CC BY
26УДК: 612.438:619:615.917:616-001.28/.29
ИЗУЧЕНИЕ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ КОРКОВОГО ВЕЩЕСТВА ТИМУСА КРЫС ПРИ КОМБИНИРОВАННОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ДИОКСИНА И ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ
М.М.Сальникова - кандидат биологических наук, ст.н.с.; И.Р.Кадиков - кандидат биологических наук, завлабораторией; Г.М.Закирова - кандидат ветеринарных наук, вед.н.с.;
Е.А.Колганова - аспирант; Ф.З.Баймухаметов - кандидат химических наук, н.с.;
В.Р.Саитов - доктор биологических наук, ст.н.с., зав. сектором; Г.В.Конюхов - доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РТ, зав. отделом.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г. Казань (420075, Казань, Научный городок-2; тел. +7 (843) 239-53-49, e-mail: vnivi@mail.ru).
Ультраструктурные исследования комбинированного воздействия токсикантов различных групп соединений и ряда других вредоносных факторов на биологические системы и отдельные органы, помогает в понимании механизма подобного влияния, установлении предполагаемых эффектов, и дает возможность использовать полученные данные в случае реального возникновения подобных патологий. Целью исследований было изучение ультраструктурных особенностей клеток коркового вещества тимуса крыс, как в норме, так и под воздействием различных факторов (ионизирующего излучения в дозе 5 Гр; комбинированного воздействия диоксина в дозе 1/100 ЛД50 и ионизирующего излучения в дозе 5 Гр). С помощью электронной микроскопии исследовали ультраструктуру тимоцитов крыс. Образцы фиксировали в 1%-ном растворе глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4). Постфиксацию проводили в 2%-ном растворе четырехокиси осмия. Далее проводилась дегидратация материала в спиртовом ряду с постепенно повышающейся концентрацией спирта (300, 500, 700, 800, 960, 1000), с последующим помещением материала в ацетон. После дегидратации кусочки ткани заключали в смесь эпоновых смол (Epon 812 + DDSA + MNA + DMP-30 Fluka) и ацетона для постепенной пропитки. Результаты свидетельствуют, что апробированные дозы диоксина и ионизирующего излучения раздельно и комбинированно приводят к структурно-функциональным изменениям в основном ретикулярных клеток. Сами тимоциты страдают в меньшей степени.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: крысы, ультраструктура, корковое вещество, тимус, диоксин, ионизирующее излучение.
Критическими системами организма при воздействии ионизирующей радиации являются ткани и органы с интенсивным делением клеток - кроветворная система, органы иммунной системы, гонады, и др. [2]. Тимус, являясь первичным органом иммунной системы, во многом определяет не только состояние периферических органов иммуногенеза, но и выраженность защитных реакций всего организма [6]. Он чрезвычайно чувствителен к различным внешним и внутренним воздействиям [3].
В последнее время возрастает интерес к исследованию иммунных функций на тканевом и ультраструктурном уровнях, т.к. иммунокомпетентные клетки образуются и проходят все этапы своего созревания, функционирования и подвергаются апоптозу под влиянием тканевого микроокружения [5].
Анализ доступной литературы свидетельствует об отсутствии работ зарубежных коллег, касающихся изучению комбинированного воздействия диоксина, ионизирующего излучения, и применения лекарственных средств на ультраструктурное строение клеток тимуса крысы. Имеющиеся в литературе работы, выполненные с использованием стандартного излучения (рентгеновского или гамма-), также не дают целостно-
го представления об изменениях в тимусе на органном и клеточном уровнях [1], как и работы по дифференциальному влиянию диоксина на гистофизиологию тимуса [7]. В связи с этим, данные приведенные в настоящей работе, представляют интерес как для имму-номорфологов, так и для токсикологов.
Материалы и методы. Опыты проводили на белых крысах \№$1аг массой 180-200 г. Первая группа служила биологическим контролем. Особи второй группы подвергалась воздействию гамма облучения в дозе 5 Гр и им ежедневно в течение 45 сут, вводился диоксин в дозе 1/100 ЛД50.
С помощью электронной микроскопии исследовали ультраструктуру клеток коркового слоя тимуса крыс. Использовали кусочки ткани размером до 1 мм3. Подготовку отобранного материала проводили по классической методике [4]. Образцы фиксировали в 1%-ном растворе глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) в течение нескольких сут в холодильнике. После этого промывали от фиксатора в 0,1 М фосфатном буфере. Постфиксацию проводили в 2%-ном растворе четырех окиси осмия на том же буфере 2 часа. После чего материал повторно промывали 0,1 М фосфатным
буфером. Далее проводилась дегидратация материала в спиртовом ряду с постепенно повышающейся концентрацией спирта (300, 500, 700, 800, 960, 1000), с последующим помещением материала в ацетон. После дегидратации кусочки ткани заключали в смесь эпоновых смол (Epon 812 + DDSA + MNA + DMP-30 Fluka) и ацетона для постепенной пропитки.
После полимеризации смол готовили полутонкие срезы толщиной 1 мкм. Их просматривали в световом микроскопе для определения необходимого участка ткани, после чего блоки с материалом подготавливались для ультратонкой резки. Ультратонкие срезы (толщиной 70 нм) получали на ультрамикротоме LKB I II 8800. Срезы монтировали на электронно-микроскопические сетки и окрашивали уранилацета-том (1 ч) и цитратом свинца (1,5 мин). Полученные сетки со срезами изучали в электронном микроскопе JEM 100 CX-II («Jeol», Japan).
Съемку проводили на фототехническую пленку AGFA ORTHOCHROMATIC. Оцифровку негативов про-
изводили на сканере EPSON PERFECTION 4990 PHOTO с разрешением 600 dpi. Конечный результат - обрабатывали с помощью программ ACD SeeProv.6. и Axio Vision Rel. 4.8 (Carl Zeiss).
Микрофотографии объектов исследований описывали согласно современным научным требованиям.
Результаты исследований. Тимоциты крыс контрольной группы. Электронно-микроскопическое исследование тимуса контрольных крыс показывает, что клеточный состав представлен двумя основными популяциями - лимфоцитами (тимоцитами) и ретикулярными эпителиоцитами стромы. В корковом веществе лимфоциты располагаются среди отростков эпителиоретикулярных клеток. Лимфоциты имеют округлые ядра с большим количеством электронно-плотного гетерохроматина, который распределен по всему ядру (рис. 1). Для клеток характерен высокий ядерно-цитоплазматический индекс. Тонкослойная цитоплазма плотная гомогенная содержит единичные митохондрии, пероксисома.
Рис. 1. Участок корковой зоны тимуса крысы контрольной группы. Условные обозначения: МХ - митохондрии.
Эпителиоретикулярные «клетки-няньки» имеют более богатый набор органелл: единичные каналы гр ЭПС, митохондрии со светлым матриксом и небольшим количеством крист (рис. 2), вакуоли, лизосомы, осмиофильные включения и мультила-
меллярные тела. В крупных отростках удается наблюдать промежуточные кератиновые филаменты. Ядра с преобладанием фибриллярного хроматина встречаются редко. Апоптотические тельца нами не обнаружены.
Рис. 2. Участок корковой зоны тимуса крысы контрольной группы. Условные обозначения: МХ - митохондрия; ПС - пероксисома.
Тимоциты крыс после воздействия ионизирующего излучения в дозе 5 Гр. Тимоциты (молодые Т-лимфоциты) в меньшей степени проявляют признаки воздействия ионизирующего излучения. Практически не обнаруживаются изменения в упаковке хроматина, ядра плотные, темные. В единичных клетках регистрируется увеличение перинуклеарного пространства, цитоплазма плотная. Увеличивается количество митохондрий со светлым матриксом и небольшим количеством крист.
Большинство митохондрий имеет плотные осми-офильные включения или мультиламеллярные тела, которые характеризуют наличие патологических процессов. В корковом веществе тимуса признаки деструкции наблюдаются у эпителиоретикулярных «клеток-нянек», в которых созревают лимфоциты. Много электронно-прозрачных вакуолей, плотных ос-миофильных включений, отростки окружающие лимфоциты, набухают и неплотно прилегают к тимоцитам. Часто регистрируются апоптотические тельца (рис. 3).
Рис. 3. Участок корковой зоны тимуса крысы, получавшей однократное воздействие ионизирующего излучения в дозе 5 Гр. Условные обозначения: АТ - апоптотические тельца.
Заключение. Ультратонкие исследования корковой зоны тимуса крыс показали, что апробированные дозы диоксина и ионизирующего излучения раздель-
но и комбинированно приводят к структурно-функциональным изменениям в основном ретикулярных клеток. Сами тимоциты страдают в меньшей степени.
Литература
1. Ерофеева, Л.М. Морфология тимуса при моделировании экстремальных воздействий: гипергравитации ионизирующих излучений: автореф. дис. ... д-ра биол. Наук (03.00.25) / Л.М.Ерофеева. - М., 2002. - 312 с.
2. Киршин, В.А. Ветеринарная противорадиационная защита / В.А.Киршин, В.А.Бударков. - М.: Агропромиз-дат, 1990. - 207 с.
3. Москвичёв, Е.В. Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика вилочковой железы при экспериментальном канцерогенезе в условиях вторичной иммунной недостаточности: автореф. дис. . д-ра мед. наук / Е.В.Москвичёв. - Оренбург, 2013. - 30 с.
4. Трансмиссионная электронная микроскопия в биологии и медицине: монография / М.М.Сальникова, Л.В.Малютина, В.Р.Саитов, А.И.Голубев. - Казань: Казанский (Приволжский) федеральный университет, 2016. - 125 с.
5.Труфакин, В.А. Проблемы гистофизиологии иммунной системы / В.А.Труфакин, А.В.Шурлыгин // Иммунология. - 2002. - № 1. - С. 4-8.
6. Ярмоненко, С.П. Радиобиология человека и животных / С.П.Ярмоненко, А.А.Вайнсон. - М.: Высшая школа, 1988. - 594 с.
7. Effects of 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-P-Dioxin, bis (Tri-N-Butyltin) Oxideand Cyclosporineon Thymus Histophysiology / E.J.DeWaal, H.J.Schuurman, H.Van Loveren, J.G.Vos // Crit. Rev.Toxicol. - 1997. - Vol. 4, № 27. -P. 381-430.
STUDY OF THE ULTRASTRUCTURE OF THE CORN MATERIAL OF RATS TIMUS UNDER THE COMBINED EXPOSURE OF DIOXIN AND IONIZING RADIATION
Salnikova M.M. - Candidate of Biological Sciences; Kadikov I.R. - Candidate of Biological Sciences;
Zakirova G.M. - Candidate of Veterinary Sciences; Kolganova E.A. - postgraduate;
Baymukhametov F.Z. - Candidate of Chemical Sciences; Saitov V.R. - Doctor of Biological Sciences;
Konyukhov G.V. - Doctor of Biological Sciences, professor.
Federal Center for Toxicology, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: vnivi@mail.ru).
The ultrastructure stydies of combined exposure of various groups of toxicants and a number of other harmful factors both on biological systems and on separate organs help to understand the mechanism of such exposure, to define the expected effects and make possible to use the obtained data in case of the real occurrence of such pathologies. The aim of the research was to study ultrastructure features of the corn material of rats timus both normal and exposed by various factors such as: (ionizing radiation of 5 gr dose; the combined exposure of dioxin 1/100 LD0 and ionizing radiation 5 gr dose). The ultrastructure of rats timus was examined using electronic microscopy. The samples were fixed in 1 % solution of glutaraldehyde in 0,1 M phosphate buffer (Ph 7,4).The postfixation was carried out in 2% solution of tetraoxide osmic. Then the dehydration of the material in alcohol series of gradually increasing alcohol concentration (30, 50, 70, 80, 96, 100) was carried out, and then the corn material was immersed in acetone. After dehydration the parts of tissues were placed in the mixture of epon and acetone (Epon 812+DDSA+MNA+DMP-30 Fluka) for gradual saturation. The results indicated the tested dioxin and ionizing radiation doses both separately and combined to cause the structure and functional changes mainly in reticule cells. The timus cells themselves suffer changes in less degree.
KEYWORDS: rats, ultrastructure, corn material, timus, dioxin, ionizing radiation.
References
1. Erofeeva, L.M. Morfologiya timusa pri modelirovanii ehkstremalnyh vozdejstvij: gipergravitacii ioniziruyushchih izluchenij [Morphology of timus in modelling extreme exposures: hypergravitations of ionizing radiation] abstract from dissertation for Doctor of Biological Sciences. - M., 2002. - 312 p.
2. Kirshin, V.A. Veterinarnaya protivoradiacionnaya zashchita [Veterinary antiradiation protection] / V.A.Kirshin, V.A.Budarkov. - M.: Agropromizdat, 1990. - 207 p.
3. Moskvichyov, E.V. Morfologicheskaya i immunogistohimicheskaya harakteristika vilochkovoj zhelezy pri ehksperimentalnom kancerogeneze v usloviyah vtorichnoj immunnoj nedostatochnosti [Morphological and immunohistochemical characteristics of thymus in experimental cancerogenesis under secondary immune incompetence] abstract from dissertation for Doctor of Medical Sciences: 03.03.04. - Orenburg, 2013. - 30 p.
4. Transmissionnaya ehlektronnaya mikroskopiya v biologii i medicine: monografiya [Transmission electronic microscopy in Biology and Medicine: a monograph] / M.M.Salnikova, L.V.Malyutina, V.R.Saitov, A.I.Golubev. - Kazan: Kazanskij (Privolzhskij) Federalnyj Universitet, 2016. - 125 p.
5. Trufakin, V.A. Problemy gistofiziologii immunnoj sistemy [Problems of histophysiology of immune system] / V.A.Trufakin, A.V.Shurlygin // Immunologiya. - 2002. - № 1. - P. 4-8.
6. Yarmonenko, S.P. Radiobiologiya cheloveka i zhivotnyh [Human and animals radiobiology] / S.P.Yarmonenko, A.A.Vajnson. - M.: Vysshaya shkola, 1988. - 594 p.
7. Effects of 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-P-Dioxin, bis (Tri-N-Butyltin) Oxideand Cyclosporineon Thymus Histophysiology / E.J.DeWaal, H.J.Schuurman, H.VanLoveren, J.G.Vos // Crit. Rev. Toxicol. - 1997. - Vol. 4, № 27. - P. 381-430.
