CC BY
18
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
УДК 57.017.6+57.033+576.53+57.022
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ «МЯГКОГО РАЗОБЩЕНИЯ» 2,4-ДИНИТРОФЕНОЛОМ НА РОСТ И ПОСЛЕДУЮЩУЮ ГИБЕЛЬ В СТАЦИОНАРНОЙ ФАЗЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК КИТАЙСКОГО ХОМЯЧКА
Г.В. Моргунова*, А.Ф. Кармушаков, А.А. Клебанов, А.Н. Хохлов
Сектор эволюционной цитогеронтологии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 *e-mail: morgunova@mail.bio.msu.ru
Частичное разобщение процессов окислительного фосфорилирования и запасания энергии в виде АТФ («мягкое разобщение») способствует снижению производства активных форм кислорода, а также может имитировать эффект ограничения питания. Целый ряд исследований позволил установить, что разобщители, подобные 2,4-динитрофенолу (ДНФ), оказывают влияние на продолжительность жизни дрозофилы, дрожжей, мышей и крыс, а также воздействуют на проявление «возрастных» изменений в репликативно стареющих культурах клеток млекопитающих и человека. Настоящее исследование посвящено изучению влияния ДНФ на рост и последующую гибель «стационарно стареющих» клеток китайского хомячка. С помощью метода определения эффективности образования колоний клетками подобрана максимально допустимая концентрация — 5*10-5 М, в которой вещество потенциально способствует проявлению эффекта «мягкого разобщения» и не угнетает пролиферацию. В более высоких концентрациях ДНФ обладает цитотоксическим эффектом. Под влиянием ДНФ в потенциально «мягко разобщающей» концентрации (5,6-10~7 М) кинетика роста и гибели культуры клеток не изменяется, не увеличивается её продолжительность жизни. Подобный эффект может быть обусловлен типом исследованных клеток. Кроме того, есть вероятность, что оптимальная концентрация лежит в диапазоне от 5*10-7 до 5*10-5 М либо в диапазоне более низких, чем 5-10"7 М, значений.
Ключевые слова: клеточное старение, «стационарное старение» клеток, 2,4-ди-нитрофенол, эффективность колониеобразования, кривые выживания, геропро-текторы
Окислительное фосфорилирование — биохимический механизм, обеспечивающий сопряжение окислительных реакций с процессом запасания энергии для жизнедеятельности клетки. При разобщении сопряженных процессов высвобождаемая в ходе окисления энергия рассеивается в виде тепла. Мембранный потенциал митохондрий, создаваемый протонным насосом, определяет образование активных форм кислорода (АФК) — чем больше потенциал, тем больше вырабатывается АФК [1, 2]. Снизить образование АФК можно путем частичного разобщения дыхания и окислительного фосфори-лирования при сохранении производства АТФ, достаточного для поддержания нормальной жизнеспособности [3—5]. Этот механизм называется «мягким разобщением» («mild»
uncoupling), он достигается путем повышения проводимости митохондриальной мембраны для протонов H+, в результате чего увеличивается потребление О2. Такое увеличение замедляет процесс образования АФК за счет понижения концентрации O2. Снижение производства АФК подобным способом считается потенциальным механизмом задержки клеточного старения [6, 7]. Кроме того, «мягкое разобщение» уменьшает как мембранный потенциал, так и трансмембранный градиент протонов (именно последний в значительной степени определяет производство АФК [8]), в результате чего происходит частичное подавление производства митохондри-ального супероксида за счёт снижения эффективного синтеза АТФ [9].
Существует мнение, что «мягкие разобщители» могут быть потенциальными миметиками ограничения питания [1, 10, 11], так как они ограничивают преобразование энергии в работу, и часть энергии, полученная с пищей, рассеивается. Протонофор 2,4-динитрофенол (ДНФ) — широко распространенное в 1930-х гг. средство для борьбы с ожирением, в настоящее время все чаще используется в качестве предполагаемого миметика ограничения питания. ДНФ уменьшает уровень окислительных повреждений и увеличивает среднюю продолжительность жизни у мух [12, 13]. Похожий результат был получен и на мышах: ДНФ в низких дозах способствует улучшению целого ряда физиологических показателей у животных — в том числе, снижает уровень производства АФК и уровень 8-оксо-2'-дезоксигуанозина в мозге, печени и сердце, уменьшает массу тела, увеличивает среднюю продолжительность жизни [11]. У крыс ДНФ также вызывает усиление митохон-дриального дыхания, уменьшение скорости формирования АФК и увеличение средней продолжительности жизни [14]. Кроме того, у мышей с болезнью Хантингтона ДНФ в низких дозах вызывает снижение уровня окислительного стресса, улучшает моторные функции, однако достоверно не увеличивает среднюю продолжительность жизни [15].
В последнее время эффекты ДНФ всё чаще изучают в рамках моделей клеточного старения. В модели репликативного старения клеток с помощью ДНФ удалось увеличить количество удвоений популяции фибробластов человека и снизить активность ассоциированной со старением р-галактозидазы [16]. При изучении старения у дрожжей было обнаружено, что ДНФ увеличивает как хронологическую, так и репли-кативную продолжительность жизни, снижает образование Н202 и повышает выживаемость клеток [10]. ДНФ в низких концентрациях способствует дифференцировке нейронов линии нервных клеток и разрастанию нейритов в первичных культивируемых нейронах [17, 18], он улучшает дифференцировку, пролиферацию и миграцию эмбриональных стволовых клеток мыши, а также защищает их от гибели [19].
Несмотря на множество доказательств положительного влияния ДНФ на самые разные модельные объекты в экспериментах, необходимо помнить, что есть лишь небольшой диапазон концентраций, в которых он вызывает проявление положительных эффектов [1]. В связи с этим сложно найти ту концентрацию ДНФ, которая будет соответствовать «мягкому разобщению», поэтому необходимо тщательно подбирать дозу для постановки экспериментов.
Интересно было бы изучить, как повлияет ДНФ на продолжительность жизни «стационарно стареющей» культуры клеток млекопитающих. При хронологическом старении дрожжей и «стационарном старении» культивируемых клеток млекопитающих происходит ограничение пролиферации вследствие контактного торможения, в результате чего клетки не обновляются и в них происходят разного рода изменения, сходные с изменениями, характерными для стареющих многоклеточных организмов [20—24]. В настоящем исследовании мы попытались изучить действие ДНФ на жизнеспособность, рост и гибель непересевае-мой культуры трансформированных клеток китайского хомячка.
Материалы и методы
Эксперименты проводили на трансформированных клетках китайского хомячка перевиваемой линии B11-dii-FAF28 (клон 237), полученной из ФГБНУ «Медико-генетический научный центр» (Москва). Клетки культивировали при 37°С в стеклянных флаконах Карреля, используя среду Игла в модификации Дульбек-ко (HyClone, США) с добавлением 5—10% сыворотки крови крупного рогатого скота («PAA», Австрия), пенициллина (100 ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). Поддерживая культуру, клетки пересевали в соотношении 1:10—1:3 через каждые 3—4 сут. Снимали клетки с поверхности роста с помощью смеси (1:1) 0,02%-го версена и 0,25%-го трипсина (ФГБУ «НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского» Минздрава России, Москва). Перед приготовлением раствора ДНФ произвели его перекристаллизацию и спектрофотометрически подтвердили чистоту полученного вещества. Для этого 2 г водной суспензии ДНФ (0,5 мл воды/г; Merck-Schuchardt GmbH, Германия) поместили в колбу объемом 200 мл. Добавили 100 мл воды, затем довели до кипения с обратным охлаждением. Профильтровали раствор через бумажный фильтр, фильтрат поставили в холодильник для кристаллизации. Полученный осадок профильтровали через стеклянный фильтр, а затем поместили в бюкс и оставили на 2 сут в вакууме в присутствии безводного гидроксида калия. Приготовили раствор ДНФ (2,486-10~2 М) в буфере Tris-HCl (pH 8,05). Поглощение раствора измеряли с помощью спектрофотометра «Helios a» (Unicam, США). Перед измерением поглощения провели калибровку спектрофотометра с использованием стандартных фильтров.
В предварительных исследованиях, направленных на определение цитотоксических и ми-тогенных свойств ДНФ, клетки в «возрасте»
3—4 сут (т.е. культивируемые без пересева в течение 3—4 сут) засевали в герметично закрывающиеся пенициллиновые флаконы с плотностью около 40 тыс. клеток/см2. Через сутки добавляли во флаконы среду, содержащую ДНФ, конечные концентрации — от 3,73 • 10-10 М до 3,73-10~4 М. В контрольные флаконы добавляли среду с соответствующим количеством дистиллированной воды качества Milli-Q. Флаконы помещали на 4 сут в термостат (37°С), после чего клетки снимали с поверхности роста смесью растворов версена и трипсина, а затем оценивали их количество с помощью гемоцито-метра (камеры Горяева).
В связи с необходимостью поиска концентрации ДНФ, которую можно будет назвать «мягко разобщающей», определяли его цитоток-сическое влияние с использованием метода оценки эффективности образования колоний (ЭОК) и определением разработанного в нашей лаборатории показателя средневзвешенного номера класса (СВНК) распределения клеточных колоний по размеру [25, 26]. Для этого в чашки Петри («Nunclon», Дания) площадью 10 см2 добавляли 2,5 мл суспензии клеток (100 или 200 клеток) в ростовой среде, содержащей 90% среды Игла в модификации Дульбекко и 10% эмбриональной телячьей сыворотки FetalClone III (HyClone; GE Healthcare Life Sciences, США). Помещали чашки в С02-инкубатор EG 115 IR (Jouan, США), условия культивирования — 37°C, 10% CO2; через сутки в часть из них добавляли водные растворы ДНФ (конечные концентрации в культуральной среде составили 5-10"6 М, 5 • 10-5 М, 7,5-10"5 М, 1 • 10-4 М, 2-10"4 М, 6,4-10"4 М), в чашки из контрольной группы — дистиллированную воду. По окончании инкубации (через 4 сут) клетки промывали средой без сыворотки, фиксировали в течение 8 мин 75%-ным раствором этанола, промывали дистиллированной водой, окрашивали в течение 3 мин 0,1%-ным водным раствором метиле-нового синего и снова промывали дистиллированной водой. Затем производили подсчёт как количества образовавшихся колоний, так и количества клеток в этих колониях. Для определения ЭОК мы считали колониями образования, включавшие в себя 16 и более клеток, для СВНК — 2 и более клетки (для того, чтобы повысить чувствительность метода). При оценке СВНК мы разбивали все колонии на 17 классов в зависимости от их величины: 1-й класс — 2—15 клеток, 2-й класс — 16—31 клетка, 3-й класс — 32—47 клеток, ..., 16-й класс — 240—255 клеток, 17-й класс — 256 и более клеток. Сдвиг распределения в сторону колоний большего размера приводит к возрастанию СВНК и сви-
детельствует об улучшении функционального состояния изучаемой культуры, сдвиг в сторону колоний меньшего размера говорит о снижении пролиферативной активности клеток. Для расчёта ЭОК использовали формулу:
где N — количество посеянных клеток, K — количество выросших колоний. Расчёт СВНК производили по формуле:
где i — номер класса, п — количество классов, О — количество колоний в классе «/», M — общее количество колоний.
Для оценки влияния ДНФ на кинетику роста клеток и их последующую гибель в стационарной фазе 3-суточные клетки засевали в пе-нициллиновые флаконы с плотностью 45 тыс. клеток/см2. На следующие сутки подсчитывали количество прикрепившихся клеток и добавляли во флаконы среду, содержащую ДНФ (конечная концентрация — 5,6-10"4 М как «сильно разобщающая» и 5,6-10~7 М — как потенциально «мягко разобщающая»), во флаконы контрольной группы — среду с соответствующим объёмом воды. Через определенные промежутки времени снимали клетки с поверхности роста смесью растворов версена и трипсина, затем оценивали их количество с помощью камер Горяева (3 флакона на точку, 4 камеры на флакон).
При сравнении данных по цитотоксичности использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Полученные кривые гибели клеток аппроксимировали с помощью уравнения Гомпертца [27]. Математические расчёты и статистическую обработку данных производили с помощью программы 81£шаР1о1 12.0. Все результаты представлены в виде среднего и ошибки среднего.
Результаты и обсуждение
В первую очередь проверили чистоту используемого ДНФ. Для этого произвели перекристаллизацию вещества и оценили спектро-фотометрически его качество. Форма спектра (рис. 1) и коэффициент молярной экстинкции при 360 нм (14656 М-1 - см-1) совпали с литературными данными [28], что позволяет судить о достаточной чистоте препарата.
В предварительном эксперименте оценили влияние ДНФ в широком диапазоне концентра-
Рис. 1. Спектр поглощения УФ-излучения перекристаллизованного 2,4-динитрофенола
раствором
ций - от 3,73-10"10 М до 3,73-10"4 М - на рост и жизнеспособность клеток. Установили, что через 4 сут после посева достоверно плотность культуры клеток снижается только в группе, подвергнутой влиянию ДНФ в самой высокой из использованных концентраций — 3,73 • 10"4 М (рис. 2). Подобный цитоток-сический эффект позволяет предполагать, что данная концентрация может считаться «сильно разобщающей».
Так как подобрать концентрацию ДНФ, в которой препарат будет вызывать эффект «мягкого разобщения», довольно сложная задача, провели более детальный анализ с использованием метода определения ЭОК. Помимо подсчёта колоний определяли количество клеток в каждой колонии, а также строили распределение колоний по размерам с последующей оценкой СВНК. Определение показателя СВНК позволяет выявить более тонкие изменения ЭОК, чем простой подсчёт количества колоний. Исследовали влияние ДНФ в концентрациях от
5-10"5 до 6,4-10"4. ДНФ в концентрации 2-10"4 М почти полностью (рис. 3), а в концентрации 6,4-10"4 М — полностью подавляет пролиферацию клеток. Только в самой малой концентрации, 5 • 10-5 М, соединение не снижает ЭОК и не влияет на СВНК (таблица). Результаты согласуются с данными других авторов [29], в работах которых было показано, что ДНФ в концентрации 1 • 10-4 М на 20% снижает уровень АТФ в нормальных фибробластах человека и в то же время увеличивает их чувствительность к действию Н202.
В дополнительных экспериментах оценили ЭОК и СВНК при добавлении ДНФ в среду до конечной концентрации 5 • 10-5 и 5 • 10-6 М. ЭОК в обеих группах (20,б8±1,8 и 23,12±2,3 соответственно) достоверно не отличается от контрольного показателя (20,6±1,6). СВНК выше в группе 5 • 10-6 М (4,01±0,17), чем в группе 5-10"5 М (2,75±0,25), но оба показателя не отличаются достоверно от значения в контроле
I
о с;
о
к С О
nt
90 60 30 0
1200 мМ □ 100 |JM □ 75 мМ □ 50 нМ □ контроль
U
_Ьй jfl м Ls.
Рис. 2. Влияние 2,4-динитрофенола в различных концентрациях на плотность культуры клеток китайского хомячка на 4-е сут роста (плотность посева 40 тыс. клеток/см2). Приведены средние ± стандартные ошибки средних. * — достоверное отличие от контроля, р<0,05
I дПА ЬТЯ _£Й _Ы Ль дЛ- д№в __а, —__^
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Номер класса
Рис. 3. Влияние 2,4-динитрофенола в различных концентрациях на колониеобразующую способность культуры трансформированных клеток китайского хомячка (пояснения в тексте). Приведены средние ± стандартные ошибки средних
(3,42±0,33). Можно предположить, что «мягко разобщающая» концентрация для клеток китайского хомячка должна быть близка к значению 5-10"6 М. Однако известно, что ДНФ в концентрациях 1-10"5 и 5-10"5 М, а другие разобщители и в более низких концентрациях (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone, CCCP — 5-10"6 и 1-10"5 М; carbonyl cyanide-p-trifluorome thoxyphenylhydrazone, FCCP - 1,5-10"6 и 3-10"6 М) ухудшают пролиферацию как клеток млекопитающих, так и дрожжей [30, 31]. Также установлено, что ДНФ в сниженных по сравнению с рекомендованными другими авторами концентрациях уменьшает протонный градиент митохондрий [32], в связи с чем даже для модельных организмов, таких как рыбка данио (Danio rerio), в качестве разобщающей предлагается использовать концентрацию 5-10"7 М. В работах, в которых удалось увеличить продолжительность жизни дрожжей, использовались довольно низкие концентрации — 10-8 и даже 10-9 М [10]. Для построения кривой роста и гибели
Таблица
Влияние ДНФ в разных концентрациях на показатель эффективности образования колоний (ЭОК) клетками китайского хомячка, а также на средневзвешенный номер класса (СВНК) распределения колоний по размеру для каждой из групп. Приведены средние ± ошибки среднего
Концентрация ДНФ, М ЭОК, % СВНК
2-10-4 0,8±0,4 (*) 2,2±1,3 (*)
1-10-4 8,2±1,2 (*) 4,4±0,6 (*)
7,5-10-5 15,6±1,8 (*) 5,2±0,5
5-10-5 23,8±1,3 6,9±0,6
контроль 27,2±3,7 6,3±0,4
Примечание: * - обозначено достоверное отличие от показателя в контрольной группе, р < 0,05
культуры клеток под влиянием ДНФ мы выбрали две концентрации — 5,6*10-4 М (как «сильно разобщающую») и 5,6-10-7 М (как потенциально «мягко разобщающую», гарантированно не вызывающую цитотоксического эффекта).
Как и ожидалось, клетки из группы, в среду которой добавляли ДНФ в концентрации 5,6 • 10"4 М, погибали через 3 сут. Что же касается концентрации 5,6 • Ю-7 М, которая должна была вызывать «мягкое разобщение», то ДНФ в этом случае никак не повлиял на кинетику роста и последующее вымирание культуры (рис. 4). Мы аппроксимировали данные о гибели культуры с помощью уравнения Гомпертца (К2 для контрольной группы - 0,951, К2 для опытной группы — 0,826), чтобы получить параметры, ха-
момент времени и темп старения культуры. Ни по одному из параметров не обнаружили достоверных различий между группами. Отсутствие какого-либо эффекта может быть обусловлено тем, что «мягкое разобщение» не влияет либо на старение в целом, либо на «стационарное старение» культур клеток. Также нельзя исключить, что оно не даёт никаких преимуществ конкретной изучаемой культуре клеток. Возможно, эффект «мягкого разобщения» является тканеспецифичным, т.е. с его помощью может увеличиваться продолжительность жизни только определённых типов тканей [33, 34]. Так, например, было показано, что мышцы, состоящие преимущественно из быстрых волокон, обладают лучшей выживаемостью, несмотря на их высокую функциональную активность, по сравнению с мышцами, в состав которых входят медленные волокна. При этом для быстрых волокон характерны увеличенное потребление 02, более низкий уровень АФК и сниженный уровень повреждений митохондрий [35]. Также по-разному влияет «мягкое разобщение», вызван-
см
г
о
ф с;
х
о. ?
л ц
а
л н о о
X I-
о с;
/
0 12 3 4 5
8 9
10 11 12 13 14 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 20 21 22 23 24 25 2 6 2 7 2 8 2 9 3 0 31
Время культивирования, сут
Рис. 4. Влияние 2,4-динитрофенола в концентрациях 5,6 • 10-4 М («сильно разобщающая») и 5,6- 10-7 М (потенциально «мягко разобщающая») на кинетику роста и последующую гибель культуры трансформированных клеток китайского хомячка. После добавления ДНФ в разобщающей концентрации клетки перестают пролиферировать и вымирают через 3 сут. При добавлении ДНФ в потенциально «мягко разобщающей» концентрации клетки растут и погибают так же, как и в контрольной группе (модальная продолжительность жизни в контрольной группе — 18,495±0,824 сут, в группе 5,6-10-7 М — 17,793±1,452 сут; плотность культуры к моменту начала вымирания в контроле — 230655±16377 клеток/см2, в группе 5,6-10-7 М — 243255±30548 клеток/см2). Приведены средние ± стандартные ошибки средних
рактеризующие
вымирание, — такие как модальная продолжительность жизни (момент времени, когда скорость вымирания популяции максимальна — со-остветсвует точке перегиба на кривой Гомпертца), а также сила смертности в нулевой
ное добавлением ДНФ, на метаболизм различных линий клеток [30]. Кро- ме того, нельзя исключить, что выбранная доза разобщителя не является оптимальной. Мы установили, что «мягко разобщающие» концентрации
необходимо искать в диапазоне от сверхнизких значений до 5 • 10-5 М, так как ДНФ в более высокой концентрации способствует угнетению пролиферации. Необходимо проверить, как изменятся поглощение 02 клетками и уровень АТФ при воздействии соединения в разных концентрациях, не превышающих найденное пограничное значение, при этом подходящая концентрация может быть как выше 5,6 • 10-7 М, так и между 5-10"5 М и 5,6-10"7 М.
Авторы выражают признательность Д.С. Есипову за помощь с определением чистоты ДНФ. Исследование выполнено при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 18-34-00813 мол_а).
Исследование выполнено без использования животных и без привлечения людей в качестве испытуемых. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Mookerjee S.A., Divakaruni A.S., Jastroch M., Brand M.D. Mitochondrial uncoupling and lifespan // Mech. Ageing Dev. 2010. Vol. 131. N 7-8. P. 463-472.
2. Zorova L.D., Popkov VA., Plotnikov E.Y., Silachev D.N., Pevzner I.B., Jankauskas S.S., Babenko V.A., Zorov S.D., Balakireva A.V., Juhaszova M., Sollott S.J. Mitochondrial membrane potential // Anal. Biochem. 2018. Vol. 552. P. 5059.
3. Skulachev V.P. Role of uncoupled and non-coupled oxidations in maintenance of safely low levels of oxygen and its one-electron reductants // Q. Rev. Biophys. 1996. Vol. 29. N 2. P. 169-202.
4. Korshunov S.S., Skulachev V.P., Starkov A.A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria // FEBS Lett. 1997. Vol. 416. N 1. P. 15-18.
5. Starkov A. A "Mild" uncoupling of mitochondria // Bioscience Rep. 1997. Vol. 17. N 3. P. 273-279.
6. Papa S., Skulachev V.P. Reactive oxygen species, mitochondria, apoptosis and aging // Detection of mitochondrial diseases, vol. 21 / Eds. F.N. Gellerich and S. Zierz. Boston: Springer, 1997. P. 305-319.
7. Brand M.D. Uncoupling to survive? The role of mitochondrial inefficiency in ageing // Exp. Gerontol. 2000. Vol. 35. N 6-7. P. 811-820.
8. Lambert A.J., Brand M.D. Superoxide production by NADH: ubiquinone oxidoreductase (complex I) depends on the pH gradient across the mitochondrial inner membrane // Biochem. J. 2004. Vol. 382. N 2. P. 511-517.
9. Brand M.D., Affourtit C., Esteves T.C, Green K., Lambert A.J., Miwa S., Pakay J.L., Parker N. Mitochondrial superoxide: production, biological effects, and activation of uncoupling proteins // Free Radic. Biol. Med. 2004. Vol. 37. N 6. P. 755767.
10. Barros M.H., Bandy B., Tahara E.B., Kowaltowski A.J. Higher respiratory activity
decreases mitochondrial reactive oxygen release and increases life span in Saccharomyces cerevisiae // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. N 48. P. 49883—49888.
11. Caldeira da Silva C.C., Cerqueira F.M., Barbosa L.F, Medeiros M.H., Kowaltowski A.J. Mild mitochondrial uncoupling in mice affects energy metabolism, redox balance and longevity // Aging Cell. 2008. Vol. 7. N 4. P. 552—560.
12. Miquel J., Fleming J., Economos A.C. Antioxidants, metabolic rate and aging in Drosophila // Arch. Gerontol. Geriatr. 1982. Vol. 1. N 2. P. 159—165.
13. Padalko V.I. Uncoupler of oxidative phosphorylation prolongs the lifespan of Drosophila // Biochemistry (Mosc.). 2005. Vol. 70. N 9. P. 986—989.
14. Падалко В.И, Леонова И.С, Козлова Е.В. Влияние 2,4-динитрофенола на интенсивность окислительных процессов в печени крыс в длительном эксперименте // Усп. геронтол. 2010. Т. 23. № 1. С. 98—103.
15. Wu B., Jiang M., Peng Q., Li G., Hou Z., Milne G.L., Mori S., Alonso R., Geisler J.G., Duan W. 2,4 DNP improves motor function, preserves medium spiny neuronal identity, and reduces oxidative stress in a mouse model of Huntington's disease // Exp. Neurol. 2017. Vol. 293. P. 83—90.
16. Passos J.F., Saretzki G., Ahmed S., Nelson G., Richter T, Peters H., Wappler I., Birket M.J., Harold G., Schaeuble K., Birch-Machin M.A., Kirkwood T.B.L., von Zglinicki T. Mitochondrial dysfunction accounts for the stochastic heterogeneity in telomere-dependent senescence // PLoS Biol. 2007. Vol. 5. N 5. P. 1138—1151.
17. Wasilewska-Sampaio A.P., Silveira M.S., Holub O, Goecking R., Gomes F.C., Neto V.M, Linden R., Ferreira S.T., De Felice F.G. Neuritogenesis and neuronal differentiation promoted by 2,4-dinitrophenol, a novel anti-amyloidogenic compound // FASEB J. 2005. Vol. 19. N 12. P. 1627—1636.
18. Sebollela A., Freitas-Correa L., Oliveira F.F., Mendes C.T, Wasilewska-Sampaio A.P., Camacho-
Pereira J., Galina A, Brentani H, Passetti F, De Felice F.G., Dias-Neto E. Expression profile of rat hippocampal neurons treated with the neuroprotective compound 2,4-dinitrophenol: up-regulation of cAMP signaling genes // Neurotox. Res. 2010. Vol. 18. N 2. P. 112-123.
19. Freitas-Correa L., Lourenco M.V, Acquarone M., da Costa R..F.M, Galina A., Rehen S.K., Ferreira S.T. 2,4-dinitrophenol induces neural differentiation of murine embryonic stem cells // Stem Cell Res. 2013. Vol. 11. N 3. P. 1407-1416.
20. Morgunova G.V, Klebanov A.A., Khokhlov A.N. Interpretation of data about the impact of biologically active compounds on viability of cultured cells of various origin from a gerontological point of view // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2016. Vol. 71. N 2. P. 67-70.
21. Khokhlov A.N., Morgunova G.V. Testing of geroprotectors in experiments on cell cultures: pros and cons // Anti-aging drugs: From basic research to clinical practice / Ed. A.M. Vaiserman. Royal Society of Chemistry, 2017. P. 53-74.
22. Morgunova G.V., Klebanov A.A., Marotta F, Khokhlov A.N. Culture medium pH and stationary phase/chronological aging of different cells // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2017. Vol. 72. N 2. P. 47-51.
23. Khokhlov A.N., Klebanov A.A., Morgunova G.V. On choosing control objects in experimental gerontological research // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2018. Vol. 73. N 2. P. 59-62.
24. Morgunova G.V, Klebanov A.A. Impairment of the viability of transformed Chinese hamster cells in a nonsubcultured culture under the influence of exogenous oxidized guanoside is manifested only in the stationary phase of growth // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2018. Vol. 73. N 3. P. 124-129.
25. Alinkina E.S., Vorobyova A.K., Misharina T.A., Fatkullina L.D., Burlakova E.B., Khokhlov A.N. Cytogerontological studies of biological activity of oregano essential oil // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2012. Vol. 67. N 2. P. 52-57.
26. Yablonskaya O.I., Ryndina T.S., Voeikov V.L, Khokhlov A.N. A paradoxical effect of hydrated C60-fullerene at an ultralow concentration on the viability and aging of cultured Chinese hamster cells // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2013. Vol. 68. N 2. P. 63-68.
27. Khokhlov A.N. Cell kinetic approaches to the search for anti-aging drugs: Thirty years after // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2018. Vol. 73. N 4. P. 185-190.
28. Chappelet-Tordo D, Fosset M, Iwatsubo M., Gaché C., Lazdunski M. Intestinal alkaline phosphatase. Catalytic properties and half of the sites reactivity // Biochemistry. 1974. Vol. 13. N 9. P. 1788-1795.
29. Miyoshi N, Oubrahim H., Chock P.B., Stadtman E.R.. Age-dependent cell death and the role of ATP in hydrogen peroxide-induced apoptosis and necrosis // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2006. Vol. 103. N 6. P. 1727-1731.
30. Desquiret V., Loiseau D, Jacques C., Douay O, Malthiury Y, Ritz P, Roussel D. Dinitrophenol-induced mitochondrial uncoupling in vivo triggers respiratory adaptation in HepG2 cells // BBA-Bioenergetics. 2006. Vol. 1757. N 1. P. 21-30.
31. Stöckl P., Zankl C., Hütter E., Unterluggauer H, Laun P., Heeren G, Bogengruber E., Herndler-Brandstetter D., Breitenbach M., Jansen-Dürr P. Partial uncoupling of oxidative phosphorylation induces premature senescence in human fibroblasts and yeast mother cells // Free Radic. Biol. Med. 2007. Vol. 43. N 6. P. 947-958.
32. Bestman J.E., Stackley K.D., Rahn J.J., Williamson T.J., Chan S.S. The cellular and molecular progression of mitochondrial dysfunction induced by 2,4-dinitrophenol in developing zebrafish embryos // Differentiation. 2015. Vol. 89. N 3-4. P. 51-69.
33. Morgunova G.V, Klebanov A.A., Khokhlov A.N. Some remarks on the relationship between autophagy, cell aging, and cell proliferation restriction // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2016. Vol. 71. N 4. P. 207-211.
34. Morgunova G.V, Klebanov A.A. Age-related AMP-activated protein kinase alterations: From cellular energetics to longevity // Cell Biochem. Funct. 2019. Vol. 37. N 3. P. 169-176.
35. Amara C.E., Shankland E.G., Jubrias S.A., Marcinek D.J., Kushmerick M.J., Conley K.E. Mild mitochondrial uncoupling impacts cellular aging in human muscles in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2007. Vol. 104. N 3. P. 1057-1062.
Поступила в редакцию 30.04.2019 г. После доработки 10.06.2019 г. Принята в печать 08.07.2019 г.
RESEARCH ARTICLE
STUDIES OF THE EFFECT OF «MILD» UNCOUPLING WITH 2,4-DINITROPHENOL ON GROWTH AND SUBSEQUENT DEATH OF CULTURE OF CHINESE HAMSTER CELLS IN THE STATIONARY PHASE
G.V. Morgunova*, A.F. Karmushakov, A.A. Klebanov, A.N. Khokhlov
Evolutionary Cytogerontology Sector, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1—12, Moscow, 119234, Russia *e-mail: morgunova@mail.bio.msu.ru
Partial uncoupling of processes of oxidative phosphorylation and energy storage in the form of ATP («mild» uncoupling) helps reduce the production of reactive oxygen species and can also mimic the effect of calorie restriction. A number of studies have shown that uncouplers like 2,4-dinitrophenol (DNF) affect the lifespan of Drosophila, yeast, mice and rats, as well as the manifestation of «age-related» changes in replicative senescence mammalian and human cell cultures. This paper is devoted to studying the effect of DNF on the growth and death of «stationary phase aging» Chinese hamster cells. Using the method for determining the colony-forming efficiency of cells, the maximum permissible concentration was selected, 5-10-5 M, in which the substance potentially contributes to the manifestation of the effect of «mild» uncoupling and does not inhibit cell proliferation. At higher concentrations, DNP has a cytotoxic effect for the studied cell culture. Under the influence of DNP, the kinetics of cell growth and cell death does not change in the potentially «mild» uncoupling concentration (5.6 • 10-7 M), the lifespan of the cell culture does not increase. A similar effect may be due to the type of cells studied. In addition, there is a probability that the optimal concentration lies in the range from 5-10-7 to 5*10-5 M, or lower than 5-10-7 M.
Keywords: cell aging, «stationary phase aging», 2,4-dinitrophenol, colony-forming efficiency, survival curve, geroprotectors
Сведения об авторах
Моргунова Галина Васильевна — науч. сотр. сектора эволюционной цитогеронтологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-15-90; e-mail: morgunova@mail.bio.msu.ru
Кармушаков Азар Фатфулович — инженер сектора эволюционной цитогеронтологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-15-90; e-mail: karmushakov@mail.ru
Клебанов Александр Александрович — науч. сотр. сектора эволюционной цитогеронтологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-15-90; e-mail: klebanov@mail.bio.msu.ru
Хохлов Александр Николаевич — докт. биол. наук, зав. сектором эволюционной цитогеронтологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-15-90; e-mail: khokhlov@mail.bio.msu.ru
