CC BY
134
УДК 543.544:668.253
ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА И АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПРОДУКТОВ ВОДНО-ПАРОВОЙ ДИСТИЛЛЯЦИИ ПИХТЫ СИБИРСКОЙ (ABIES SIBIRICA LEDEB)
© В.В. Хасанов , Г.Л. Рыжова, Т. Т. Куряева, К.А. Дычко
Томский государственный университет, пр. Ленина, 36, Томск, 634050 (Россия) E-mail: [email protected]
Исследован состав продуктов перегонки с водяным паром пихты сибирской - пихтового масла и водного конденсата. Идентифицировано около 80 соединений в органической фазе дистиллята и около 20 - в водной, всего обнаружено около 200 соединений. Водная фаза дистиллята изучена на наличие антиокислительной активности. Установлено, что величина антиокислительной активности возрастает примерно вдвое с повышением рН среды. Предполагается, что основной вклад в антиокислительную активность вносят многоатомные фенольные соединения.
Ключевые слова: пихта сибирская, состав, сульфит, окисление, антиоксиданты, многоатомные фенолы, спирты, гидрохинон.
Введение
Один из предметов исследований растений - определение состава эфирных масел, получаемых либо паровой дистилляцией, либо способами экстракции. Согласно литературным данным, основными компонентами эфирных масел являются производные изопрена, так называемые терпены. В простейшей классификации терпены делят на монотерпены (содержащие 2 остатка изопрена или 10 атомов углерода), сесквитерпе-ны (С15), дитерпены (С20) и так далее, как содержащие, так и не содержащие кислород. Разнообразные изомеры терпенов есть практически в любых частях растений, они различаются только качественным и количественным составом [1-2], значительное их число обнаружено даже в коре сибирской пихты [3]. Поскольку терпены - сравнительно летучие соединения, наиболее часто для их разделения применяют методы капиллярной газовой хроматографии (ГХ) [3], в том числе в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ/МС) [4-9]. Авторы [4] исследовали продукты гидродистилляции из растения Micromeria fruticosa (L.) Druce, карликового вечнозеленого кустарника, произрастающего в Израиле. Химический состав масла, полученного из иголок североамериканской сосны Pinus ponderosa, P. resinosa (красной сосны) и P. strobus (восточной белой сосны), был определен авторами [5].
Ряд работ посвящен также изучению антимикробной активности эфирных масел растений. Так, исследованы [6] надземные части растений Tanacetum santolinoides. Всего обнаружено около 30 компонентов, среди которых преимущественно содержались тимол (18%), транс-туйон (17,5%), хризантенил-ацетаты (23,1%) и цинеол (4,7%). Эфирные масла показали высокую антибактериальную активность по отношению к E. coli, Bacillus subtilis and Candida albicans. Эфирные масла дистиллятов перегонки с водяным паром растения Salvia officinalis L. (Сербия) проанализированы в [7] методом ГХ/МС. Главные компоненты - альфа-туйон (24,88%), камфора (16,03%) и 1,8-цинеол (9,79%). Эфирные масла проявили антимикробную активность против Bacillus subtilis S, Staphylococcus aureus, Escerichia coli, Salmonella enteritidis и Aspergillus niger. В работе [8] исследованы состав и антимикробное действие эфирных масел из цветов, листьев и стеблей растений Salvia pratensis L., Salvia glutinosa L. and Salvia aethiopis L. Показано различие в химическом составе
* Автор, с которым следует вести переписку.
терпенов, сесквитерпенов и дитерпенов, которые были обнаружены в единственном растении. Сравнительные исследования составов водно-паровых дистиллятов и углекислотных экстрактов из лап сибирской пихты методами ГХ и ИК-спектрометрии провели авторы [9]. Установлено существенное различие в компонентах, извлекаемых из растения этими двумя методами. Анализируя литературные данные по составу эфирных масел из различных растений, следует отметить чрезвычайно разнообразный состав масел не только среди видов, но и среди одного семейства, не говоря уже о сезонных различиях. К счастью, число соединений, образующих масла, относительно невелико. Процессы и способы получения эфирных масел все еще являются предметом дискуссии [10], однако данные о составе водного конденсата при паровой дистилляции практически не встречаются.
Наконец, известны работы, посвященные изучению антиокислительной способности эфирных масел растений, например исследование проведенное авторами [11] на модели окисления кроцина. Вообще говоря, к проблеме изучения антиокислительной активности растительных объектов в последнее время проявляется всевозрастающий интерес, и эфирные масла не оказались тут исключением.
Цель настоящей работы - изучение компонентного состава пихтового масла и водного дистиллята, образующихся при перегонке с водяным паром пихтовых лап.
Исследованию были подвергнуты товарное пихтовое масло (дистиллят паровой перегонки) и сопутствующая ему водная фаза, имеющая коммерческое наименование «Абисиб».
Экспериментальная часть
Условия анализа ГХ/МС. Разделение и идентификацию компонентов проводили на системе хромато-масс-спектрометрии фирмы Agilent, состоящей из газового хроматографа HP 6S90 Plus и масс-спектрального детектора MSD 5973N.
Условия хроматографического разделения: колонка капиллярная DB-5ms (5% дифенил и 95% диметил-полисилоксан, толщина фазы 0,25 мкм) размером 30 м x 0,25 мм, программирование температуры от 70 до 290 °С со скоростью 15 °С/мин. Газ-носитель - гелий, 1 смз/мин (постоянный расход). Проба 1 мкл без деления потока (лайнер HP 5062-35S7 splitless), испаритель 2S0 °С.
Идентификация соединений осуществлялась вручную сравнением масс-спектров соединений с библиотечными (Wiley275 и NIST9S) масс-спектрами. Степень совпадения масс-спектров указана в таблице. Для идентифицированных соединений приведены также рассчитанные индексы удерживания по Ковачу. Количественные данные по содержанию компонентов получены исходя из площадей пиков на хроматограмме по полному ионному току, приведены в нормировочных процентах от суммы площадей всех зарегистрированных пиков без учета коэффициентов чувствительности.
Пихтовое масло подвергалось хроматографическому анализу непосредственно, без какой-либо предварительной пробоподготовки, водный дистиллят предварительно экстрагировали с четыреххлористым углеродом. Предварительная подготовка водных образцов необходима для получения совместимого с хроматографической системой образца для максимально эффективного разделения и идентификации компонентов.
Приготовление водных образцов. Препарат «Абисиб» смешивали с четыреххлористым углеродом при соотношении 10 : 1, интенсивно встряхивали в течение 5-10 мин и подвергали разделению фаз на центрифуге при 3000-5000 мин-1 в течение 5-10 мин. Полученную фазу четыреххлористого углерода хроматографировали без удаления остаточной влаги.
Обсуждение результатов
Среди компонентов пихтового масла удалось идентифицировать около S0 соединений. Из-за того что на основании только масс-спектров невозможно различить некоторые изомеры терпенов, для повышения надежности идентификации использовали сравнение рассчитанных индексов удерживания по Ковачу с литературными данными по некоторым соединениям. Результаты определения состава пихтового масла приведены в таблице 1.
Основными компонентами пихтового масла являются монотерпеновые углеводороды (альфа- и бетта-пинены, камфен, дельта-карен, терпинен и трициклен), спирты (борнеол) и его эфиры с уксусной кислотой (борнилацетат). Эти соединения составляют около 75% пихтового масла по массе. Содержание камфоры незначительно. Кроме того, в масле обнаруживаются эпоксиды различных терпенов, кетоны и ряд других соединений.
Результаты анализа экстрактивных соединений препарата «Абисиб» приведены в таблице 2.
Таблица 1. Состав пихтового масла (паровая перегонка лап пихты)
ЯПЯ тле™ ЯПЯ Ягжя-
№ Ковач Наименование % МС, % № Ковач Наименование % МС, %
1 930 трициклен 3,15 99 40 1380 геранилацетат 1,31 99
2 938 альфа-пинен 5,37 99 41 1389 сативен 0,24 96
3 953 камфен 4,36 99 42 1399 изолонгифолен 0,47 94
4 976 сабинен 0,02 95 43 1403 юнипен 1,40 98
5 980 бетта-пинен 2,07 98 44 1404 додеканаль 0,15 93
6 991 мирцен 1,30 98 45 1418 кариофиллен 3,50 99
7 998 1-фелландрен 1,00 96 46 1439 аромадендрен 0,04 84
8 1003 дельта-3-карен 6,19 99 47 1446 2,4а,5,6,7,8,9,9а-октаг- идро-3,5,5-триметил-9- метилен-бензоцикло- гептен 0,28 91
9 1021 альфа-терпинен 5,81 99 48 1454 альфа-гумулен 2,41 99
10 1026 п-цимен (п-метилкумол) 0,04 91 49 1465 1-додеканол 0,27 98
12 1039 бетта-фелландрен 0,41 92 50 1474 альфа-аморфен 0,10 98
13 1040 транс-бетта-оцимен 0,05 90 51 1477 гамма-гимахален 0,78 99
14 1062 гамма-терпинен 0,58 94 52 1482 транс-альфа-бисаболен 0,33 98
15 1062 цис-линалоолоксид 0,03 90 53 1483 аллоаромадендрен 0,16 96
16 1088 альфа-терпинолен 3,54 99 54 1485 гамма-гуруен 0,05 93
17 1092 линалоол 0,03 91 55 1488 бетта-селинен 0,11 85
18 1107 фенхол 0,17 95 56 1491 дельта-селинен 0,005 80
19 1112 1 -метил-4-изопропил-циклогексен-2-он-1 0,11 96 57 1495 гермакрен 0,33 95
20 1116 альфа-камфоленальдегид 0,005 90 58 1499 альфа-мууролен 0,43 96
21 1136 транс-пинокарвеол 0,005 97 59 1500 бетта-гимахален 0,07 90
22 1143 камфора 2,02 99 60 1507 бетта-бисаболен 0,82 97
23 1145 эюо-метилкамфенилол 0,54 96 61 1515 цис-гамма-бисаболен 0,28 98
24 1165 борнеол 16,44 99 62 1524 дельта-кадинен 0,29 97
25 1177 терпинен-4-ол 0,44 99 63 1527 альфа-гимахален 0,005 81
26 1184 4-изопропилцикло- гексен-2-он-1 0,35 98 64 1530 транс-гамма-бисаболен 0,32 87
27 1189 альфа-терпинеол 1,23 99 65 1537 цис-альфа-бисаболен 0,14 85
28 1220 фенхилацетат 0,11 91 66 1542 альфа-калакорен 0,09 88
29 1236 тимилметиловый эфир 0,50 85 67 1563 неролидол 0,28 96
30 1272 гераниол 0,005 80 68 1567 додекановая кислота 0,20 99
31 1285 борнилацетат 21,46 99 69 1581 кариофилленоксид 0,81 99
32 1328 пиперитенон 0,005 87 70 1595 лонгиборнеол 0,20 96
33 1335 метилдеканоат 0,005 82 71 1602 1,5,5,8-тетраметил-12-оксабицикло [9.1.0] до-дека-3,7-диен (гумулен-эпоксид II) 0,15 94
34 1344 дельта-элемен 0,005 80 72 1619 селина-6-ен-2-ол 0,29 93
35 1351 альфа-кубебен 0,49 95 73 1620 альфа-кадинол 0,14 91
36 1354 альфа-лонгипинен 0,33 92 74 1654 т-мууролол 0,005 80
37 1361 нерилацетат 0,53 89 75 1677 италицен 0,09 84
38 1372 альфа-иланген 0,22 82 76 1707 альфа-бисаболол 1,17 99
39 1376 альфа-копаен 0,16 85 77 1998 маноил-оксид 0,20 95
Сумма 97,74
Примечание: индексы удерживания компонентов по Ковачу; количество указано в процентах от суммы площадей
всех пиков; совпадение масс-спектра компонента с библиотечным масс-спектром, %.
Спектр соединений, обнаруженных в водном слое дистиллята от перегонки пихтовых лап с водяным паром, не так обширен. В отличие от пихтового масла, подавляющее большинство соединений представляет собой кислородсодержащие производные монотерпенов. Среди суммы соединений в водном слое дистиллята подавляющая часть приходится на спирты (борнеол, альфа-терпинеол, альфа-бисаболол), кетоны и сложные эфиры (борнилацетат). Такой состав компонентов в продуктах паровых дистиллятов пихты вполне соответствует их физико-химическим свойствам. Среди идентифицированных компонентов водной фазы парового дистиллята пихтовых лап вклад в антиокислительную активность вносят спиртовые производные терпенов. Однако они не обладают существенными антиокислительными свойствами.
Таблица 2. Состав водной фазы парового дистиллята пихтовых лап («Абисиб»)
№ Ковач* Наименование %** МС, %***
1 1143 камфора 0,005 9S
2 1145 эюо-метилкамфенилол 0,7б 9S
3 11бб борнеол 31,07 99
4 1190 альфа-терпинеол 24,70 99
5 1250 о-изопропилфенол 0,22 S7
б 1272 цитраль 0,04 S0
7 12S0 пиперитон 0,35 S9
S 12S5 борнил ацетат 20,SS 99
9 1310 5-метил-2-изопропилфенол 0,005 S0
10 1320 кар-3-ен-2-он (4,7,7-триметилбицикло[4.1.0]гептен-3-он-2) 1,25 93
11 1339 2-метокси-4-метилкумол 0,00б
12 1352 бицикло[3.3.1]нонан-3-он 0,2S S0
13 13б2 гераневая кислота (3,7-диметил-2,б-октадиеновая) 0,3б 9б
14 143б массоилактон 0,19 95
15 1454 мегастигматриенон 1,23 94
1б 157S лонгиборнеол 1,42 9S
17 15S5 1-(2,3,б-триметилфенил)-3-бутен-2-он 0,22 97
1S 159S селина-б-ен-4-ол 0,3б 9б
19 1б22 мегастигматриенон 2 0,21 99
20 1б42 этиловый эфир 4-этоксибензойной кислоты 0,005 S0
21 1б55 2,2 ,б ,7-тетраметилбицикло [4.3.0] нонанол-1 0,007 S1
22 16S1 цедрол 0,005 90
23 1б90 альфа-бисабололоксид 0,4S 9S
24 1707 альфа-бисаболол б,б0 99
25 199S маноил-оксид 0,01 9S
я 1 Всего идентифицировано ЯПИ 1 91,2%
Примечание: индексы удерживания компонентов по Ковачу; количество указано в процентах от суммы площадей
всех пиков; совпадение масс-спектра компонента с библиотечным масс-спектром, %.
Определение суммарной антиокислительной активности водного слоя парового дистиллята пихты
Антиокислительная активность водной фазы дистиллята оценивалась нами на описанной ранее модельной реакции окисления сульфита натрия [12].
Препарат «Абисиб» представляет собой гомогенную жидкость бледно-малинового цвета. Окраска его, по-видимому, обусловлена наличием антоцианиновых соединений, общая химическая структура которых приведена на рисунке 1. Как и другие фенолы, они обладают летучестью при перегонке с водяным паром и поэтому оказываются в составе водной фазы парового дистиллята. Поскольку эти соединения в природе встречаются, в том числе и в виде гликозидов (один или несколько R = остаток углевода), то без кислотного гидролиза они не переходят при экстракции в органическую фазу. Будучи освобожденными от остатка углевода (кислотный или ферментативный гидролиз), эти соединения, тем не менее, не могут быть анализированы методом ГЖХ или ГХ/МС вследствие недостаточной летучести в отсутствии паров воды. Благодаря своей химической структуре эти соединения способны обладать значительными антиокислительными свойствами.
Благодаря фенольным гидроксилам антоцианины проявляют свойства кислотно-основных индикаторов -меняют интенсивность и окраску в зависимости от значения рН раствора. Ионизация фенольных оксигрупп (равно как и их метилирование) изменяет характеристики поглощения спектра электромагнитного излучения. В результате эксперимента было показано, что препараты «Абисиб» с искусственно увеличенным значением рН обладают антиокислительным действием в большей степени. Подобное поведение можно объяснить увеличенной склонностью к отдаче гидрид-иона у двух- и многоатомных фенолов, когда одна из гидроксильных групп ионизирована под действием основания согласно приведенной на рисунке 2 схеме. Под
R
R
R
OH
Рис. 1. Общая структура антоцианиновых соединений (Я= Н, ОН, ОСН3 или остаток углевода, в различных комбинациях)
влиянием положительного мезомерного эффекта ионизированного гидроксила водород второй гидроксильной группы (расположенной в о- или ^-положении) приобретает склонность к отщеплению в виде гидрид-иона (который непосредственно переходит на соединение-акцептор). Экспериментально установлено, что еще большей такой склонностью обладает водород при углероде с гидроксильной группой у семихинона (рис. 3). Семихинон образуется в растворах гидрохинона, имеющих контакт с кислородом воздуха.
В таблице 3 приведены значения АОА при нейтральных и щелочных значениях среды препарата «Аби-сиб», а также свежего раствора гидрохинона и этого же раствора после частичного окисления гидрохинона воздухом в результате хранения в течение нескольких дней.
Рис. 2. Схема передачи гидрид-иона от фенолят- Рис. 3. Схема передачи гидрид-иона от семихинона.
аниона (Акцептор гидрид-иона не показан) (Акцептор гидрид-иона не показан)
Таблица 3. Антиокислительные свойства (АОА) препарата «Абисиб», а также растворов гидрохинона в нейтральной и щелочной средах
Образец АОА Ед. измерения АОА
рН~ 7,0 рН ~ 10,5
«Абисиб» 60±8 (рН=4,0) 125±17 мл-1
Гидрохинон 682±82 929±120 мг-1
Гидрохинон частично окисленный 892±110 1177+125 мг-1
Подобный механизм увеличения антиокислительных свойств вполне укладывается в понятие гидридных антиоксидантов. Решающее влияние при этом имеет значение рН среды образца, несмотря на то, что при определении антиокислительных свойств на модели окисления сульфита происходит разбавление образца в растворе сульфита с неизменной рН (около 8,0). Степень разбавления составляет до 30 тыс. раз, и даже в этом случае повышение АОА от роста рН образца стабильно детектируется.
Выводы
Методом ГХ/МС идентифицированы около 80 соединений органической фазы и около 20 соединений водной фазы водно-парового дистиллята пихты сибирской. Соединения в водной фазе представлены в основном кислородсодержащими монотерпенами (спирты и кетоны, а также борнилацетат). Общее число соединений, содержащихся в пихтовом масле в заметных концентрациях, составляет около 200.
Однако решающий вклад в антиокислительную активность водной фазы парового дистиллята пихтовых лап вносят, по-видимому, антоцианины, механизм антиокислительного действия которых связан с передачей гидрид-иона.
Список литературы
1. Skoula M., Hilali I.El., Makris A.M. Evaluation of the genetic diversity of Salvia fruticosa Mill. clones using RAPD markers and comparison with the essential oil profiles // Biochemical systematics and Ecology. 1999. V. 27. P. 559-568.
2. Samsudin M.W., Ibrahim M.N., Said I.M. Composition of the steam volatile oil from Calophyllum inophyllum // ASEAN Review of Biodiversity and Environmental Conservation (ARBEC) November-December 1999. http://www.arbec.com.my/pdf/art3novdec99
3. Левданский В.А., Полежаева Н.И., Макиевская А.И., Кузнецов Б.Н. Безотходная переработка коры пихты // Химия растительного сырья. 2000. №4. С. 21-28.
4. Dudai N., Larkov O., Ravid U., Putievsky E., Lewinsohn E. Developmental Control of Monoterpene Content and Composition in Micromeria fruticosa (L.) Druce // Annals of Botany. 2001. V. 88. P. 349-354.
5. Krauze-Baranowska M., Mardarowicz M., Wiwart M., Pobiocka L., Dynowska M. Antifungal Activity of the Essential Oils from Some Species of the Genus Pinus // Z. Naturforsch. 2002. V. 57с. P. 478-482.
6. El-Shazlya A., Dorai G., Wink M. Composition and Antimicrobial Activity of Essential Oil and Hexane-Ether Extract of Tanacetum santolinoides (DC.) Feinbr. and Fertig // Z. Naturforsch. 2002. V. 57c. P. 620-623.
7. Miladinovich D., Miladinovich Lj. Antimicrobial activity of essential oil of sage from Serbia // FACTA UNIVERSI-TATIS, Series: Physics, Chemistry and Technology. 2000. V. 2. №2. P. 97-100.
8. Velichkovich D.T., Randjelovich N.V., Ristich M.S., Shmelcerovich A.A., Velichkovich A.S. Chemical composition and antimicrobial action of the ethanol extracts of Salvia pratensis L., Salvia glutinosa L. and Salvia aethiopis L. // Serb. Chem. Soc. 2002. V. 67. №10. P. 639-646.
9. Сидельников В.Н., Патрушев Ю.В., Сизова Н.В., Петренко Т.В. Сравнительный анализ состава пихтового масла, полученного водно-паровой дистилляцией, и эфиромасличной фракции СО2-экстракта лапки пихты сибирской // Химия растительного сырья. 2003. №1. С. 79-85.
10. Purveyors of Organic and Wild-Crafted Essential Oils and Healing Accessories // http://www.aromawerks.com/Distillation.htm
11. Pizzale L., Bortolomeazzi R., Tognon R., Vichi S., Moret S. and Conte L.S. Chemical Composition and Antioxidant Activity of Essential Oils of Different Botanical Origin // http://www.richrom.com/assets/CD23PDF/m11.pdf.
12. Хасанов В.В., Рыжова Г.Л., Мальцева Е.В. Исследование антиокислительных свойств соединений с использованием реакции окисления сульфита натрия // Химия растительного сырья. 2004. №3. С. 77-85.
Поступило в редакцию 17 июля 2008 г.
