CC BY
99
УДК 639.3.091: 615
Изучение токсичности ципрофлоксацина в опытах на сеголетках карпа
М.Н. Гончарова, Л.И. Грищенко, ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»
Ключевые слова: бактериальные болезни, рыбы, токсичность, ципрофлоксацин
Сокращения: ДВ — действующее вещество, МТ — масса тела
Введение
Введение ципрофлоксацина из группы фторхиноло-нов в арсенал средств борьбы с бактериальными болезнями рыб способно значительно повысить эффективность лечения, т. к. грамотрицательные бактериальные патогены рыб характеризуются высокой чувствительностью к данному препарату [4, 5]. Ципрофлоксацин, как и другие фторхинолоны, считают относительно малотоксичным соединением и, кроме того, он хорошо переносится теплокровными животными [3].
Цель исследования
Изучить токсичность ципрофлоксацина на рыбах как пойкилотермных животных и определить безопасность его применения для лечения болезней рыб.
Материалы и методы
Токсическое действие препарата изучали на сеголетках карпа МТ 17...20 г в острых опытах при температуре воды 20 0С. Сеголеткам внутрибрюшинно и перорально вводили ципрофлоксацин, содержащий 100 % ДВ.
При внутрибрюшинной инокуляции препарат растворяли в водопроводной кипяченой воде и вводили однократно в дозах по ДВ: 200, 500, 1000, 1500 мг/кг МТ рыб. Контрольным рыбам инъецировали водопроводную кипяченую воду без препарата.
При пероральном введении препарат сначала растворяли в воде при нагревании, затем добавляли 2%-й крахмальный клейстер. Полученную суспензию вводили через зонд с помощью шприца в дозах по ДВ: 1000, 2000, 2500, 3000 мг/кг МТ. Каждую дозу вводили 1 раз в сутки 3 дня подряд. Контрольные рыбы получали 2%-й крахмальный клейстер. Длительность опытов составляла 6 суток.
Результаты опытов оценивали по летальности, клиническому проявлению интоксикации, а также по данным гематологического и патоморфологического исследований. Изменения картины крови карпов оценивали общепринятыми методами [1, 2]. Для гистологических исследований от погибших и вынужденно убитых рыб с ярко выраженными признаками отравления, условно здоровых и контрольных рыб брали печень, почки, селезенку, кишечник, сердце, которые фиксировали 5.10%-м раствором нейтрального формалина. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятой методике.
Результаты и обсуждение
Внутрибрюшинное введение. При введении препарата в дозах 200 и 500 мг/кг МТ клинические признаки не развивались, рыбы не погибали. Признаки токсикоза при дозах 1000.1500 мг/кг МТ проявлялись нарушением координации движения рыб (плавание на боку, переворачивание, потеря равновесия) и судорожными подергиваниями хвостового стебля. Гибель наступала через 2.24 ч. При вскрытии у погибших рыб (дозы 1000.1500 мг/кг МТ) обнаруживали на серозных оболочках внутренних органов зернистый налет серо-белого цвета, застойную гиперемию в печени и почках, переполнение кровянистой пенистой жидкостью и истончение стенки кишечника. У этих рыб были резко выражены анемия, нейт-рофилия, лейкоцитоз, отмечали умеренную лимфо-цитопению. Содержание эритроцитов и гемоглобина были снижены примерно в 2 раза. Количество лейкоцитов находилось в прямой зависимости от дозы препарата. Нейтрофилия проявлялась увеличением процента нейтрофилов за счет миелоцитов (в 5,6...6,5 раза), палочкоядерных (в 10.11,3 раза). При дозах 200 и 500 мг/кг МТ отмечено только увеличение процента нейтрофилов (в 2,3...3,5 раза), а остальные гематологические показатели отличались от нормы незначительно.
Патологических изменений клеток крови в 1-й группе (200 мг/кг МТ) не выявлено. Во 2-й группе (500 мг/кг МТ) отмечено появление набухших эритроцитов с извилистой оболочкой, а также полихро-матофильных (незрелых) деформированных эритроцитов. Наиболее выраженные изменения обнаружены у рыб 3-й и 4-й групп (1000.1500 мг/кг МТ): ги-похромазия, анизоцитоз, пойкилоцитоз, набухание, деформация и вакуолизация ядер эритроцитов, деформация моноцитов и разрушение нейтрофилов (рис. 1, 2).
Гистологическая картина не отличалась от контроля только при дозе 200 мг/кг МТ. При дозе 500 мг/кг МТ ткань селезенки, поджелудочной железы и кишечника была в норме. В печени встречались клетки с вакуолизированной цитоплазмой и кариопикно-зом. В почках обнаружены участки отслоения эпителия канальцев с уменьшением и уплотнением ядер в его клетках.
При действии дозы 1000 мг/кг МТ обнаружены сходные изменения в печени: сглаживание границ и уменьшение размера клеток, зернистая дистрофия, единичные участки с вакуолизацией цитоплазмы печеночных клеток. В почках в отдельных группах канальцев ослаблена окраска ядер эпителия, в некоторых клетках встречался кариопик-ноз. Кишечник практически не отличался от нормы.
РВЖ • СХЖ • № 1/2012
Изучение токсичности ципрофлоксацина в опытах на сеголетках карпа
Рис. 1. Кровь карпа. Анизоцитоз, пойкилоцитоз, гипохромазия эритроцитов карпа (доза 1000 мг/кг МТ). Окраска по Романовс-кому-Гимзе, об. х90 Ок. х10
На основании проведенных исследований определены параметры токсичности ципрофлоксацина при внутрибрюшинном введении: недействующая доза составила 200 мг/кг МТ; максимально переносимая (ЛДо) 500 мг/кг МТ; абсолютная летальная доза (ЛДюо) 1500 мг/кг МТ; расчетная средняя летальная доза (ЛД50) составила 950 мг/кг.
Пероральное введение. В 1-й группе (доза 1000 мг/кг МТ) клинические признаки и гибель рыб не отмечены в течение всего периода наблюдения.
Во 2-й группе (2000 мг/кг МТ) через 1 сутки у 33 % рыб наблюдали небольшое нарушение координации движения (покачивание при плавании) и отсутствие аппетита. Через 3 суток симптомы отравления исчезли, рыбы начали брать корм.
Выраженные признаки токсикоза проявлялись в
3-й и 4-й группах после введения препарата в дозах 2500 и 3000 мг/кг МТ. Через несколько часов после третьего введения дозы 2500 мг/кг МТ у 66,7 % рыб периоды возбуждения сменялись угнетением (отсутствием реакции на внешние раздражители); отмечено нарушение координации движения (переворачивание на бок, вверх брюшком). Через 1 сутки все заболевшие рыбы погибли (гибель составила 66,7 %).
После 1-го введения максимальной дозы 3000 мг/кг МТ через 1 сутки наступила частичная гибель рыб, у которых были заметны кровоизлияния в глазных яблоках и неравномерная окраска жаберной ткани. Оставшиеся рыбы погибли через несколько часов после третьего введения препарата. При их
Рис. 2. Кровь карпа. Норма, эритроциты без изменений. Окраска по Романовскому-Гимзе, об. 90х Ок. 10х
вскрытии обнаруживали белый зернистый налет под серозными оболочками внутренних органов в передней части брюшной полости. У всех погибших рыб
3-й и 4-й групп кишечник был заполнен густым белым творожистым содержимым.
При исследовании крови наиболее выраженные изменения выявлены в 3-й и 4-й группах анемия, нейт-рофилия и лимфоцитопения (табл.). Выраженная анемия характеризовалась снижением количества эритроцитов на 48,2 % в 3-й группе и на 36,6 % в
4-й группе по сравнению с контролем. Количество гемоглобина в 3-й группе было уменьшено на 43,9 % против 19 % в 4-й группе. Сходными изменениями для обеих групп можно считать небольшой моноци-тоз, а также увеличение процента нейтрофилов за счет миелоцитов в 13,4 раза в 3-й группе и в 12,5 раз в 4-й группе, а за счет палочкоядерных в 6,7 и 6,1 раза соответственно.
Качественные изменения клеток крови обнаружены только в группе с максимальной дозой введения (3000 мг/кг МТ) — анизоцитоз, набухание эритроцитов, темные включения в их цитоплазме, ги-похромазия, деформация нейтрофилов, наличие раздвоенных ядер в миелоцитах. В этих же группах наиболее выражены патоморфологические изменения.
Гистологическими исследованиями в печени при дозе 3000 мг/кг МТ установлены выраженная вакуольная и зернистая дистрофии, очаговый некроз клеток. При дозе 2500 мг/кг МТ выявлялась в основном вакуольная дистрофия, сглаживание границ кле-
Гематологические показатели сеголеток карпа при пероральном введении ципрофлоксацина (п = 8)
Группа Дозы, Гемоглобин, Эритроциты, Лейкоциты, Нейтрофилы,% Моноциты, Лимфоциты,
мг/кг г % млн./мкл тыс./мкл Миелоциты Палочко-ядерные Сегменто-ядерыне % %
3-я 2500 4,5±0,38 0,58±0,012 16,0±2,31* 14,5±2,11 3,0±0,15 1,0±0,12* 2,6±0,2 81,5±5,37
4-я 3000 6,5±0,76* 0,71±0,012 18,0±2,17* 13,75±1,236 2,75±0,305 0,75±0,018* 3,0±0,44 79,75±8,356
5-я (контроль) - 8,02±0,843 1,12±0,045 18,2±0,91 0,75±0,023 0,45±0,013 0,62±0,074 0,88±0,076 97,3±6,12
* различия с контролем не достоверны (р > 0,05).
М.Н. Гончарова, Л.И. Грищенко
Рис. 3. Очаговые кровоизлияния в верхушках складок переднего отдела кишечника карпа (доза 3000 мг/кг МТ). Окраска гематоксилином и эозином, об. х10, ок. х10
ток и кариопикноз в отдельных печеночных клетках. В почках в обеих группах рыб отмечены признаки нефроза (кариопикноз в эпителии отдельных канальцев), приводящего к деструкции канальцев, а в
4-й группе и отслоение эпителия в канальцах, в некоторых из них — вакуольная дистрофия эпителиальных клеток.
В переднем отделе кишечника в 3-й группе существенных изменений не было, покровный эпителий не изменен, обнаружены только очажки гиперхрома-тоза в отдельных группах эпителия. В 4-й группе в переднем отделе кишечника отмечены очаговые кровоизлияния в верхушки складок, очаговая десквама-ция и некроз эпителия, а в среднем отделе — застойная гиперемия в основании складок и подслизистой оболочке, очаговая десквамация эпителия на верхушках складок, распад слущенного эпителия, кариопик-ноз и кариорексис в клетках толщи складок (рис. 3, 4).
Рис. 4. Распад слущенного эпителия складок среднего отдела кишечника карпа (доза 3000 мг/кг МТ). Окраска гематоксилином и эозином, об. х40, ок. х10
В поджелудочной железе заметна очаговая дистрофия зимоцитов.
В 1-й и 2-й группах гематологические показатели не отличались от контроля, а при гистологическом исследовании изменений в кишечнике, печени и почках не обнаружено.
Параметры токсичности ципрофлоксацина при данном способе введения составили: максимальная переносимая доза (ЛД0) 2000 мг/кг МТ; абсолютная летальная доза (ЛД100) 3000 мг/кг МТ; расчетная средняя летальная доза (ЛД50) 2417 мг/кг МТ.
Выводы
Ципрофлоксацин относится к малотоксичным веществам (4-у классу) и в терапевтических дозах безопасен для рыб. Максимально переносимая доза ципрофлок-сацина при пероральном и внутрибрюшинном применении превышала терапевтические в 20.100 раз.
Библиография
1. Житенева Л.Д, Полтавцева Т.Г., Рудницкая О.А. Атлас нормальных и патологически измененных клеток крови рыб. — Ростов н/Д: Кн. изд-во, 1989.
2. Иванова Н.Т. Атлас клеток крови рыб (сравнительная морфология и классификация форменных элементов крови рыб). — М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1983.
3. Падейская Е.Н., Яковлев В.П. Фторхинолоны. — М.: Биоин-форм, 1995.
4. Nouws J.F.M., Grondel J.L., Schutte A.R., Laurensen J. Pharmacokinetics of ciprofloxacin in carp, African catfish and rainbow trout // The Veterinary Quarterly, 1988; 10 (3): 211—216.
5. Palmer R., Kawai K., Kusuda R. In vitro activity of quinolone antibacterials against selected fish pathogens // Fish Pathol., 1992; 27 (3): 131—142.
Summary
M.N. Goncharova, L.I. Grischenko. Study of ciprofloxacin’s toxicity in experiments at the carp. For the study of ciprofloxacin’s toxicity were used segoletkah carp. Following the introduction of LD50 in amounts of 950 mg/kg when administered 2417 mg/kg. The highest tolerated doses when both ways of introduction of 20.100 times larger than therapeutic. These studies have shown that ciprofloxacin can be classified as a low-toxic substance for fish.
РВЖ • СХЖ • № 1/2012
