CC BY
1
УДК 615.011.5:577.11:612.017.4 DOI 10.31684/25418475-2024-3-56
ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ТРИПЕПТИДА LEU-ILE-LYS
Алтайский государственный медицинский университет (ФГБОУ ВО АГМУ Минздрава России)
Россия, 656038, Алтайский край, г. Барнаул, пр. Ленина, 40
Жариков А. Ю., Мазко О. Н., Кальницкий А. С., Семенихина Н. М., Сергиенко У. С.
Резюме
Введение. Комплексная оценка токсичности новых фармакологически активных веществ является необходимым этапом их доклинических исследований. Ранее в эксперименте на животных была изучена фармакологическая активность трипептида Leu-Ile-Lys, проявившего антилитогенное действие при экспериментальном оксалатном и уратном нефролитиазе, нефропротекторное действие при экспериментальном сахарном диабете 2 типа, а также гастропротекторное действие при экспериментальной «индомета-циновой» гастропатии. Для оценки применимости (безопасности) трипептида Leu-Ile-Lys и дальнейшего изучения в качестве потенциального лекарственного средства необходимо оценить его токсичность. Цель работы. Оценить токсичность трипептида Leu-Ile-Lys на культуре клеток аденокарциномы легкого человека А549.
Материалы и методы. Изучение цитотоксичности проводили на культуре клеток аденокарциномы легкого человека А549. Выделяли контрольную и 5 подопытных групп. Готовили растворы трипептида Leu-Ile-Lys в культуральной среде Dulbecco's Modified Eagle's Medium с концентрацией 0,5, 1, 2, 5 и 10 мг/мл. Подготавливали монослой клеток с последующей заменой культуральной среды на растворы исследуемого вещества с последующей 24-часовой инкубацией в среде углекислого газа при 37оС. В рамках качественного контроля изучали морфологию и плотность монослоя. Количественный контроль осуществляли подсчетом количества клеток в камере Горяева.
Результаты. Каких-либо значимых изменений морфологии клеток, плотности монослоя, а также количества клеток в сравнении с контролем во всех опытных группах выявлено не было.
Заключение. Выявленное отсутствие цитотоксичности трипептида Leu-Ile-Lys свидетельствует о перспективности дальнейших исследований указанного вещества с целью разработки новых лекарственных средств на его основе.
Ключевые слова: трипептид Leu-Ile-Lys, цитотоксичность, культура клеток.
STUDY OF THE CYTOTOXICITY OF LEU-ILE-LYS TRIPEPTIDE
Altai State Medical University
Russia, 656038, Altai Krai, Barnaul, Lenin Ave., 40
Zharikov A. Yu., Mazko O. N., Kalnitsky A. S., Semenikhina N. M., Sergienko U. S.
Abstract
Introduction. A comprehensive study of the toxicity of new pharmacologically active substances is a necessary step for their introduction into practical medicine. Earlier, studies of the Leu-Ile-Lys tripeptide, which showed an an-ti-lithogenic effect in experimental oxalate and urate nephrolithiasis, a nephroprotective effect in experimental type 2 diabetes mellitus, as a well as gastroprotective effect in experimental "indomethacin" gastropathy, were carried out at the Federal State Budgetary Educational Institution of the Ministry of Health of the Russian Federation. Currently, there is an active development of methods for investigating the effectiveness and safety of biologically active substances in vitro, which directly assess the direct effect of the substances under study on the vital activity of cell cultures. Objective. Study of the the cytotoxicity of Leu-Ile-Lys tripeptide in cell culture.
Materials and methods. Cytotoxicity was studied on human lung adenocarcinoma cell culture A549. A control group and five experimental groups were identified. Solutions of Leu-Ile-Lys tripeptide were prepared in Dulbecco's Modified Eagle's Medium culture medium with concentrations of 0.5,1, 2, 5 and 10 mg/ml. A monolayer of cells was prepared, followed by replacement of the culture medium with solutions of the test substance, followed by 24-hour incubation in carbon dioxide at 37° C. As part of the qualitative control, the morphology and density of the monolayer were studied. Quantitative control was carried out by counting the number of cells in the Goryaev chamber. Results. No significant changes in cell morphology, monolayer density, or cell count were detected in comparison to the control in all experimental groups.
Conclusion. Thus, the revealed absence of cytotoxicity of the Leu-Ile-Lys tripeptide indicates the prospects for further research of this substance in order to develop new pharmacological agents based on it. Keywords: Leu-Ile-Lys tripeptide, cytotoxicity, cell culture.
Введение
Поиск новых фармакологически активных молекул для эффективной и безопасной коррекции различных патологий сохраняет свою высокую актуальность. Перспективным направлением разработки инновационных фармако-56
логических средств является так называемый «протеомный» подход, заключающийся в моделировании различных пептидных молекул и их экспериментальном изучении для определения фармакологической активности. В качестве основных преимуществ указанного метода пред-
сгавляется возможность осуществления медикаментозного влияния на уровне аутокринной регуляции работы органов и систем, а также потенциальная малотоксичность пептидных соединений ввиду высокой степени идентичности природным структурам [1, 2, 3].
Ранее нами был смоделирован трипептид Leu-Ile-Lys ^К-3) и изучена его фармакологическая активность. Установлено, что LK-3 проявляет антилитогенный эффект в экспериментальных условиях на фоне уратного [4] и оксалатного нефролитиаза [5], нефропро-текторное действие в условиях экспериментального сахарного диабета 2 типа [6], а также гастропротекторное действие при экспериментальной язвенной болезни желудка, индуцированной введением индометацина [7]. Учитывая современные требования к новым фармакологически активным веществам, позволяющие осуществить внедрение в клиническую медицину в случае наличия экспериментального доказательства как эффективности, так и безопасности предлагаемого способа фармакологического вмешательства, необходимым направ-
лением научных исследовании представляется комплексное изучение токсичности LK-3.
Стоит отметить, что в последние годы в экспериментальной фармакологии и токсикологии идет активное развитие методов исследования in vitro, позволяющих определить токсическое влияние биологически активных веществ с использованием клеточных культур [8].
Цель исследования: оценить токсичность трипептида Leu-Ile-Lys на культуре клеток аде-нокарциномы легкого человека А549.
Материалы и методы
В рамках доклинических исследований для первичного скрининга токсичности пептида использовали 5 дозировок пептида [8] (табл. 1). Для растворения порошка пептида использовали культуральную среду Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (производитель ПанЭко, Россия). После этого оценивали кислотность и при необходимости корректировали до нейтральной 0,1 Н раствором №OH.
Таблица 1
Исследуемые дозировки трипептида Leu-Ile-Lys
Номер группы Разведение рН
1 группа 0,5 мг/мл нейтральная
2 группа 1мг/мл кислая
3 группа 2 мг/мл кислая
4 группа 5 мг/мл кислая
5 группа 10 мг/мл кислая
Культура клеток - аденокарцинома легкого человека А549, используемая в исследованиях, была получена из клеточного банка лаборатории клеточных технологий Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск. Данная культура является иммортализованной раковой линией, которая используется в биотехнологии, клеточной биологии, в том числе при оценке токсичности медицинских изделий и фармакологических средств.
Для оценки прямого цитотоксического действия предварительно подготавливали монослой клеток, чтобы он достигал не менее 80%. Для этого в 24-луночный планшет засевали по 25 000 клеток на одну лунку и заливали полной ростовой средой, (состав: DMEM (ПанЭко), 10% FBS ^Шга), АпИ-АпИ ^Шга) 0,5 мл) в количестве 1 мл в каждую лунку. При этом засеивали не менее 3 проб для каждого образца. На 5 день (при достижении монослоя) производили замену ростовой среды на подготовленные разведения. В контрольной группе производили смену новой ростовой средой. После этого выдерживали клетки 24 часа в С02 инкубаторе при следующих условиях: 37°С и 5% С02.
Качественный контроль проводили визуальным методом после окраски клеток красителем генцианвиолетом под инвертированным микроскопом. При этом оценивали морфологию (форма клеток, размер и форма ядра, цитоплазма) и плотность монослоя. Количественную оценку проводили путем подсчета клеток в монослое при помощи камеры Горяева во всех трех лунках из каждой группы.
Полученные данные были статистически обработаны. Определяли среднее значение, ошибку средней (М±т).
Результаты
При проведении качественной оценки после культивирования с пептидом через 24 часа выраженных изменений в морфологии клеток во всех группах не наблюдалось. Клетки подопытных групп имели общую морфологию с клетками контрольной группы, в частности они были преимущественно полигональной формы, расположенные компактно. Ядра клеток среднего размера, округлой формы, центрально расположенные, с мелкозернистым хроматином и 2-3 ядрышками. Цитоплазма умеренная, с выраженными границами (рис. 1-3).
Рисунок 2. Клетки на фоне введения трипептида Leu-Ile-Lys, увеличение х40
Рисунок 3. Клетки контрольной группы, окраска генцианвиолетом, увеличение х40
При оценке плотности монослоя существенной разницы среди исследуемых групп не выявлено. Клетки во всех чашках занимали более 85% поверхности культурального сосуда, располагались равномерно. Вакуолизация, лизис клеток, наличие клеточного дебриса также не
имели визуальных отличий между группами.
При подсчете клеток стандартными рутинными методами статистически значимых колебаний между подопытными группами и контролем не выявлено. Полученные значения указаны в таблице 2.
Таблица 2
Количественная оценка прямой токсичности разных дозировок трипептида Leu-Ile-Lys
№ группы Дозировка Количество клеток
1 лунка 2 лунка 3 лунка Среднее значение (M±m)
1 0,5 мг/мл 95 84 66 81,67±7,32
2 1 мг/мл 100 62 79 80,33±9,51
3 2 мг/мл 53 85 80 72,67±8,60
4 5 мг/мл 59 65 74 66,0±3,78
5 10 мг/мл 66 90 73 76,33±6,17
6 контроль 75 68 81 74,66±3,25
Обсуждение
Таким образом, различные концентрации исследуемого трипептида, в том числе и очень высокие, не проявляют цитотоксического действия в отношении тестируемых клеток адено-карциномы легкого человека.
Учитывая природное происхождение исследуемой аминокислотной последовательности, полученной по результатам определения аминокислотного состава биомедицинской
субстанции из тканей свиных почек [9], можно заключить, что результаты эксперимента подтверждают исходную гипотезу о низкой токсичности исследуемого вещества, представляющего собой короткую пептидную молекулу биосинтетического происхождения.
Заключение
Трипептид Leu-Ile-Lys не обладает цитоток-сичностью в отношении клеток аденокарцино-
мы легкого человека А549. Это обосновывает перспективу проведения дальнейших исследований для создания нового лекарственного средства.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Источник финансирования. Исследование проведено в рамках выполнения государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации (№ 056-00046-24-00, тема «Противоязвенная активность пептидного средства LK-3. Эффективность применения в комбинации с нестероидными противовоспалительными препаратами для ослабления их ульцерогенного действия»).
Список литературы:
1. Жуйкова С.Е. Глипролины - регулятор-ные пептиды с интегративным действием. Интегративная физиология. 2020; (4): 303-316. https://doi.org/10.33910/2687-1270-2020-1-4-303-316
2. Хавинсон В.Х., Соловьев А.Ю., Тарновская С.И., Линькова Н.С. Механизм биологической активности коротких пептидов: проникновение в клетку и эпигенетическая регуляция экспрессии генов. Успехи современной биологии. 2013; 133(3): 310-316. EDN: QYZWKH. https:// doi.org/10.1134/S2079086413060042
3. Сломинский П.А., Шадрина М.И. Пептидные лекарственные средства: возможности, перспективы и ограничения. Мол. ген., микробиол. и вирусол. 2018; 26(1):8-14. https://doi. org/10.18821/0208-0613-2018-36-1-8-14
4. Жариков А.Ю., Мазко О.Н., Макарова О.Г., Бобров И.П., Кальницкий А.С., Жарикова Г.В., Якушев Н.Н., Госсен И.Е. Эффективность трипептида Leu-Ile-Lys в коррекции экспериментального уратного нефролитиаза. Казанский медицинский журнал. 2021; 102(4): 494-500. https://doi.org/10.17816/KMJ2021-494
5. Жариков А.Ю., Якушев Н.Н., Жарикова Г.В., Мазко О.Н., Макарова О.Г., Лепилов А.В., Бобров И.П. Влияние трипептида Leu-Ile-Lys на течение экспериментального оксалатного нефролитиаза. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2019; 167(6): 704-708. EDN: XLWWSF. https://doi.org/10.1007/s10517-019-04614-w
6. Жарикова Г.В., Жариков А.Ю., Мазко О.Н., Макарова О.Г., Бобров И.П., Кальницкий А.С. Нефропротективное действие трипептида Leu-Ile-Lys при экспериментальном сахарном диабете. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2022; 173(2): 182-187. https://doi. org/10.47056/0365-9615-2022-173-2-182-187
7. Zharikov A.Yu., Lorente S.E., Bobrov I.P., Mazko O.N., Makarova O.G. Pharmacologically active tripeptide Leu-Ile-Lys in indomethacin-in-duced gastric ulcer. International Journal of Biomed-icine. 2018; 8(4): 351-354. https://doi.org/10.21103/ Article8(4)_OA17
8. Плотникова Э.М., Ларина Ю.В., Глаголева И.С., Фазлиахметов Р.Г. Разработка альтерна-
тивных методов оценки токсичности химических соединений на организм с использованием культур клеток. Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. 2013; 216: 272-275. EDN: RGEFMP
9. Жариков А.Ю., Жарикова Г.В., Мазко О.Н., Макарова О.Г., Кирьякова В.О. К вопросу идентификации биологически активных веществ нового средства для лечения мочекаменной болезни. Бюллетень медицинской науки. 2017; 1: 28-31. https://doi.org/10.31684/2541-8475.2017.1(5).28-31
References
1. Zhuikova S.E. Glyprolines: regulatory peptides with an integrative action. Integrativnaja fiziologija. 2020; (4): 303-316. (In Russ.) https://doi. org/10.33910/2687-1270-2020-1-4-303-316
2. Khavinson V.Kh., Soloviev A.Yu., Tar-novskaya S.I., Lin'kova N.S. The mechanism of short peptides biological activity: cell-penetration and epigenetic regulation of gene expression. Us-pehi sovremennoj biologii. 2013; 133(3): 310-316. (In Russ.) EDN: QYZWKH. https://doi.org/10.1134/ S2079086413060042
3. Slominsky P.A., Shadrina M.I. Peptide pharmaceuticals: opportunities, prospects, and limitations. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2018; 26(1): 8-14. (In Russ.) https://doi. org/10.18821/0208-0613-2018-36-1-8-14
4. Zharikov A.Yu., Mazko O.N., Makarova O.G., Bobrov I.P., Kalnitsky A.S., Zharikova G.V., Yakushev N.N., Gossen I.E. Efficacy of Leu-Ile-Lys tripeptide in the correction of experimental urate nephrolithiasis. Kazan medical journal. 2021; 102(4): 494-500. (In Russ.) https://doi.org/10.17816/ KMJ2021-494
5. Zharikov A.Yu., Yakushev N.N., Zharikova G.V., Mazko O.N., Makarova O.G., Lepilov A.V., Bobrov I.P. Effect of tripeptide Leu-Ile-Lys on the course of experimental nephrolithiasis. Bjulleten' jeksperimental'noj biologii i mediciny. 2019; 167(6): 704-708. (In Russ.) EDN: XLWWSF. https://doi. org/10.1007/s10517-019-04614-w
6. Zharikova G.V., Zharikov A.Yu., Mazko O.N., Makarova O.G., Bobrov I.P., Kalnitsky A.S. Nephroprotective effect of Leu-Ile-Lys tripeptide in experimental diabetes mellitus. Bjulleten' jeksperimental'noj biologii i mediciny. 2022; 173(2): 182187. (In Russ.) https://doi.org/10.47056/0365-9615-2022-173-2-182-187
7. Zharikov A.Yu., Lorente S.E., Bobrov I.P., Mazko O.N., Makarova O.G. Pharmacologically active tripeptide Leu-Ile-Lys in indomethacin-in-duced gastric ulcer. International Journal of Biomed-icine. 2018; 8(4): 351-354. https://doi.org/10.21103/ Article8(4)_OA17
8. Plotnikova E.M., Larina J.B., Glagoleva I.S., Fazliahmetov R.G. Development of alternative metods of the assessment toxicological, impacts on the organism with use of cell cultures. Uchenye zapiski Kazanskoj gosudarstvennoj akademii veterinar-noj mediciny im. N.E. Baumana. 2013; 216: 272-275. (In Russ.) EDN: RGEFMP
9. Zharikov A.Yu., Zharikova G.V., Mazko O.N., Makarova O.G., Kiryakova V.O. Identification of bioactive substances of a new drug for the treatment of kidney stone. Bulletin of Medical Science. 2017; 1: 28-31. (In Russ.) https://doi. org/10.31684/2541-8475.2017.1(5).28-31
Контактные данные
Автор, ответственный за переписку: Кальниц-кий Артем Сергеевич, к. б. н., доцент кафедры фармакологии имени профессора В.М. Брю-ханова, Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул. E-mail: [email protected] WoS ResearcherlD: AAD-8815-2022, Scopus Au-thorlD: 57224973144, SPIN-код: 3874-6429, AuthorlD: 1073703 https://orcid.org/0000-0003-3500-3052
Информация об авторах
Жариков Александр Юрьевич, д. б. н., доцент, заведующий кафедрой фармакологии имени профессора В.М. Брюханова, Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул.
E-mail: [email protected]
WoS ResearcherID: N-6003-2016, Scopus Author-
ID: 16318256900,
SPIN-код: 9300-5500, AuthorlD: 633576 https://orcid.org/0000-0003-4884-220X
Мазко Олеся Николаевна, к. б. н., доцент, директор Института фармации, доцент кафедры фармакологии, Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул. E-mail: [email protected] Scopus AuthorlD: 57208400392, SPIN-код: 23973895, AuthorID: 658074 https://orcid.org/0000-0001-7299-4516
Семенихина Наталья Михайловна, к. вет. н., доцент кафедры анатомии, Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул.
E-mail: [email protected] SPIN-код: 9767-5928, AuthorID: 815271
Сергиенко Ульяна Сергеевна, студентка 2 курса, Институт клинической медицины, Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул.
E-mail: [email protected]
Contact information
Corresponding author: Artem S. Kalnitsky, Cand. Sci. (Biol.), Associate Professor of the Department
of Pharmacology named after Professor V.M. Bryukhanov, Altai State Medical University, Barnaul.
E-mail: [email protected]
WoS ResearcherID: AAD-8815-2022, Scopus Au-
thorID: 57224973144,
SPIN: 3874-6429, AuthorID: 1073703
https://orcid.org/0000-0003-3500-3052
Author information
Alexander Yu. Zharikov, Dr. Sci. (Biol.), Associate Professor, Head of the Department of Pharmacology named after Professor V.M. Bryukhanov, Altai State Medical University, Barnaul. E-mail: [email protected] WoS ResearcherID: N-6003-2016, Scopus Author-ID: 16318256900,
SPIN: 9300-5500, AuthorID: 633576 https://orcid.org/0000-0003-4884-220X
Olesya N. Mazko, Cand. Sci. (Biol.), Associate Professor, Director of the Institute of Pharmacy, Associate Professor of the Department of Pharmacology of the Altai State Medical University, Barnaul. E-mail: [email protected] Scopus AuthorID: 57208400392, SPIN: 2397-3895, AuthorID: 658074
https://orcid.org/0000-0001-7299-4516
Natalia M. Semenikhina, Cand. Sci. (Vet.), Associate Professor of the Department of Anatomy, Altai State Medical University, Barnaul. E-mail: [email protected] SPIN: 9767-5928, AuthorID: 815271
Ulyana S. Sergienko, 2nd year student, Institute of Clinical Medicine, Altai State Medical University, Barnaul.
E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 12.08.2024 Принята к публикации 19.09.2024
Для цитирования: Жариков А. Ю., Мазко О. Н., Кальницкий А. С., Семенихина Н. М., Сергиенко У. С. Изучение цитотоксично-сти трипептида LEU-ILE-LYS. Бюллетень медицинской науки. 2024; 3(35): 56-61. https://doi. org/10.31684/25418475-2024-3-56
Citation: Zharikov A. Yu., Mazko O. N., Kalnitsky A. S., Semenikhina N. M., Sergienko U. S. Study of cytotoxicity of LEU-ILE-LYS tripep-tide. Bulletin of Medical Science. 2024; 3(35): 5661. https://doi.org/10.31684/25418475-2024-3-56 (In Russ.)
