергилл. Нами выдвинута гипотеза о возможности индукции полирезистентности условно-патогенных микроорганизмов в кишечнике кур и человека при контакте с токсичными ксенобиотиками, например, цитринином.
Цель исследования - изучить основные факторы, влияющие на возникновение перекрестной антибиотикорезистентности и полирезистентности микроорганизмов сем. Enterobacteriaceae, выделяемых от кур и цыплят-бройлеров.
Материалы и методы. Сальмонелл выделяли из проб печени и кишечника цыплят-бройлеров с использованием общепринятых методов изоляции, используя следующие питательные среды: XLT4, RVS-бульон, висмут-сульфит агар. Идентификацию до вида проводили с использованием биохимических тестов (ПБДЭ - пластина для биохимической дифференциации эн-теробактерий ООО «Диагностические системы-Ниж-ний Новгород»). Также тестировали методом ПЦР в режиме реального времени с использованием видо-специфичных праймеров и Taqman-зонда [9].
Антибиотикорезистентность определяли диско-диффузионным методом в соответствии с общепринятыми требованиями [10]. Для исследований были использованы штаммы сальмонелл, характеризующиеся наличием эффлюкса.
Антибиотикочувствительность изучали в отношении следующих антибиотиков: амоксициллин, клиндамицин, тилозин, спектиномицин, гентамицин, флорфеникол, триметоприм/сульфадимезин, триме-топрим/сулфаметоксазол, сульфадимезин. Интерпретацию результатов определения чувствительности к антибиотикам проводили с использованием критериев Европейского комитета по оценке антибиотикочув-ствительности (EUCAST) 2012 г. [11].
Для изучения влияния цитринина на выработку антибиотикорезистентности, цыплят породы Хайсекс Браун в возрасте 2 недели разбили на 2 группы по 7 голов. Цыплятам опытной группы скармливали комбикорм с превышением уровня цитринина выше ПДУ. Цыплятам контрольной группы скармливали комби-
корм без цитринина. Опыт проводили в течение 7 дней.
По завершению эксперимента были отобраны пробы кишечного содержимого, гомогенизированы в стерильном физиологическом растворе до 10% концентрации и проведены посевы серийных, десятикратных разведений на среду MRS, а также на среду Uriselect 4 (Bio-Rad Laboratory), содержащую 4, 0,2 и 0 мкг/мл энрофлоксацина. Дополнительно проводили посевы на среду Эндо и SDS-бульон.
Определение концентрации цитринина в кормах проводили методом иммуноферментного анализа с использованием RIDASCREEN FAST Cytrinin (R-Biofarm), в соответствии с инструкцией производителя. Измерение оптической плотности осуществляли при длине волны 450 нм на спектофотометре Tecan Sunrise. Определение концентрации цитринина по оптической плотности осуществляли методом сплайн-интерполяции с использованием ПО RidaSoft (R-Biofarm).
Результаты и исследований. У цыплят-бройлеров после употребления цитринина с кормом, наблюдали, статистически достоверное, снижение концентрации лактобактерий в кишечнике на 0,61 Log10 КОЕ/грамм (Р=0,03), что соответствует литературным данным и ранее сделанным нами клиническим наблюдениям.
На основании культуральных данных биоразнообразие микробиоты кишечного содержимого у цыплят опытной и контрольной групп не различалось. Среди доминантных микроорганизмов сем. Enterobacteriaceae превалировали два морфотипа колоний синего (Enterobacter spp.) и розового цвета (E.coli) (на среде уриселект 4), т.е. продуцирующие глюкуронидазу и галактозидазу, соответственно. Статистически достоверно в опытной группе была снижена концентрация бактерий, образующих колонии синего цвета (табл. 1) на среде без энрофлоксацина и при концентрации энрофлоксацина 0,2 мкг/мл. При концентрации энрофлоксацина 4 мкг/мл количество выросших колоний у цыплят контрольных и опытных групп не различалось. Следовательно, число резистентных к энрофлоксацину форм бактерий у цыплят опытных и контрольных групп не менялось.
Контакт микрофлоры кишечника с цитринином привел к снижению концентрации бактерий, чувствительных к энрофлоксацину.
Корреляционный анализ позволил установить отрицательную корреляцию между концентрацией энрофлоксацина и концентрацией микроорганизмов (Enterobacter spp.) в кишечнике (r=-0,805 и -0,901 для опытной и контрольных групп, соответственно), что также подтверждает меньшее влияние энрофлоксацина на снижение количества бактерий после обработки цитринином. Таким образом, можно утверждать, что скармливание корма с цитринином вызвало увеличение удельной доли бактерий, устойчивых к энрофлоксацину (рис. 1).
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ЖУРНАЛ
№ 6/2018
36
ЕТЕРИНАРНЫЙ
Tree Diagram for 6 Cases Weighted pair-group average Euclidean distances
контроль контроль
Рис. 1. Результаты кластерного анализа культур E.coli по результатам антибиотикорезистентности.
Таблица 1
Концентрация микроорганизмов Enterobacter spp. при посеве на среду с разными концентрациями
энрофлоксацина, Log10 КОЕ/грамм
Параметр Концентрация энрофлоксацина, мкг/мл
0 0,2 4
Контрольная группа
М+SD 7,61+0,33 7,41+0,23 6,29+0,34
Опытная группа
М+SD 7,18+0,31* 7,05+0,39 6,23+0,28
P 0,02 0,05 0,37
Таким образом, и в контрольной и в опытной группах цыплят, все бактерии данного морфотипа были резистентны к энрофлоксацину вне зависимости от контакта с цитринином (табл. 2).
Таблица 2
Концентрация микроорганизмов E.coli (розовые колонии) при посеве на среду с разными концентрациями
энрофлоксацина, Log10 КОЕ/грамм
Второй доминантный вид бактерий кишечной микробиоты - E.coli характеризовался отсутствием зависимости между концентрацией энрофлоксацина в питательной среде и концентрацией бактерий.
Параметр Концентрация энрофлоксацина, мкг/мл
0 0,2 4
Контрольная группа
М+SD 7,26+0,28 7,11+0,29 7,02+0,44
Опытная группа
М+SD 7,34+0,35 7,21+0,26 7,19+0,27
P 0,33 0,28 0,21
Как следует из таблиц 3 и 4, достоверных различий антибиотикорезистентности культур кишечной палочки, выделенных от цыплят опытной и контрольной групп, не наблюдалось, ввиду выделения двух профилей антибиотикорезистентности вне зависимости от группы.
Изучение изменения антибиотикорезистентности сальмонелл после инкубации с цитринином в опытах in vitro.
После инкубации сальмонелл в присутствии ци-
тринина в концентрации 136 мкг/л, антибиотикоре-зистентность, статистически значимо, повысилась в отношении хлорамфеникола (у трех штаммов из четырех), амоксициллина (у одного штамма), докси-циклина и энрофлоксацина (у одного штамма). Также наблюдались случаи повышения антибиотикочув-ствительности к доксициклину и энрофлоксацину у одного из штаммов (статистически незначимо после учета поправки Бонферрони) (табл. 5).
Таблица 3
Антибиотикорезистентность культур Е.соП, выделенных от цыплят контрольной группы, по результатам
диско-диффузионного метода, мм
Штамм Доксици-клин Клиндами-цин Хлорамфеникол Флумеквин Канамицин Амоксициллин Норфлокса-цин Энрофлоксацин
2 0 12 24 16 24 14 18 15
156 0 0 22 14 24 14 18 15
157 0 14 24 0 24 15 0 0
M+SD 0,00+0 8,67+7,57 23,33+1,15 10,00+8,72 24,00+0,00 14,33+0,58 12,00+10,39 10,00+8,66
Таблица 4 Антибиотикорезистентность культур Е.соП, выделенных от цыплят опытной группы по результатам диско- диффузионного метода, мм
Штамм Доксици-клин Клиндами-цин Хлорамфеникол Флумеквин Канамицин Амоксициллин Норфлок-сацин Энрофлоксацин
158 0 0 12 14 22 0 24 15
159 0 16 24 0 22 14 0 0
160 0 8 24 0 22 14 0 0
M+ SD 0,00+0 8,00+8,00 20,00+6,93 4,67+8,08 22,00+0,00 9,33+8,08 8,00+13,86 5,00+8,66
Таблица 5 Изменение антибиотикорезистентности после контакта сальмонелл с цитринином, М+SD мм
Хлорамфеникол Амоксициллин Энрофлоксацин Доксициклин
Штамм опыт контроль опыт контроль опыт контроль опыт контроль
№3 26,667 ±1,154 17*±6,08 9,66 ±0,57 2,66 ±4,61 28+2 20,33** ±1,527 0±0 0±0
№297 0±0 44±8,71** 0±0 13±4,24 18±5,29 27±4,24 0±0 20,02*** ±0,03
№299 0±0 12,66 ±3,05** 0 13,33** ±1,15 20±0 20,66 ±2,3 22,66 ±1,15 24,66* ±1,154
№286 0±0 0±0 0±0 0±0 18,66 ±1,154 14,66 ±5,03 0±0 0±0
№296 19,33 ±3,05 29,33** ±1,15 24±0 24,66 ±1,15 17,33 ±1,15 20±0* 23 ±8,88 26±2
Примечание: * P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001.
Таким образом, контакт микробиоты кишечника птицы с микотоксинами, в частности с цитринином, может приводить не только к развитию дисбактериза, но и способствовать накоплению антибиотикорези-стентных штаммов микроорганизмов.
Заключение. После употребления цитринина с кормом наблюдали статистически достоверное снижение концентрации лактобактерий в кишечнике на 0,61 Log10 КОЕ/грамм (Р=0,03), то есть наступление дисбиоза, что подтверждает нашу гипотезу об отрицательном влиянии повышенного уровня цитринина
Литература
1. Swartz, M.N. Human diseases caused by foodborne pathogens of animal origin / M.N.Swartz // Clinical Infectious Diseases. - 2002. - № 34 (supplement 3). - Р. 111-122. - doi: 10.1086/340248.
на микробиоту кишечника. Устойчивость эффлюкс положительных штаммов сальмонелл после контакта с цитринином повышалась к хлорамфениколу, энро-флоксацину, амоксициллину и доксициклину.
Благодарность.
Работа выполнена при частичной поддержке Комплексной программы фундаментальных исследований СО РАН 11.1 (№ 0778-2018-0112) «Микро-биом человека и сельскохозяйственных животных. Изучение возможностей коррекции».
38
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ЖУРНАЛ
№ 6/2018
2. Antimicrobial resistance in nontyphoid Salmonella serotypes: a global challenge / L.H.Su, C.H.Chiu, C.Chu, J.T.Ou // Clinical Infectious Diseases. - 2004. - № 39 (4). - Р. 546-551. - doi: 10.1086/422726.
3. Multidrug-resistant Salmonella typhimurium DT104 in poultry / G.Rajashekara [et al] // Journal of Food Protection.
- 2000. - № 63 (2). - Р. 155-161.
4. Davis, M.A. Multiresistant clones of Salmonella enterica: the importance of dissemination / M.A.Davis, D.D.Hancock, T.E.Besser // The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. - 2002. - № 140 (3). - Р. 135-141. - doi: 10.1067/mlc.2002.126411.
5. Increased burden of illness associated with antimicrobial-resistant Salmonella enteric serotype Typhimurium infections / L.J.Martin, M.Fyfe, K.Dore [et al.] // The Journal of Infectious Diseases. - 2004. - № 189 (3). - Р. 377-384.
- doi: 10.1086/381270.
6. Jensen, A.N. Immediate differentiation of Salmonella-resembling colonies on brilliant green agar / A.N.Jensen, J.Hoorfar // Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology. - 2000. - № 8 (3). - Р. 219-225. - doi: 10.1111/ j.1745-4581.2000.tb00219.x.
7. Sefton, A.M. Mechanisms of antimicrobial resistance / A.M.Sefton // Drugs. - 2002. - № 62 (4). - Р. 557-566. -doi: 10.2165/00003495-200262040-00001.
8. Foley, S.L. Food animal-associated Salmonella challenges: pathogenicity and antimicrobial resistance / S.L.Foley, A.M.Lynne // Journal of Animal Science. - 2008. - № 86 (14). - Р. E173-E187.
9. Современные методы контроля сальмонеллеза / В.Н.Афонюшкин, Е.В.Дударева, Л.И.Малахеева [и др.] // Птицеводство. - 2008. - № 9. - С. 43-44.
10. CLSI Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 21st informational supplement. - 2011. -№ (31). - Р. 165.
11. EUCAST Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 2.0. - 2012. - 73 р.
studying the effect of citrinin on occurrence of dysbacteriosis and multiresistance of microorganisms family enterobacteriaceae
'Afonyushkin V.N. - Candidate of Biological Sciences; 'Donchenko N.A. - Doctor of Veterinary Medicine;
2Kozlova Yu.N. - Candidate of Biological Sciences; 2Davydova N.A. - Candidate of Veterinary Sciences;
2Cherepushkina V.S. - Junior Researcher; 3Frolova O.A. - Junior Researcher.
Siberian Federal Scientific Centre of Agro-BioTechnologies of the Russian Academy of Sciences,
Krasnoobsk (e-mail: lisocim@mail.ru). institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of the Siberian Branch of the Russian Academy
of Sciences, Novosibirsk (e-mail: niboch@niboch.nsc.ru).
3Krasnoyarsk Scientific-Research Institute of Animal Husbandry-Division of Federal Research Center "Krasnoyarsk Scientific Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences",
Krasnoyarsk (e-mail: kristal_o@bk.ru).
The broiler chickens were observed a statistically reliable decrease in the concentration of lactobacilli in the intestine by 0.61 Log10 CFU / g (P=0.03) after taking citrinin with fodder. The contact of the intestinal microflora with citrinin had resulted in a decrease in the concentration of bacteria sensitive to enrofloxacin and caused an increase in the specific proportion of bacteria resistant to enrofloxacin. Based on the culture data, the intestinal contents microbiota biodiversity in the chickens of the experimental and control groups did not differ. Two morphotypes had prevailed among the dominant microorganisms family Enterobacteriaceae - blue color colonies (Enterobacter spp.) and pink color colonies (E.coli) (on the Uriselect 4 medium), i.e. the producing glucuronidase and galactosidase, respectively. In the experimental group there was a statistically significant decrease in the concentration of bacteria forming blue colonies on a medium without enrofloxacin and with an enrofloxacin concentration of 0.2 yg / ml. With an enrofloxacin concentration of 4 yg / ml, the number of colonies grown in the control and experimental chickens did not differ. Consequently, the number of bacteria resistant to enrofloxacin in the chickens of the experimental and control groups did not change. Correlation analysis made it possible to establish a negative correlation between the enrofloxacin concentration and the concentration of microorganisms (Enterobacter spp.) in the intestine (r = -0.805 and -0.90 for the experimental and control groups, respectively). This also confirms the lower effect of enrofloxacin on reducing the number of bacteria after treating by citrinin. The second dominant bacterial species of the intestinal microbiota - E. coli - was characterized by the absence of a relationship between the enrofloxacin concentration in the nutrient medium and the concentration of bacteria. Thus, in both the control and experimental groups of chickens, all the bacteria of this morphotype were resistant
