CC BY
19Оригинальные исследования
Изучение церебропротекторных свойств некоторых флавоноидов и производных коричной кислоты на модели фокальной ишемии головного мозга крыс
А.В. Воронков, Д.И. Поздняков, С.А. Нигарян
Study of cerebroprotective properties of certain flavonoids and derivatives of borin acid on a model of rats brain ischemia
A.V. Voronkov, D.I. Pozdnyakov, S.A. Nigaryan
Пятигорский медико-фармацевтический институт-филиал ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет», г. Пятигорск
Ключевые слова: ишемия, мексидол, флавоноды, теофлавин, диосмин, коричная кислота, сорбиновая кислота
Резюме
Изучение церебропротекторных свойст некоторых флавоноидов и производных коричной кислоты на модели фокальной ишемии головного мозга крыс
А.В. Воронков, Д.И. Поздняков, С.А. Нигарян
Данная экспериментальная статья содержит результаты изучения церебропротекторных свойств некоторых флавоноидов (теофлавин, диосмин), а также производных фенилпропаноидов (коричная и сорбиновая кислоты) в условиях фокальной ишемии головного мозга крыс. Эксперимент был выполнен на 42 крысах-самцах линии Wistar, предварительно рандомизированных в соответствии с их поведенческой активностью. Изучаемые соединения вводились на протяжении трех дней интрагастрально в дозировке 100 мг/кг после воспроизведения фокальной ишемии головного мозга. В качестве референтного препарата был выбран Мексидол (100 мг/кг). Оценку фармакологической активности веществ изучали в тестах на ноотропную активность УРПИ и ТЭИ, через серию биохимических тестов: лактат, пируват, гомоцистеин. Кроме этого, оценивали влияние данных соединений на отек и некроз мозговой ткани. Результаты исследования показали, что в экспериментальных условиях все изучаемые соединения улучшают энергообмен головного мозга, уменьшая образование лактата, пирувата, гомоцистеина. Исследуемые вещества также уменьшали уровень образования отека и степень некротизированности мозговой ткани. В тестах
Воронков Андрей Владиславович - доцент, д.м.н., заведующий кафедрой фармакологии с курсом клинической фармакологии Пятигорского медико-фармацевтического института. Контактная информация: e-mail: prohor77@mail.ru, пр. Калинина, 11, Пятигорск, Ставропольский край, Россия, 357500
Поздняков Дмитрий Игоревич - преподаватель кафедры фармакологии с курсом клинической фармакологии Пятигорского медико-фармацевтического института. Контактная информация: e-mail: pozaniackow.dmitry@yanaex.ru, пр. Калинина, 11, Пятигорск, Ставропольский край, Россия, 357500 Нигарян Сирануш Артуровна - аспирант первого года обучения кафедры фармакологии с курсом клиническойфармакологии Пятигорского медико-фармацевтиче- ского института. Контактная информация: e-mail: 79682650210@yandex.ru, пр. Калинина, 11, Пятигорск, Ставропольский край, Россия, 357500
УРПИ и ТЭИ практически у всех соединений также отмечена тенденция к сохранению памятного следа у животных. Опираясь на результаты нашего исследования, можно говорить о перспективности дальнейшего углубленного изучения данных соединений на предмет церебропротекторной активности.
Ключевые слова: ишемия, мексидол, флавоноды, теофлавин, диосмин, коричная кислота, сорбино-вая кислота
Abstract
Study of cerebroprotective properties of certain flavonoids and derivatives of borin acid on a model of rats brain ischemia
A.V Voronkov, D.I. Pozdnyakov, S.A Nigaryan
This experimental article contains the results of a study of the nootropic and cerebroprotective properties of certain flavonoids (theoflavin, diosmin), as well as derivatives of phenylpropanoids (cinnamic and sorbic acids) under conditions of focal ischemia in the brain of rats. The experiment was performed on 42 Wistar male rats, previously randomized according to their behavioral activity. The studied compounds were administered intragastrally for three days at a dosage of 100 mg/kg after reproduction of focal cerebral ischemia. Mexidol (100 mg/kg) was chosen as the reference drug. Evaluation of the pharmacological activity of substances was studied in tests for the nootropic activity of the CPAR and TEI, through a series of biochemical analyzes: lactate, pyruvate, homocysteine. In addition, the effect of these compounds on edema and necrosis of brain tissue was evaluated. The result of our study showed that under experimental conditions, all the studied compounds improve the energy exchange of the brain, reducing the formation of lactate, pyruvate, homocysteine. The positive effect of the studied substances was observed on the formation of edema and the degree of necrosis of the brain tissue. In tests of passive avoidance reaction and TEI, practically all the compounds also showed a tendency to improve the parameters studied: passive avoidance reaction — the time of entry into the dark compartment, TEI — the number of diving attempts, the time of latent diving of animals. Based on the results of our research, it is possible to speak about the perspectivity of the further in-depth study of these compounds for nootropic and cerebroprotective activity.
Введение
На сегодняшний день актуальным является поиск соединений растительного происхождения, на основе которых разрабатываются различные лекарственные препараты. Это связано с низкой токсичностью природных объектов, возможностью их применения в комплексной терапии, а также отсутствием или минимальным проявлением нежелательных реакций на организм [1]. В связи с этим наибольший интерес для ученых представляет обширные классы природных соединений - флавоно-иды и производные фенилпропаноидов. Известно, что флавоноиды способны проявлять антиокси-дантное и антирадикальное, метаболическое действие, а также улучшают функцию митохондрий [2]. Производным коричной кислоты также присущ целый ряд положительных эффектов: антиоксидант-ный, противовоспалительный, эндотелиопротек-тивный [3].
В основе патогенеза ишемического инсульта, который стоит в ряду основных причин смертности и нетрудоспособности во всем мире, лежат оксидатив-ный стресс, формирование отека головного мозга, дисфункция митохондрий, а как следствие - энергодефицит, лактатацидоз и некроз мозговой ткани [4]. Кроме того, в условиях ишемического инсульта отмечается нарушение когнитивных функций, что усложняет социальную жизнь лиц, перенесших ин-
сульт [5]. Все это создает возможность предполагать о том, что флавоноиды, а также производные фенилпропаноидов могут оказывать положительное влияние на патогенетические звенья ишемиче-ского инсульта. В этой связи нами было проведено исследование, посвященное изучению теофлавина, диосмина, коричной и сорбиновой кислот на предмет церебропротекторной активности.
Цель работы
Изучить теофлавин, диосмин, коричную и сорби-новую кислоты на предмет ноотропной и церебро-протекторной активности.
Материал и методы
Эксперимент выполнялся на 42 крысах-самцах линии Wistar, разделенных на 6 равных групп (п=6). Работа с экспериментальными животными выполнялась в соответствии с общепринятыми этическими нормами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (1986) и с учетом Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). Все манипуляции соответ-
ствовали национальному стандарту Российской Федерации ГОСТ Р-53434-2015 «Принципы надлежащей лабораторной практики».
Предварительно животные были рандомизиро-ваны по поведенческой активности и массе (220240 г). Первая группа крыс - ложнооперированные (Л/О) животные. Вторая группа животных - группа негативного контроля (НК). Третья группа крыс - группа, которой вводили препарат сравнения Мексидол (100 мг/кг, Мосхимфармпрепараты, Россия) [6]. Второй и последующим группам крыс воспроизводили ишемическое повреждение головного мозга методом необратимой окклюзии правой средней мозговой артерии [7]. Исследуемые соединения в дозировке 100 мг/кг и референтный препарат вводили интрагастрально на следующие сутки после воспроизведения ишемии и далее в течение 3 суток. На четвертые сутки крыс декапитировали в условиях хлоралгидратного наркоза (350 мг/кг) и проводили оценку изменений таких показателей, как концентрация молочной и пировиноградной кислот в сыворотке крови, величина зоны некроза и отека головного мозга, сывороточное содержание гомоцистеина. Содержание молочной и пировино-градной кислот в сыворотке крови определяли эн-зиматическим колориметрическим методом с применением стандартных наборов реактивов производства НПФ «Арбис +» (Санкт-Петербург, Россия). Для проведения оценки содержания гомоцистеина в плазме крови применяли стандартный набор реактивов «DiaSys» (Германия). Оценку степени гидратации головного мозга производили методом высушивания, для чего у животных извлекали головной мозг, инкубировали 24 часа при 60°С. Величину отека головного мозга устанавливали по разнице масс до и после инкубации [8]. Оценку зоны некроза производили трифенилтетразолиевым методом, в основе которого лежит изменение оптической плотности хлороформного экстракта формазана между некротизированным и интактным участком головного мозга [9]. Обработку результатов эксперимента проводили методом вариационной статистики с применением пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., США для операционной системы Windows). Полученные данные проверяли нормальность распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка. В том случае, если данные распределения оказывались нормальными, для сравнения средних использовали ANOVA с апостериорным критерием Ньюмена-Кейсла. В случае ненормального распределения результатов опыта, дальнейшую статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Вилкоксона.
Результаты и обсуждение
В условиях фокальной ишемии головного мозга крыс наблюдалось развитие некроза мозговой ткани (52,38 ± 3,03), что соответствует литературным данным [10]. Статистически значимо увели-
чивалась степень образования лактата (176,8% (р<0,05)), пирувата (99,9% (р<0,05)), а также гомоцистеина (352,2% (р<0,05)). В тесте УРПИ после воспроизведения ишемии отмечено снижение латентного времени захода крыс в темный отсек, время подныривания животных в тесте экстраполяцион-ного избегания было увеличено на 69,6% (р<0,05) относительно ложнооперированной группы животных (рис.1, рис.2, табл.1).
В тестах на ноотропную активность практически все экспериментальные соединения проявляли положительный эффект. Так, в тесте УРПИ статистическое значимое увеличение времени латентного захода в темный отсек наблюдалось у всех исследуемых соединений. Относительно группы животных НК наибольший эффект отмечался у коричной кислоты: увеличение латентного времени в темный отсек на 215,75%, сорбиновая кислота на 206% (р<0,05), диосмин на 198,78% (р<0,05), теофлавин на 168,1% (р<0,05). Мексидол при этом увеличивал время захода в темный отсек на 71,2% (р<0,05). Оба флавоноида и производных фенилпропаноидов превосходили по своему эффекту реферетный препарат: коричная кислота - на 84,4%, сорбиновая кислота - на 78,76% (р<0,05), диосмин - на 74,5% (р<0,05), теофлавин - на 56,63% (рис.1).
В тесте экстраполяционного избавления (ТЭИ) оценивали показатель латентного времени под-ныривания крыс под цилиндр. В данном тесте производные фенилпропаноидов проявили более выраженный ноотропный эффект, который проявлялся в снижении времени подныривания крыс. В сравнении с группой животных НК, у крыс, получавших сорбиновую кислоту, замечено уменьшение времени подныривания на 1270,6% (р<0,05), тогда как у коричной кислоты на 350,87% (р<0,05). В этих же условиях введение теофлавина относительно группы крыс НК снижало время подныривания на 259,4% (р<0,05). Следует отметить, что при введении крысам диосмина, статистически значимых отличий не наблюдалось (рис.1).
Исследование флавоноидов и производных фе-нилпропаноидов на развитие отека головного мозга в условиях ишемии показало, что сорбиновая кислота из всех исследуемых соединений оказывала наибольшее влияние на уменьшение отека головного мозга в сравнении с группой крыс НК (на 11,2%, р<0,05). Примерно в одинаковых значениях находятся показатели Мексидола, диосмина и коричной кислоты: уменьшение уровня гидратации ткани мозга животных относительно группы крыс НК на 9,4% (р<0,05), 9,5% (р<0,05) и 8,2% (р<0,05), соответственно. При введении животным теофла-вина статистически значимых результатов на данный исследуемый параметр не наблюдалось (рис.2).
В результате исследования влияния данных соединений на степень образования некроза головного мозга выявлено, что максимальные изменение (снижение) оказали сорбиновая кислота (52,6%, р<0,05) и диосмин (50,3%, р<0,05). В сравнении с
Рис. 1. Изучение влияние исследуемых соединений на предмет ноотропной активности в тестах УРПИ и ТЭИ.
Примечание: * - статистически значимо относительно НК группы крыс (критерий Ньюмена-Кейсла; р<0,05);
Рис. 2. Влияние исследуемых соединений на уровень образование отека и некроза мозговой ткани в условиях фокальной ишемии головного мозга. Примечание: * - статистически значимо относительно группы крыс НК (критерий Ньюмена-Кейсла; р<0,05)
группой крыс НК теофлавин (38,49%, р<0,05) и коричная кислота (37,87%, р<0,05) также оказывали статистически значимое уменьшение формирования некроза мозговой ткани животных (рис.2)
Известно, что лактат, пируват и гомоцистеин являются важными биомаркерами различных патологических состояний, среди которых также ишеми-ческий инсульт [11]. В этой связи была проведена серия биохимических тестов, в результате которых изучали концентрацию лактата и пирувата в сыворотке крови, а также сывороточное содержание гомоцистеина. При исследовании замечено, что на степень образования лактата больше всего оказывала действие коричная кислота, уменьшая концентрацию лактата на 128,24% (р<0,05) относительно группы крыс НК и на 96,2% (р<0,05) относительно группы, которой вводили Мексидол. Теофлавин, сор-
биновая кислота и диосмин в несколько раз меньше снижали образование лактата относительно коричной кислоты, но в то же время статистически значимо снижали данный показатель в сравнении с группой крыс НК: на 33,48% (р<0,05), 30% (р<0,05) и 26,16% (р<0,05), соответственно. Уменьшение образования пирувата относительно группы крыс НК отмечено при применении диосмина (117,23% (р<0,05)) и сорбиновой кислоты (92,2%, р<0,05). Отметим, что диосмин и сорбиновая кислота по степени уменьшения пирувата превосходит также Мексидол на 26,5% (р<0,05) и 11,95% (р<0,05). При введение крысам теофлавина (71,7% (р<0,05)) и коричной кислоты (54,48% (р<0,05)) также наблюдали статистически значимые отличия на концентрацию пирувата в сыворотке. Введение животным теофлавина и сорбиновой кислоты вызывало сни-
Табл. 1
Влияние исследуемых соединении на изменение биохимических показателей в условиях фокальной ишемии головного мозга крыс
Исследуемый параметр Л/О НК Мексидол Теофлавин Диосмин Коричная кислота Сорбиновая кислота
Лактат, ммоль/л 1,08 ± 0,1 2,99 ± 0,024# 2,57 ± 0,16* 2,24 ± 0,068* 2,37 ± 0,1* 1,31 ± 0,017* 2,3 ± 0,034*
Пируват, мкмоль/л 100,38 ± 1,1 200,68 ± 15,6# 116,89 ± 5,82* 116,89 ± 5,82* 92,38 ± 3,4* 129,9 ± 6,696* 104,41 ± 5,82*
Гомоцистеин, нг/мл 10,27 ± 0,675 46,44 ± 1,054# 26,75 ± 1,617* 26,75 ± 1,617* 32,29 ± 1,081* 28,65 ± 1,25* 27,2 ± 0,45*
Примечание: Л/О - группа ложнооперированных крыс, НК - группа крыс негативного контроля
* - статистически значимо относительно группы животных Нк
# - статистически значимо относительно Л/О группы животных
жение уровня образования гомоцистеина, уменьшая его содержание относительно группы крыс НК на 73,6% (р<0,05) и 70,7% (р<0,05), соответственно. Коричная кислота и диосмин также оказывали действие на данный параметр, снижая степень образования гомоцистеина на 62,1% (р<0,05) и 43,8% (р<0,05) (табл.1).
Результаты биохимических тестов в условиях фокальной ишемии головного мозга могут свидетельствовать о положительном влиянии исследуемых соединений на энергообмен головного мозга, который имеет важное значение в терапии постинсультных состояний [11]. Также, опираясь на экспериментальные данные, можно предполагать, что флавоноиды, а также производные фенилпропано-идов могут улучшать когнитивные процессы в головном мозге.
Выводы
1. При воспроизведении фокальной ишемии головного мозга наблюдается некроз мозговой ткани у крыс (52,38% (р<0,05)), отек (15,3% (р<0,05)), а также когнитивные нарушения, подтвержденные в тестах УРПИ и ТЭИ, которые проводились после операции. Отмечено ухудшение энергообмена и метаболизма головного мозга, о чем свидетельствует увеличение уровня лактата, пирувата и гомоци-стеина (176,85% (р<0,05), 99,9% (р<0,05) и 352,2% (р<0,05), соответственно).
2. Коричная кислота уменьшала степень образования лактата на 128,24% (р<0,05) в сравнении с группой крыс НК, тогда как другие соединения влияли на данный показатель примерно в 4 раза ниже. Относительно группы крыс НК все исследуемые соединения уменьшали уровень пирувата в крови, но наибольший эффект оказали диосмин (117,23% (р<0,05)) и сорбиновая кислота (92,2% (р<0,05)). На уровень гомоцистеина в наибольшей степени повлияли теофлавин и сорбиновая кислота, снижая степень его образования на 73,6% (р<0,05) и 70,7% (р<0,05), соответственно. Максимальное уменьшение степени некроза головного мозга вызывало введение крысам сорбиновой кислоты (52,66% (р<0,05) и диосмина (50,3% (р<0,05).
3. В тесте УРПИ коричная кислота (84,4% (р<0,05), сорбиновая кислота (78,7% (р<0,05), ди-осмин (74,5% (р<0,05), теофлавин (56,6% (р<0,05)
превзошли Мексидол, увеличивая время латентного захода в темный отсек в сравнении с группой крыс, которая получала референтный препарат. В ТЭИ при введении сорбиновой кислоты (281,3% (р<0,05), теофлавина (81,8% (р<0,05), и диосмина (25,4% (р<0,05), наблюдали уменьшение времени латентного подныривания крыс относительно группы, получавшей Мексидол. В биохимических тестах было отмечено, что введение животным коричной кислоты в большей степени, чем введение Мексидола, способствовало снижению концентрации лактата в крови (на 96,2% (р<0,05) относительно группы крыс, получавшей Мексидол). Диосмин (26,5% (р<0,05)) и сорбиновая кислота (11,95% (р<0,05)) превосходили Мексидол, уменьшая уровень образования пирувата. При сравнении активности исследуемых веществ с референтным препаратом статистически значимых отличий не отмечено.
Литература
1. Aye M.M., AungH.T, Sein M.M., Armijos C. A Review on the Phyto-chemistry, Medicinal Properties and Pharmacological Activities of 15 Selected Myanmar Medicinal Plants. Molecules. 2019. V.24. No. 2. DOI: 10.3390/ molecules24020293.e
2. Luo Y, Cui H.X., Jia A., Jia S.S., Yuan K. The Protective Effect of the TotalFlavonoids of Abelmoschus esculentus L. Flowers on Transient Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury Is due to Activation of the Nf2ARE Pathway. OxidMed CellLongev. — 2018. V.2018, Article ID 8987173, 11 pages. DOI: 10.1155/2018/8987173.
3. Ren Z., Zhang R., Li Y, Li Y., Yang Z, Yang H. Ferulic acid exerts neuroprotective effects against cerebral ischemia/reperfusion-induced injury via antioxidant and anti-apoptotic mechanisms in vitro and in vivo. Int JMolMed. — 2017. V.406 No.5. P.1444-1456. DOI: 10.3892/ ijmm.2017.3127.
4. Wiesmann M., Nikoubashman O. Insult — Stroke. Dtsch Med Wochenschr. 2019. V.144. No. 2. Р. 93-100. DOI: 10.1055/s-0043-109378.
5. Катаева Н.Г., Корнетов НА, Караваева Е.В., Чистякова ВА, Елисеева А.М., Когнитивные нарушения после инсульта. Неврология, нейропсихиатрия, психосоматика. 2010. T.1. C. 37-41. DOI: 10.14412/2074-2711-2010-68.
6. Voronkov A.V., Pozdmakov D.I. Endothelotropic activity of 4-hydroxy-3, 5-di-tret-butylcinnamic acid in the conditions of experimental cerebral ischemia / Research Result: Pharmacology and Clinical Pharmacology. 2018. V.4. No.2. Р. 1-10. DOI: 10.3897/rrpharmacology.4.26519.
7. Воронков А.В., Поздняков Д.И., Мамлеев А.В. Изучение вазодилатирующей и антитромботичекой функций эндотелия мозговых сосудов на различных моделях его ишемического повреждения. Современные проблемы науки и образования. 2015. № 5.
8. Воронков А.В., Абаев В.Т., Оганесян Э.Т., Поздняков Д.И. Некоторые аспекты церебропротекторной активности 4-гидрокси-3,5-ди-третбутил коричной кислоты при ишемическом повреждении головного мозга в эксперименте // Медицинский Вестник Северного Кавказа.
- 2018. -Т.13, №1.1. - С.90-93. DOI: htps://doi.org/10.14300/ mnnc.2018.13025.
9. Назарова Л.Е., Дьякова И.Н. Влияние кислоты феруловой на зону
некроза, возникающего в результате окклюзии средней мозговой артерии / Медицинский вестник Башкортостана.
10. Lambertsen K.L., Finsen B., Clausen B.H. Post-stroke inflammation-target or tool for therapy ? / Acta Neuropathologica. 2018. Р.1-22. DOI: 10.1007/s00401-018-1930-z
11. Goodwin M.L., Harris J.E., Hernandez A., Gladden L.B. Blood lactate measurements and analysis during exercise: a guide for clinicians // Journal of Diabetes Science and Technology. — 2007. — Vol.1, №4. — Р. 558-69.
В01:10.1177/193229680700100414.
12. Федин А.И., Тютюмоеа Е.А., Ъадалян К.Р. Ишемический каскад в остром периоде инсульта и способы его фармакологической коррекции // Фарматека. - 2017. - Т. 9, №342. - С. 99-104.
