CC BY
14
УДК: 577.11
Полякова Е.Д., Матишова Д.А, Цепелева И.А., Красноштанова А.А.
ИЗУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ ЛИПОСОМ НА ОСНОВЕ СОЕВГО И ЯИЧНОГО ЛЕЦИТИНА В СРЕДЕ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА
Полякова Екатерина Денисовна, Матишова Дарина Андреевна, Цепелева Ирина Андреевна студентки 3 курса факультета биотехнологии и промышленной экологии;
Красноштанова Алла Альбертовна - доктор химических наук, доцент, профессор кафедры биотехнологии; email: aak28@yandex.ru.
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева», Москва, Россия; 125480, ул. Героев Панфиловцев, дом 20.
В статье исследуется поведение в модели ЖКТ человека липосомальных частиц, полученных тепловым методом из яичного и соевого лецитина. Для изучения липосом применялись турбидиметрия, измерение Z-потенциала, йодного числа.
Ключевые слова: липосомы, лецитин, дзета-потенциал, турбидиметрия, ферментативное расщепление.
RESEARCHING THE METHOD OF OBTAINING LIPOSOMES AND THEIR ABSORPTION IN THE GIT
Poliakova E.D., Matishova D.A., Tsepeleva I.A., Krasnoshtanova A.A.
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russian Federation
The article examines the behavior of liposomal particles obtained by the thermal method from egg and soy lecithin in a model of the GIT. Turbidimetry, measurement of Z-potential, and iodine number were used to study liposomes. Keywords: liposomes, lecithin, zeta potential, turbidimetry, enzymatic digestion.
Липосомы можно охарактеризовать как ассоциированные коллоиды, построенные из амфотерных молекул липидов, которые в водной среде самоорганизуются в сферические замкнутые структуры. Они состоят из одной или нескольких мембран; размер колеблется от 20 нм до нескольких микрометров, тогда как толщина мембран составляет около 4 нм. Липосомы играют важную роль в коллоидной науке как модель мембраны, а также используются в биологических, фармацевтических и медицинских исследованиях, поскольку являются наиболее эффективными носителями для введения многих различных агентов в клетки. Липосомы находят широкое применение в биотехнологии, они интересны благодаря структуре их мембран, аналогичной клеточной мембране. Способность образовывать комплексы с молекулами нуклеиновых кислот также является отличительной для липосом. Липиды, формирующие бислойную мембрану, обеспечивают инкапсулирование молекул ДНК или РНК, а также лекарственных препаратов различной природы, их внутриклеточную доставку и выход из эндосом.
За последние годы достигнуты явные успехи в разработке лекарственных препаратов, особенно в области средств для неотложной помощи. Тем не менее, продолжаются активные исследования, направленные на поиск или создание наночастиц и различных композиций на их основе. Таким образом, получение липосом является актуальным направлением для получения структур адресной доставки лекарственных средств. Липосомы способны к биодеградации, обеспечивают защиту включенных в них соединений от воздействия ферментов, снижению токсического воздействия инкапсулированных веществ, пролонгации их
действия. Актуальность данной работы, таким образом, вызвана неугасающим интересом ученых к поиску новых средств адресной доставки лекарств и исследованию областей применения липосом.
Основным материалом для получения липосом являются фосфолипиды, как правило, природного происхождения. В данной работе, как уже упоминалось, частицы были получены из лецитина, который представляет собой смесь фосфолипидов и триглицеридов с небольшим количеством примесей. Основу для этой группы представляют фосфолипиды - их, как правило, содержится от 65 до 75%. Так как фосфолипиды и растительного, и животного происхождения схожи с человеческими и способны к встраиванию в мембраны, были использованы яичный (животного происхождения) и соевый (растительного происхождения) виды лецитина.
Целью данной работы является получение липосом тепловым методом, а также исследование их поведения в модели желудочно-кишечного тракта человека. Объектом исследования являются липосомы, полученные из яичного и соевого лецитина.
Важным преимуществом липосом как одного из средств доставки лекарств является относительная простота их получения. В литературе описаны различные методы получения липосомальных частиц. Одни из наиболее широко используемых: тепловой, конвекционный, звуковой методы, метод высокого давления, метод растворения и удаления детергента и метод испарения с обращением фаз. В проведенном исследовании липосомы были получены с помощью теплового метода [1].
Использовалась следующая методика: навеску исходного лецитина гомогенизировали в 50 мл дистиллированной воды, чтобы содержание липида в
среде составляло 0.5, 0.75, 1.0, 2.0, 3.0 масс%. Различные концентрации использовались для подбора наилучшей концентрации лецитина. Полученный гомогенат подвергали гидратированию в течение 2 ч. Затем к полученной суспензии добавляли 3.0 об% глицерина и термостатировали 1,5 ч при температуре 65-70°С. По истечение времени термостатирования субстанцию оставляли для формирования липосом на одну неделю. После этого полученные суспензии микроскопировали с увеличением х40, чтобы выявить концентрацию лецитина, при которой в суспензии образовывалось максимальное количество липосомальных частиц. Было выявлено, что наилучшими являются концентрации лецитина равные 1.0 и 3.0 масс%. Дальнейшие эксперименты проводили именно с этими концентрациями.
Затем для получения более однородной по размерам смеси липосом осуществляли их гомогенизацию. На лабораторном гомогенизаторе IKA T25 digital ULTRA-TURRAX® было исследовано наилучшее время проведения процесса. Для этого растворы с содержанием липида 1.0 и 3.0 масс% подвергали гомогенизации в течение 15-120 сек до с интервалом в 15 сек. На каждом этапе гомогенизированные частицы микроскопировали. К частицам предъявлялось следующее требование: после гомогенизации частицы должны быть примерно одинакового размера, ровной округлой формы, равномерно распределены в поле зрения. Таким образом, было установлено, что после 1,5 минут рассматриваемые препараты практически не меняются, соответственно, это время было выбрано как наилучшее. К тому же, было установлено, что наиболее хорошо гомогенизации подвергаются суспензии с содержанием липидов 3 масс%, поэтому дальнейшие исследования проводились с ними. Полученные липосомы были высушены при температуре 50°.
На следующем этапе работы был исследован процесс ферментативного разрушения полученных липосом в ЖКТ, отдельно рассматривались такие отделы как: ротовая полость, желудок и кишечник. Были воспроизведены физиологические условия, соответствующие каждому этапу переваривания (температура, продолжительность, концентрация и активность ферментов, концентрация электролитов, рН). Для ротовой полости использовался фермент амилаза, для отдела желудка - пепсин, для кишечника - трипсин и химотрипсин [2]. Рассмотрим более подробно применённую модель ЖКТ.
Пищеварение представляет собой совокупность химических, физических и механических процессов, главная цель которых является расщепление компонентов пищи на более простые для всасывания и участия в метаболизме. Пищеварительная система человека состоит из ротовой полости, глотки, пищевода, желудка, двенадцатиперстная кишка, тонкого и толстого кишечника.
В ротовой области происходит механическая и химическая обработка пищи. Главным ферментом является а-амилаза, который в свою очередь расщепляет полисахариды до олигосахаридов. Активен в нейтральной среде (pH 6.7 - 7.0).
В желудке белки расщепляются до поли-, олигопептидов разного размера и аминокислоты под действием таких ферментов желудочного сока как, пепсин, гастриксин, желатиназа. Липаза мало активна в желудке, но способна незначительно расщеплять жиры на глицерин и жирные кислоты. Оптимальный pH 1.5 - 2.5.
Заключительный этап переваривания пищи происходит в кишечнике. Сам процесс пищеварения на этом этапе происходит за счет сока поджелудочной железы, желчи и др. Трипсин и химотрипсин расщепляют белки и полипептиды до низкомолекулярных пептидов и аминокислот. Желчь повышает активность панкреатической липазы, эмульгирует жиры, после чего они легче расщепляются, активирует ферменты
поджелудочной железы, а также инактивирует пепсин. Кислотность в разных отделах желудка варьируется от слабощелочной до слабокислой.
Для моделирования процессов, протекающих в пищеварительном тракте, необходимо учитывать большое количество параметров: pH среды, температуру, ферменты и т.д., поэтому был использован Протокол статического метода изучения пищеварения in vitro [2], который включает в себя состав биологических жидкостей, моделирующих слюну (SSF), желудочный (SGF) и кишечные (SIF) соки. Рекомендуемая температура на всех этапах моделирования - 37 0 С.
Моделирование начиналось с подготовки биологических жидкостей для стадий пищеварения, которые готовились согласно протоколу. Концентрацию CaCh для каждой стадии рассчитывали индивидуально и добавляли уже в готовый буферный раствор. Условия моделирования:
• Ротовая полость: SSF, pH 7, 15 минут, фермент амилаза, активность 1500 ед/г;
• Желудок: SGF, pH = 3, 2 часа, фермент пепсин, активность 115000 ед/г;
• Кишечник: SIF, pH = 7, 1 час, фермент трипсин (активность 1801 ед/г) и химотрипсин (активность 1917 ед/г) в соотношении 4:1. Соотношение по весу фермент:субстрат = 1:1000
для всех случаев.
Было проведено две серии экспериментов: 1) параллельный профиль, т.е. исследовали гидролиз отдельно в ротовой полости, желудке и кишечнике, 2) последовательный профиль, когда одна и та же порция липосом последовательно инкубировалась в среде, соответствующей определенному отделу ЖКТ.
На каждом этапе параллельного профиля отбирали пробы для измерения оптической плотности при 480 нм: для ротовой полости -каждые 5 минут, для желудка и кишечника - каждые 15 минут.
В ходе имитации желудочно-кишечного тракта на разных стадиях наблюдалась деструкция липосом, что выражалось в увеличении оптической плотности.
По результатам эксперимента (рис.1) было выявлено, что максимальная оптическая плотность для соевого лецитина (1) достигалась в ротовой полости за 5 минут, в желудке - за 60 минут, в кишечнике - за 30 минут. В случае с яичным лецитином (2): в ротовой полости - за 10 минут, в желудке - за 15 минут, в кишечнике - за 30 минут. На основе этих данных были отобраны пробы липосом в самом начале процесса переваривания, через время, при котором наблюдалось максимальное значение оптической плотности, и в конце процесса переваривания. Для каждого образца был определен размер липосом и ^-потенциал. Полученные результаты представлены ниже (Таблица 1). Было установлено, что с течением времени липосомы значительно увеличиваются в размерах в среде ЖКТ (например, после нахождения в среде желудка в течение 120 минут размер липосом превышает более, чем в 10 раз исходный). Одновременно с этим наблюдалось уменьшение потенциала с течением времени. Это обуславливается разрушением липосом, а также изменениями при окислении конфигурации отрицательно заряженных полярных групп молекул фосфолипида и соответственно изменению ориентации вблизи поверхности бислойной мембраны.
В ходе исследования последовательного профиля после максимального для каждого отдела ЖКТ времени эксперимента были отобраны пробы липосом, для которых определялись размер частиц и ^-потенциал. Полученные результаты представлены в Таблице 2.
Таблица 1 - Изменение размера и ^-потенциала липомом в различных отделах ЖКТ для параллельного профиля
Яичный лецитин Соевый лецитин
Проба ^-потенциал, мВ Размер, мкм Проба ^-потенциал, мВ Размер, мкм
Нулевая 34±4 2-7 Нулевая 36±4 4-10
Рот (15 мин) 31±3 15-25 Рот (15 мин) 25±2 15-20
Желудок (15 мин) 32±4 10-15 Желудок (60 мин) 25±2 70-80
Желудок (120 мин) 12±1 100-110 Желудок (120 мин) 8±1 110-120
Кишечник (45 мин) 27±3 85-95 Кишечник (30 мин) 28±3 60-70
Кишечник (60 мин) 16±2 90-100 Кишечник (60 мин) 24±2 40-50
Таблица 2 - Изменение размера и потенциал липосом в различных отделах ЖКТ для последовательного профиля
Яичный лецитин Соевый лецитин
Проба ^-потенциал, мВ Размер, мкм Проба ^-потенциал, мВ Размер, мкм
Рот (15 мин) 31 ±2 17±0,9 Рот (15 мин) 34±2 5±3
Желудок (120 7±0,4 35±2 Желудок (120 24±1 26±1,3
мин) мин)
Кишечник (60 29±2 32±2 Кишечник (60 32±2 21±1
мин) мин)
О ........................
А 20 40 60 ВО 100 120 МО
Вргм*. шм
Время, мин
Рис. 1. Зависимость гидролиза липосом, полученных из соевого (1) и яичного (2) лецитина в ротовой полости (а), в желудке (б) и кишечник (в), от времени.
Было установлено, что для последовательного профиля характерно уменьшение ^-потенциала, а также увеличение размеров частиц, что связано с их разрушением, аналогично параллельному профилю. Так как разрушение липосом - обратимый процесс, под действием среды кишечника можно наблюдать агрегацию, сопровождающуюся существенным увеличением ^-потенциала, а также небольшим уменьшением размеров.
Также в ходе экспериментов было изучено количественное высвобождение доксорубицина в ЖКТ. Для этого использовались липосомы, полученные тепловым методом из соевого лецитина. Доксорубицин добавлялся на стадии гомогенизации липосом в соотношении 100 мг/л. Полученные липосомы были высушены при температуре 50°. Из 100 мл раствора было получено 8,9 грамм липосом, содержание доксорубицина в них составило 0,112%. Каждая проба содержала из 0,5 г содержала 0,56 мг доксорубицина.
В ходе имитации желудочно-кишечного тракта на разных стадиях наблюдалась деструкция липосом и высвобождение доксорубицина. Концентрация доксорубицина в надосадочной жидкости определялась по калибровочному графику. Результаты эксперимента приведены в табл. 3.
Таблица 3 - Высвобождение доксорубицина при моделировании ЖКТ
Таким образом, были исследованы получение липосом тепловым методом и поведение частиц в ЖКТ. По результатам проведённых экспериментов была подобрана эффективная методика получения и сделаны выводы о высокой степени расщепления липосом в ЖКТ человека. Были проведены исследования последовательного и параллельного профилей. Для параллельного по данным о Z-потенциале можно судить о разрушении частиц, соответственно, должно высвобождаться
включенное вещество. По таблице изменения размеров можно судить максимальной степени разрушения частиц при максимальном времени нахождения частиц в среде ЖКТ. Для последовательного профиля были сделаны выводы об агрегатном состоянии липосом после прохождения всей модели ЖКТ человека. Опыты с высвобождением доксорубицина подтвердили наибольшее разрушение липосом в кишечнике; соответственно, включённые вещества наиболее полно высвобождаются там.
Список литературы
1. Забодалова Л.А, Чернявский В.А, Ищенко Т.Н, Скворцова Н.Н. Получение липосом из соевого лецитина // Научный журнал НИУ ИТМО. Серия «Процессы и аппараты пищевых производств». 2011
2. Шанская А.И., Пучкова С.М., Яковлева Т.Е. Липосомы - перспективная форма лекарственных препаратов // Медицина экстремальных ситуаций. 2011
3. Brodkorb, A., Egger, L., Alminger, M., Alvito, P., Assunsao, R., Ballance, S.,... Recio, I. INFOGEST static in vitro simulation of gastrointestinal food digestion // Nature Protocols. 2019. 14(4), 991-1014. doi:10.1038/s41596-018-0119-1
Проба Высвобождение доксорубицина, мг Высвобождение до ксорубицина, %
Рот (15 минут) 0,250 2,72
Желудок (120 минут) 0,407 22,33
Кишечник (60 минут) 0,630 62,44
