CC BY
110
УДК615.9:546.46:547.466.6:616-092.4
ИЗУЧЕНИЕ ТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ СУБСТАНЦИИ МАГНИЯ L-АСПАРАГИНАТА С ПИРИДОКСИНОМ ПРИ ОДНОКРАТНОМ ВНУТРИЖЕЛУДОЧНОМ ВВЕДЕНИИ
МЫШАМ И КРЫСАМ
А. А. Спасов, Л. И. Бугаева, С. А. Лебедева, А. Ю. Гетманенко,
Е. А. Кузубова, М. К. Синолицкий, И. Н. Иежица
Волгоградский государственный медицинский университет, кафедра фармакологии и биофармации ФУВ, кафедра фармакологии, Научно-исследовательский институт фармакологии
В экспериментах на лабораторных мышах и крысах установлено, что субстанция магния L-аспарагината с пири-доксином относится к классу малотоксичных. Границы ЛД50 субстанции магния L-аспарагината с пиридоксином при внутрижелудочном введении мышам составляют 9 773 (7366,6 12965,5) мг/кг у самцов и 9 541 (7691,8 ^ 11835,5) мг/кг
у самок; границы ЛД50 субстанции магния L-аспарагината с пиридоксином при внутрижелудочном введении крысам составляют более 8000 мг/кг В клинике отравления отмечены эффекты депривации ЦНС: седация, снижение подвижности и рефлекторных реакций на звуковые, тактильные и болевые раздражители.
Ключевые слова: магния L-аспарагинат, витамин В6, лекарственная безопасность, доклинические исследования, острая токсичность, ЛД50.
STUDY OF TOXIC PROPERTIES OF MAGNESIUM L-ASPARTATE AND PYRIDOXINE FOLLOWING A SINGLE INTRAGASTRIC DOSE
TO MICE AND RATS
A. A. Spasov, L. I. Bugaeva, S. A. Lebedeva, A. Yu. Getmanenko,
E. A. Kuzubova, M. K. Sinolitskiy, I. N. Iezhitsa
Studies on mice and rats have shown that magnesium L-aspartate and pyridoxine belong to substances and preparations presenting a relative low toxicity risk The LD50 value for magnesium L-aspartate and pyridoxine following intragastric administration in mice was 9773 (7366,6 ^ 12965,5) mg/kg in males, and 9541 (7691,8 ^ 11835,5) mg/kg in females. The LD50 value for magnesium L-aspartate and pyridoxine following intragastric administration in rats was more than 8000 mg/kg. Experimental magnesium L-aspartate and pyridoxine intoxication revealed deprivation of the CNS, sedation, decreased mobility, hyporeflexia to acoustic, tactile, and pain stimuli.
Key words: magnesium L-aspartate, vitamin B6, drug safety, preclinical studies, acute toxicity, LD50.
Важнейшее физиологическое значение магния определяется его ролью в жизнедеятельности организма. Являясь одним из наиболее распространенных катионов внутри клетки, магний играет роль кофактора множества ферментов и участвует практически во всех видах обмена веществ (Seelig M. S., 1980 [20]; Gunther T., 1993 [15]; Altura B. M., 1994 [12]; Спасов А. А. с соавт, 2000 [8]; Maier J. A., 2004 [18]; Скальный А. В., 2004 [7]; Rayssiguier Y., 2005 [19]; Kimura M., 2007 [16]; Durlach J., 2007 [13]). Магний поступает в организм с водой и пищей, а также в составе фармакологических средств, что используется в основном для восполнения недостаточности этого элемента.
В клинической практике применяется относительно небольшое число препаратов магния. В частности, отечественный препарат магния сульфат широко используется в акушерской и гинекологической практике, а также кардиологии, реаниматологии, гастроэнтерологии. Препарат применяется преимущественно в лекарственной форме для парентерального введения [1, 2, 11]. В высоких дозах под действием сульфата магния наблюдаются эффекты депривации ЦНС, гипохлоремичес-
кий алкалоз [20]. Другой отечественный препарат—магния оксид — обладает низкой биодоступностью и используется перорально в качестве антацидного средства [14, 17]. Препараты органических солей магния: магния оротат, магния лактат, магния аспарагинат — также применяются перорально по различным показаниям (заболевания сердца, дислипидемии, судороги, депрессия), обладают умеренной биодоступностью, но при этом возможно их синергичное применение в сочетании с веществами, повышающими биодоступность магния, например, с пиридоксином (витамином В6). Комбинированная форма соли магния с пиридоксином зарубежного производства — препарат «МагнеВ6» — разрешена для применения в России. Вместе с тем высокая стоимость препарата ограничивает широкое его использование в клинической практике, что послужило предпосылкой к поиску отечественного аналога. В этом отношении представляют интерес совместные научные разработки химиков-синтетиков ЗАО «Биоамид» (г Саратов) и фармакологов ВолгГМУ По результатам данных работ было выявлено высокоактивное вещество — магния L-аспарагинат в комбинации с пиридоксином,
Выпуск 2 (54). 2015
105
обладающее хорошей биодоступностью [9, 10]. В настоящее время проводятся доклинические токсикологические исследования данного вещества, с целью оценки его безопасности и перспективности внедрения в клиническую практику.
В этой связи в настоящей работе сочли целесообразным исследовать токсические свойства данной комбинации при однократном пероральном введении лабораторным животным.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучение острой токсичности и определение ЛД_0 субстанции магния L-аспарагинат в комбинации с пири-доксином при однократном внутрижелудочном введении мышам и крысам.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование проводилось на половозрелых лабораторных животных обоего пола: 120 белых мышах массой 18—22 г и 100 белых крысах массой 190—230 г, полученных из питомника государственного предприятия НИИ гигиены токсикологии и профпатологии МЗ РФ г Волгограда. Эксперименты проводились согласно методическим рекомендациям по доклиническому изучению новых фармакологических веществ [3, 4]. При проведении экспериментов учитывались «Принципы надлежащей лабораторной практики» (ГОСТ Р-53434-2009) и правила, принятые Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). До начала эксперимента животные в течение двух недель находились на карантине, а в последующем распределялись по группам для проведения исследований. В каждую группу входило не менее 5 особей самок и самцов.
Субстанцию магния L-аспарагината с пиридокси-ном растворяли в дистиллированной воде на магнитной мешалке с подогревом и вводили опытным группам животных атравматическим металлическим зондом в возрастающих дозах: мышам—5000; 7500; 10000; 12500 и 15000 мг/кг, крысам — 2000; 4000; 6000 и 8000 мг/кг. Были сформированы также контрольные группы самцов и самок мышей и крыс, которым интрагастрально вводили дистиллированную воду в объеме 20 мл/кг (эквивалентно объему, использованному для растворения вещества, вводимого опытным группам).
После введения испытуемой субстанции мышей и крыс по одной особи помещали на 24 часа в изолированные плексигласовые домики для наблюдений /150 х 250 х 150 мм/. В первые восемь часов от момента введения субстанции наблюдения за животными вели непрерывно, в дальнейшем — периодически; при этом животные были лишены пищи и воды и изолированы от внешних раздражителей. В последующий 2-недельный период наблюдения за животными проводились 2 раза в день. На вторые сутки выживших животных объединяли по группам и разме-
щали в стандартные пластиковые клетки, предназначенные для мышей и крыс (самцов и самок раздельно), со свободным доступом к воде и пище.
В период наблюдений отмечали наличие гибели животных в группах, а также оценивали общее состояние (шерстный покров, слизистые оболочки, масса тела), поведенческие и нервно-мышечные (судороги, тремор, подергивания, изменение положения тела и конечностей, рефлекторный ответ на звуковые, тактильные и болевые раздражители) и вегетативные реакции (зрачковый рефлекс, цвет кожи, наличие ури-наций, дефекаций, саливаций). Пищевая и питьевая активность оценивалась визуально. Массу тела у животных измеряли в 1 день эксперимента, на 7 и 14 дни. По количеству погибших и выживших особей были рассчитаны границы ЛД_0 исследуемой субстанции с применением метода Литчфилда и Уилкок-сона [3, 4]. Статистический анализ динамики массы тела у животных выполняли с использованием t-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
По результатам исследований на мышах были отмечены характерные признаки клиники отравления субстанцией магния L-аспарагината с пиридоксином и последующей реабилитации. У животных, получавших токсические дозы субстанции, наблюдалось угнетение подвижности, прогрессирующая седация, повышение частоты актов дефекации, снижение реакций на звуковые, тактильные и болевые раздражители, боковое положение. Продолжительность указанных эффектов и их выраженность зависела от дозы субстанции, введенной мышам. Так, после введения субстанции в дозах от 5000 до 7500 мг/кг признаки угнетения подвижности и развитие седации у мышей фиксировались в интервале от 5 до 10 мин после ин-трагастрального введения исследуемой субстанции и наблюдались в течение последующих 60—120 мин. Гибель части особей отмечалась в интервале 90—120 мин наблюдений (табл. 1). Признаки реабилитации у оставшихся в живых особей наблюдались еще в течение последующих двух часов. Наблюдения за выжившими животными в течение последующих двух недель не позволили зафиксировать значимых различий в состоянии животных в опытных и контрольных группах. Отдаленной гибели у этих животных не отмечалось. Общее состояние опытных животных, пищевая и питьевая активности визуально также не различались с данными показателями в контрольной группе.
После введения мышам субстанции магния L-аспарагината с пиридоксином в дозах 10000 мг/кг и выше развитие вышеуказанных симптомов наблюдалось в течение 5 мин. Продолжительность эффектов составляла 60—120 мин с момента введения. Отмечалось резкое снижение подвижности, седация, боковое положение, угнетение дыхания, болевой и
106
Выпуск 2 (54). 2015
тактильной чувствительности, бледность кожных покровов, редкие тонические судороги. Гибель мышей фиксировалась в течение первого часа наблюдений. У оставшихся в живых мышей восстановление подвижности, чувствительности, дыхания отмечалась в течение последующих 2—3 часов. По окончании первых суток наблюдения состояние этих животных практически соответствовало группе контрольных мышей. По результатам наблюдений за этими животными в последующие две недели не выявлено значимых различий с контролем по общему состоянию и приросту массы тела.
По результатам гибели животных, представленным в табл. 1, выявлены несущественные гендерные различия в динамике гибели мышей, фиксируемые лишь при введении испытуемой субстанции в дозе 15000 мг/кг При этом 100 % гибель отмечалась у самок мышей, тогда как у самцов аналогичной группы количество погибших составило 80 %. Учитывая количество особей, погибших в первые сутки (в последующие сутки наблюдений летальных эффектов в группах не отмечено), был проведен расчет границ ЛД_0 [3, 4]. Результаты расчетов представлены в табл. 2, из которых следует, что границы ЛД_0 исследуемой субстанции при пероральном введении мышам составляют: 9773 мг/кг у самцов и 9541 мг/кг — у самок.
Таблица 1
Г ибель мышей в экспериментах по изучению острой токсичности субстанции магния L-аспарагината с пиридоксином
Число погибших мышей/число в г руппе
доза, мг/кг самцы доза, мг/кг самки
5000,0 0/5 5000,0 0/5
7500,0 1/5 7500,0 1/5
10000,0 3/5 10000,0 3/5
12500,0 4/5 12500,0 4/5
15000,0 4/5 15000,0 5/5
Примечание. Группы контрольных животных в таблицу не внесены.
Ориентируясь на классификацию И. В. Саноц-кого [5, 6] и результаты гибели мышей заключили, что субстанция магния L-аспарагината в комбинации с пиридоксином при внутрижелудочном введении мышам может быть отнесена к классу малотоксичных ксенобиотиков.
В исследованиях на крысах субстанцию магния L-аспарагината с пиридоксином вводили также внутрижелудочно в токсических дозах от 6000 мг/кг до 8000 мг/кг. Введение субстанции в более высоких дозах не проводилось в связи с превышением максимально допустимого объема для внутрижелудочного введения животным, установленного действующими рекомендациями [3, 4]. По результатам экспериментов установлено отсутствие гибели животных при вве-
дении магния L-аспарагината с пиридоксином в указанных дозах. В связи с отсутствием гибели крыс границы токсичности исследуемой субстанции были рассчитаны по максимально введенной дозе, что также допускается действующими рекомендациями [3, 4]. При этом по результатам частичной выборочной эвтаназии животных, проведенной на вторые сутки эксперимента и обследования у них различных отделов желудочно-кишечного тракта (желудка, двенадцатиперстной кишки, тонкого и толстого кишечника) наличия остатков исследуемой субстанции не обнаружено, что свидетельствует о ее полной всасываемости из ЖКТ. Не обнаружено также в этих отделах и следов гиперемии, отека и повреждения слизистой.
Клиника отравления испытуемой субстанцией соответствовала таковой, выявленной на мышах. При этом наиболее отчетливо симптомы отравления проявлялись у крыс при введении субстанции в максимальной дозе 8000 мг/кг. Характерным являлось: понижение двигательной активности, угнетение реакций на звуковые, тактильные и болевые раздражители, угнетение дыхания, слабый тремор конечностей. Бокового положения у крыс не зафиксировано, гибель особей отсутствовала. Указанные эффекты у животных отмечались через 10—15 мин и продолжались в первые 2—3 часа наблюдений. Период полной реабилитации и восстановления физической активности у крыс фиксировали в течение первых суток наблюдений. На вторые сутки состояние животных было удовлетворительным, слизистые — чистые, шерстный покров — гладкий, блестящий. Восстанавливались частота дыхания, подвижность и реакции на внешние раздражители. Пищевая и питьевая активности визуально не различались с контролем.
На 7-е и 15-е дни эксперимента отмечалась положительная динамика прироста массы тела крыс, получавших субстанцию магния L-аспарагината с пиридоксином, не отличавшаяся от контрольной группы.
Установлено, что ЛД^ субстанции магния L-аспа-рагината с пиридоксином при внутрижелудочном введении крысам составляет более 8000 мг/кг.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
По результатам проведенных исследований можно заключить, что субстанции магния L-аспарагината с пиридоксином при введении внутрижелудочно мышам и крысам относится к малотоксичным соединениям. На основании представленных данных были рассчитаны различные границы летальности субстанции, введенной внутрижелудочно мышам-самкам и самцам. Установлено, что уровень ЛД_0 субстанции магния L-аспара-гината с пиридоксином составил для мышей-самцов 9 773 (7366,6 - 12965,5) мг/кг, для самок 9 541 (7691,8 -11835,5) мг/кг. Значение ЛД_0 магния L-аспарагината с пиридоксином при внутрижелудочном введении крысам в максимально растворимом объеме составило более 8000 мг/кг (табл. 2).
Выпуск 2 (54). 2015
107
Таблица 2
Острая токсичность субстанции магния L-аспарагината с пиридоксином в экспериментах на мышах и крысах, мг/кг
Исследуемая группа ЛД50
Опыты на мышах
Самцы 9 773 (7366,6 Ч12965,5)
Самки 9 541 (7691,8 Ч 11835,5)
Опыты на крысах
Самцы > 8000
Самки > 8000
В клинике отравления исследуемой субстанцией отмечены характерные симптомы острого отравления солями магния: элементы угнетающего влияния на ЦНС (седация, нарушение подвижности, угнетение рефлекторных ответов на внешние раздражители). Психоугнетающие эффекты у животных наблюдались через 10— 20 мин после введения субстанции, нивелирование данных проявлений прослеживалось в течение первых суток наблюдений. Состояние этих животных на вторые и последующие сутки двухнедельных наблюдений соответствовало таковому в контроле. При этом по окончании наблюдений различий у животных в группах контроль и опыт по параметрам общего состояния, пищевой активности, подвижности и приросту массы тела не обнаружено. Случаев отдаленной гибели у животных не отмечено. Следует отметить быстрое наступление и столь же быстрое прекращение вышеуказанных эффектов, позволяющее сделать предположение о быстром всасывании исследуемой субстанции из ЖКТ, что, в свою очередь, может быть объяснено ее возможной высокой биодоступностью.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гоомова О. А., Серов В. Н., Торшин И. Ю. Магний в акушерстве и гинекологии: история применения и современные взгляды // Трудный пациент — 2008. — № 8. — С. 10—15.
2. Магния сульфат в анестезиологии и интенсивной терапии. Часть 2. Применение магния сульфата в интенсивной терапии / И. В. Молчанов, М. Г. Жильцов, Д. Ю. Ретинский // Клиническая анестезиология и реаниматология — 2008. — Т 5, № 3 — С. 14—19.
3. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, Москва (2000)
4. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, Москва (2005)
5. Саноцкий И. В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ. (Токсикометрия). — М.: Медицина, 1970. — 343 с.
6. Саноцкий И. В., Уланова И. П. Критерии вредности в гигиене и токсикологии при оценке опасности химических соединений. — М.: Медицина, 1975. — 327 с.
7. Скальный, А. В. Магний. Энергия жизни, уверенность, сила / А. В. Скальный. — М.: МедЭкспертПресс, 2004. — 102 с.
8. Спасов, А. А. Магний в медицинской практике (монография) / А. А. Спасов. — Волгоград: ООО Отрок, 2000. — 272 с.
9. Сравнительная биодоступность некоторых органических солей магния и магнийсодержащих препаратов в условиях алиментарной гипомагнезиемии / И. Н. Ие-жица, М. С. Кравченко, М. В. Харитонова, А. А. Озеров // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета — 2007. — № 4 (24). —С. 14—26.
10. Сравнительное изучение острой токсичности органических солей магния / А. А. Спасов, Л. И. Бугаева, И. Н. Иежица, М. С. Кравченко, С. А. Лебедева, А. А. Озеров // Микроэлементы в медицине. — 2007 — № 8 (1). — С. 2—4.
11. Чекман И. С. Магний в медицине / И. С. Чекман, Н. А. Горчаков, С. Л. Николай. — Кишинев: Штиница, 1992. — 102 с.
12. Altura, B. M. Importance of magnesium in physiology and medicine and the need for ion selective electrodes / B. M. Altura // Scand. J. Clin. Invest. — 1994. — Vol. 217. — P 5—9.
13. Durlach, J. Overview of Magnesium research: History and Current Trends / J. Durlach // New perspectives in magnesium research: nutrition and health. Y Nishizawa, H. Morii, J. Durlach (eds.). — London: Springer-Verlag, 2007. — P 3—10.
14. Firoz M., Graber M. / Bioavailability of US commercial magnesium preparations // Magnesium Research — 2001. — Vol.14 (4) — Р 257—262.
15. Gunther T. Mechanisms and regulation of Mg2+ efflux and Mg2+ influx / Miner. Electrolyte Metab. — 1993. — Vol. 19(4—5) — Р 259—265.
16. Kimura M. Overview of Magnesium Nutrition. In: International Magnesium Symposium. New Perspectives in Magnesium Research. London: Springer-Verlag — 2007. — Р 239—260.
17. Kiss, Z. Clinical importance and bioavailability of different magnesium salts after oral administration to humans. / Z. Kiss. // Magnes. Res. — 2006. — Vol 19, № 1. — P 72.
18. Maier J. A., Bernardini D., Rayssiguier Y, Mazur A. High concentrations of magnesium modulate vascular endothelial cell behaviour in vitro / Biochim. Biophys. Acta —
2004. — May 24 — Vol. 1689(1) — Р 6—12.
19. Rayssiguier, Y. Magnesium and inflammation: lessons from animal models / Y Rayssiguier, A. Mazur // Clin. Calcium. —
2005. — Vol. 15, № 2. — P 245—248. [in Japanese].
20. Seelig, M. S. Magnesium deficiency in the pathogenesis of disease. early roots of cardiovascular, skeletal and renal abnormalities / M. S. Seelig // L. V. Avioli (ed). — New York, N.Y.: Publ. Plenum Medical Book Co., 1980. — 345 p.
Контактная информация
Спасов Александр Алексеевич — д. м. н., профессор, академик РАН, заслуженный деятель науки РФ, почетный профессор ВолгГМУ зав. кафедрой фармакологии, Волгоградский государственный медицинский университет, e-mail: [email protected]
108
Выпуск 2 (54). 2015
