CC BY
54
Medical Immunology (Russia)/ Медицинская иммунология JJfla^ftK>U@ СООбШ,@НЫЯ Meditsinskaya Immunologiya
2015, Т. 17, № 2, стр. 167-172 Г^ . 2015, Vol. 17, M 2, pp. 167-172
© 2015, СПбро рааки Short communications © 2015, sPb raaci
ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ ХРОНИЧЕСКОЙ КРАПИВНИЦЫ
Баранова Н.И., Левашова О.А., Коженкова С.В.
ГБОУДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Министерства здравоохранения РФ, г. Пенза, Россия
Резюме. Проведено обследование 50 пациентов с хронической аутоиммунной крапивницей (ХАК) и 48 пациентов с хронической идиопатической крапивницей (ХИК). Изучено содержание цитоки-нов IL-4, IL-10 и IL-17A в сыворотке, в спонтанной и индуцированной продукции клетками крови, а также полиморфизм генов цитокинов IL-4 (С-589Т), IL-10 (G-1082A), IL-17A (G-197A). Не обнаружено различий при изучении показателей IL-4 в зависимости от генетических вариантов изучаемых полиморфизмов у больных ХАК и ХИК. Выявлено повышение показателей IL-10 у больных ХИК, которое не имело взаимосвязи с генотипом IL-10 (G-1082A). Повышенные показатели IL-17A у пациентов с ХАК ассоциировались с гомозиготным носительством АА по сравнению с контрольной группой и гетерозиготным носительством GA по сравнению с группой ХИК. Выявленные различия полиморфизма генов цитокинов при ХАК и ХИК свидетельствуют о различиях молекулярно-генети-ческих основ формирования изучаемых форм ХК.
Ключевые слова: хроническая крапивница, полиморфизм, цитокины
STUDIES ON THE ROLE OF CYTOKINES POLYMORPHISM IN PATHOGENESIS OF CHRONIC URTICARIA
Baranova N.I., Levashova O.A., Kozhenkova S.V.
Penza Institute of Postgraduate Medical Education, Penza, Russian Federation
Abstract. Fifty patients with chronic autoimmune urticaria (CAU) and forty-eight patients with chronic idiopathic urticaria (CIU) have been examined. Blood serum contents of IL-4, IL-10 and IL-17A, spontaneous and induced cytokine production in blood cells, as well as polymorphism of IL-4 (C-589T), IL-10 (G-1082A), IL-17A (G-197A) cytokine genes has been studied. No differences have been detected when studying IL-4 levels, depending on genetic variants of IL-4 gene in patients with CAU and CIU. Increased IL-10 amounts in patients with CIU still did not show any correlations with IL-10 genotype (G-1082A). Increased IL-17A levels in patients with CAU were associated with homozygous genotype of AA in comparison to control group, and with heterozygous GA genotype, in comparison to CIU group. The revealed differences of cytokines' genes polymorphism in CAU and CIU provide a molecular-genetic evidence for different clinical forms of chronic urticaria.
Keywords: chronic urticaria, gene polymorphism, cytokines
Адрес для переписки:
Баранова Надежда Ивановна
ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Министерства здравоохранения РФ 440060, Россия, г. Пенза, ул. Стасова, 8а. Тел./факс: 8 (8412) 43-43-57. E-mail: giuv@sura.ru
Address for correspondence:
Baranova Nadezhda I.
Penza Institute of Postgraduate Medical Education 440060, Russian Federation, Penza, Stasova str., 8a. Phone/Fax: 7 (8412) 43-43-57. E-mail: giuv@sura.ru
Образец цитирования:
Н.И. Баранова, О.А. Левашова, С.В. Коженкова, «Изучениероли полиморфизма генов цитокинов в патогенезе хронической крапивницы» //Медицинская иммунология, 2015. Т. 17, № 2. С. 167-172.
doi: 10.15789/1563-0625-2015-2-167-172 © Баранова Н.И. и соавт., 2015
For citation:
N.I Baranova, O.A. Levashova, S.V. Kozhenkova, "Studies on the
role ofcytokines polymorphism in pathogenesis ofchronic urticaria",
Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya,
2015, Vol. 17, no. 2, pp. 167-172.
doi: 10.15789/1563-0625-2015-2-167-172
DOI: http://dx.doi.org/10.15789/1563-0625-2015-2-167-172
Введение
На протяжении многих лет хроническая крапивница (ХК) является одной из сложных проблем медицины. Широкая распространенность, длительное и упорное течение болезни, резистентность к традиционным методам терапии приводят к серьезному снижению качества жизни больных ХК [5, 12]. До настоящего времени назначение патогенетически обоснованной терапии при данной патологии представляет наибольшую трудность [2, 3, 4].
Среди всех форм ХК наиболее сложными для диагностики и лечения остаются хроническая аутоиммунная крапивница (ХАК) и хроническая идиопатическая крапивница (ХИК). Распространенность ХАК составляет от 30 до 50% [7, 10]. Распространенность ХИК составляет также около 50% [8]. Несмотря на то, что проведено немало работ по изучению данных формы заболевания, одним из малоизученных аспектов в патогенезе ХК остается роль генетического полиморфизма наиболее значимых цитокинов.
Известно, что мутации в генах цитокинов могут приводить к серьезным нарушениям иммунитета. У человека подобные мутации встречаются достаточно редко, что может свидетельствовать о важнейшей роли цитокинов в осуществлении защитных реакций. Тем не менее, накапливается все больше данных о выявлении функционального полиморфизма генов цитокинов, связанного с заменами единичных нуклеотидов (Single nucleotide polymorphism — SNP), вызывающих количественные изменения функционирования соответствующих генов, в отличие от мутаций, полностью выключающих функции кодируемых ими белков. Обладая значительной вариабельностью, цитокины характеризуются наличием однонуклеотидных полиморфизмов, ассоциированных с изменением синтеза биохимических продуктов у больных с различными аллергическими заболеваниями.
Исследованиями последних лет доказано, что наиболее важными в патогенезе ХАК и ХИК являются IL-4, IL-10 и IL-17 [1, 9]. В приведенных работах рассматривалась связь количественных отклонений цитокинов с формированием той или иной формы ХК. Однако в доступной нам литературе работ по анализу ассоциаций полиморфизма генов данных цитокинов с той или иной формой ХК не было найдено.
В связи с вышеизложенным, целью работы явилось сравнительное изучение содержания цитокинов IL-4, IL-10 и IL-17A в сыворотке, в спонтанной и индуцированной продукции
клетками крови и их связь с полиморфизмом генов цитокинов IL-4 (С-589Т), IL-10 (G-1082A), IL-17A (G-197A) у больных ХАК и ХИК.
Материалы и методы
На проведение работы было получено разрешение локального этического комитета. Все пациенты дали информированное согласие на проведение исследования и использование их медицинской документации.
Было обследовано 98 больных ХК в возрасте от 18 до 60 лет (средний возраст составил 41±12 лет), из них 50 пациентов с диагнозом ХАК и 48 пациентов — с ХИК. Диагноз ХАК и ХИК устанавливался на этапе предварительного обследования на основании данных анамнеза, клинических проявлений болезни, длительности заболевания, анализа данных сопутствующих заболеваний, а также положительных результатов пробы с аутосывороткой. Диаметр пробы 7 мм и более являлся диагностическим критерием ХАК [6]. Пациенты с ХИК имели отрицательную пробу с аутосывороткой. Также было обследовано 30 здоровых людей (контрольная группа) в возрасте от 23 до 56 лет (средний возраст составил 34±9 лет), сопоставимых по полу и возрасту с группами ХАК и ХИК.
Всем изучаемым группам определяли концентрацию IL-4, IL-10, IL-17A в сыворотке крови и супернатанте методом иммуноферментного анализа реактивами фирмы «Вектор-Бест». Также было проведено молекулярно-генетическое исследование. Анализировался полиморфизм генов IL-4 (С-589Т), IL-10 (G-1082A), IL-17A (G-197A). Все исследования были проведены на базе ЦНИЛ ГБОУ ДПО ПИУВ Минздрава России (г. Пенза). Генотипы по изучаемым маркерам цитокинов соответствовали нормальной гомозиготе, гетерози-готе и мутантной зиготе.
Материалом для изучения полиморфизмов генов IL-4, IL-10 IL-17A являлась геномная ДНК человека, выделенная из лейкоцитов периферической крови. Кровь для проведения исследований получали утром натощак, путем венепункции локтевой вены. Венозную кровь собирали в вакуумные пробирки, содержащие ЭДТА. Для выделения ДНК использовали реагент «ДНК-Экспресс-кровь» фирмы ООО НТП «Ли-тех» (Москва, Россия). Амплификацию проводили на аппарате «DT-lite» («ДНК-технология») с помощью тест-систем для выявления полиморфизмов в геноме человека «SNP-экспресс» (ООО НПФ «Литех») методом полимеразной цепной реакции в режиме real-time.
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием прикладных программ «Статистика 6,0». Описательная статистика качественных признаков (определение частоты встречаемости полиморфизмов генов) представлена относительными частотами. При сравнении двух выборочных средних в пределах одной выборки использовали критерий Вилкоксона, при сравнении групп между собой — критерий Манна—Уитни. Показатели представлены в виде медианы — Me, нижнего и верхнего квартилей (Q25; Q75). Сравнение несвязанных групп по качественным признакам (попарное сравнение частот молекулярно-генетических показателей в группах больных и здоровых лиц, а также между группами больных) осуществляли с использованием двустороннего критерия х2. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя отношения шансов odds ratio (OR) с 95% доверительным интервалом CI (confidence interval). Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.
Результаты
Как видно из данных таблицы 1, уровень IL-4 в сыворотке был достоверно ниже аналогичных показателей контрольной группы как в группе больных с ХАК, так и в группе больных ХИК (p < 0,05), что может свидетельствовать об отсутствии атопического механизма в обеих группах. Однако в изучаемых группах достовер-
ных различий по данному показателю не было выявлено как в сыворотке, так и в спонтанной и индуцированной продукции клетками крови. При сравнительном анализе показателей IL-10 в сыворотке крови было отмечено, что у больных ХАК и контрольной группы не было выявлено достоверных различий, однако в группе больных ХИК данный показатель составил 19,3 пг/мл [0,8-78,8], что было достоверно выше по сравнению с группой контроля, где данный показатель составил 1,0 [0-3,4] (критерий Манна—Уитни, р = 0,00001). Кроме того, при сравнении показателей IL-10 в группах ХАК и ХИК также наблюдалось достоверное повышение данного показателя у больных ХИК (критерий Манна—Уитни, p = 0,000032). Более того, было выявлено повышение IL-10 у больных ХИК и в спонтанной продукции клетками крови по сравнению с показателями больных ХАК. Известно, что IL-10 является основным продуктом регуля-торных клеток Tri, которые формируются в ходе иммунного ответа на периферии [11]. Повышение данного цитокина как по сравнению с контрольной группой, так и с группой больных ХАК может свидетельствовать о возможном участии данного цитокина в патогенезе ХИК.
При исследовании уровня спонтанной продукции IL-17 у больных ХАК было отмечено повышение данного показателя, который составил 58,3 пг/мл [45,0-98,1] по сравнению с результатами контрольной группы (критерий Манна—
ТАБЛИЦА 1. ПОКАЗАТЕЛИ ПРОДУКЦИИ !Ь4, !Ь-10, ^-17Д У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ КРАПИВНИЦЕЙ И ЛИЦ КОНТРОЛЬНОЙ ГРУППЫ ^25; Q75)
Показатели Больные ХАК (n = 50) Больные ХИК (n = 48) Контрольная группа (n = 30)
IL-4 сыв., пг/мл 0,39 (0-0,71)* 0 (0-0)** 4,6 (0,21-5,0)
IL-4 сп., пг/мл 0,8 (0,2-3,2) 2,8 (1,2-3,4) 0,1 (0-0,5)
IL-4 инд., пг/мл 1,8 (0,5-4,8) 3,6 (0,9-6,8) 1,0 (0,7-3,3)
IL-10 сыв., пг/мл 0 (0-3,0)*** 19,3 (0,8-78,8)** 1,0 (0-3,4)
IL-10 сп., пг/мл 9,75 (0-11,1)*** 19,5 (10,0-31,1) 11,3 (6,05-18,9)
IL-10 инд., пг/мл 10,1 (4,3-20,0) 15,1 (6,3-25,6)** 8,85 (0,7-21,25)
IL-17 сыв., пг/мл 0(0-0) 0 (0-0,8) 0 (0-1,0)
IL-17 сп., пг/мл 58,3 (45,0-98,1)* 11,3 (3,0-18,1)*** 5,4 (0-22,0)
IL-17 инд., пг/мл 95,55 (62,6-105,0)* 15,55 (2,6-25,0)*** 6,1 (0-23,5)
Примечание. * - статистически значимые различия больных ХАК и контрольной группы; ** - статистически значимые различия больных ХИК и контрольной группы; *** - статистически значимые различия больных ХАК и ХИК.
Используемые сокращения: сыв. - определение цитокинов в сыворотке крови; сп. - спонтанная продукция цитокинов клетками иммунной системы; инд. - индуцированная продукция цитокинов клетками иммунной системы.
ТАБЛИЦА 2. ЧАСТОТА ВСТРЕЧАЕМОСТИ ГЕНОТИПОВ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ И-4 (С-589Т), И-10 (в-1082Л), 17 (в-197Л) У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ КРАПИВНИЦЕЙ И ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ
Показатель Генотип Частота встречаемости генотипа, % OR (95%CI) Р
ХАК (n = 50) ХИК (n = 48) Здоровые (n = 30) ХАК и ХИК ХАК и здоровые ХИК и здоровые
IL-4 (С-589Т) СС 62,0% 51,1% 56,7% 1,561 (0,6373,840) p = 0,307 1,248 (0,4493,465) p = 0,646 0,799 (0,2842,240) p = 0,814
СТ 22,0% 35,6% 36,7% 0,511 (0,1871,384) p = 0,175 0,487 (0,1591,480) p = 0,198 0,953 (0,3272,782) p = 1,000
ТТ 16,0% 13,3% 6,7% 1,238 (0,3474,488) p = 0,778 2,667 (0,46719,737) p = 0,306 2,154 (0,35016,785) p = 0,464
IL-10 (G-1082A) GG 62,0% 64,4% 60,0% 0,900 (0,3592,256) p = 0,834 1,088 (0,3883,039) p = 1,000 1,208 (0,4193,484) p = 0,808
GA 34,0% 35,6% 40,0% 0,934 (0,3682,368) p = 1,000 0,773 (0,2732,185) p = 0,636 0,828 (0,2872,387) p = 0,808
AA 4,0% 0,0% 0,0% - - -
IL-17 (G-197A) GG 36,0% 20,0% 53,3% 2,250 (0,8106,352) p = 0,112 0,492 (0,1761,362) p = 0,163 0,219 (0,0690,680) p = 0,005*
GA 44,0% 71,1% 43,3% 0,319 (0,1240,812) p = 0,012* 1,027 (0,3742,830) p = 1,000 3,219 (1,1029,564) p = 0,029*
AA 20,0% 8,9% 3,3% 2,563 (0,66110,680) p = 0,155 7,250 (0,863159,805) p = 0,046* 2,829 (0,27270,082) p = 0,642
Примечание. * - достоверное различие частоты встречаемости генотипов по генам цитокинов между группами (р < 0,05).
Уитни, р = 0,00001). При сравнении результатов по спонтанной и индуцированной продукции IL-17 клетками иммунной системы между больными ХАК и ХИК было также получено достоверное повышение данного показателя у больных ХАК (Wilcoxon test, р = 0,035). Учитывая ключевую роль ТЫ7-популяции лимфоцитов в патогенезе аутоиммунных заболеваний, можно предположить, что повышение IL-17 может сви-
детельствовать о ведущем аутоиммунном механизме у больных ХАК.
Данные молекулярно-генетических исследований показали, что носительство аллели С полиморфизма ^-4 (С-589Т) у больных ХАК и ХИК достоверно не отличалось от показателей контрольной группы (табл. 2). Не было обнаружено достоверных различий генотипов в группах и при изучении аллеля G ^-10 ^-1082Л).
Сравнительное исследование частот генотипов IL-17 (G-197A) показал следующее распределение. Так, следует отметить, что генотип IL-17(197GG) статистически реже встречался у больных ХИК по сравнению со здоровыми людьми (OR = 0,219 (0,069-0,680) p = 0,005). По генотипу IL-17 (197GA) было получено достоверное повышение у пациентов ХИК по сравнению с контрольной группой (OR = 3,219 (1,1029,564) p = 0,029). Кроме того, гетерозиготное носительство у больных ХИК аллеля G полиморфизма (197 G/A) гена IL-17A было также достоверно выше по сравнению с группой ХАК (OR = 0,319 (0,124-0,812) p = 0,012). По мутант-ной зиготе полиморфизма (197 Л/A) гена IL-17A достоверное повышение было выявлено у больных ХАК по сравнению с контрольной группой (OR = 7,250 (0,863-159,805) p = 0,046).
Таким образом, не обнаружено различий при изучении показателей IL-4 в зависимости от генетических вариантов изучаемых полиморфизмов у больных ХАК и ХИК. Наиболее выраженная гиперпродукция IL-10 у больных ХИК и отсутствие взаимосвязи с данными молекулярно-генетиче-ских исследований по генотипу IL-10 (G-1082A) свидетельствует о возможной роли в патогенезе ХИК другого, не изученного нами аллеля. Однако было доказано, что повышенные показатели IL-17A у пациентов с ХАК ассоциировались с гомозиготным носительством АА по сравнению с контрольной группой и гетерозиготным носительством GA по сравнению с группой ХИК. Выявленные различия полиморфизма генов цито-кинов при ХАК и ХИК вносят вклад в изучение молекулярно-генетических основ формирования ХК и могут быть использованы при выборе метода лечения данных пациентов.
Список литературы / References
1. Баранова Н.И.. Коженкова С.В., Ащина Л.А. Роль цитокинов в патогенезе хронической крапивницы // Цитокины и воспаление, 2014. Т. 13, № 1. С. 11-15. [Baranova N.I., Kozhenkova S.V., Ashchina L.A. Role of cytokines in pathogenesis of chronic urticaria. Tsitokiny i vospalenie = Cytokines and Inflammation, 2014, Vol. 13, no. 1, pp. 11-15. (In Russ.)]
2. Борзова Е.Ю. Новые аспекты патогенеза хронической крапивницы // Российский аллергологи-ческий журнал, 2012. № 5. С. 3-9. [Borzova E.Yu. New aspects of pathogenesis of chronic urticaria. Rossiyskiy allergologicheskiy zhurnal = Russian Allergology Journal, 2012, no. 5, pp. 3-9. (In Russ.)]
3. Голубчикова Р.Н., Данилычева И.В. Оценка эффективности антигистаминной терапии у больных хронической идиопатической крапивницей // Российский аллергологический журнал, 2012. № 2. С. 1318. [Golubchikova R.N., Danilycheva I.V. Assessment of antihistaminic therapy efficacy in patients with chronic idiopathic urticarial. Rossiyskiy allergologicheskiy zhurnal = Russian Allergology Journal, 2012, no. 2, pp. 13-18. (In Russ.)]
4. Данилычева И.В. Лечение крапивницы off-label // Российский аллергологический журнал, 2012. № 6. С. 15-23. [Danilycheva I.V., Pecherey I.O. Treatment of urticarial off-label. Rossiyskiy allergologicheskiy zhurnal = Russian Allergology Journal, 2012, no. 6, pp. 15-23. (In Russ.)]
5. Колхир П.В. Крапивница и ангиоотек. М.: Практическая медицина, 2012. 364 с. [Kolkhir P.V. Urticaria and angioedema]. Moscow: Practice Medicine, 2012. 364 p.
6. Молотилов Б.А., Караулов А.В., Орлова Е.А., Больц Е.А., Алешкин В.А., Новикова Л.И., Лютов А.Г. Новые аспекты в диагностике и лечении аутоиммунной крапивницы // Иммунопатология, аллергология, инфектология, 2011. № 4. С. 11-14. [Molotilov B.A., Karaulov A.V., Orlova E.A., Bolc E.A., Alyoshkin V.A., Novikova L.I., Lyutov A.G. New aspects in diagnostics and treatment of autoimmune urticarial. Immunopatologiya, allergologiya, infektologiya = Immunopathology, Allergology, Infectology, 2011, no. 4, pp. 11-14. (In Russ.)]
7. Синельникова Н.А., Калинина Н.М., Савенкова Н.Д. Хроническая крапивница в детском возрасте. Формы хронической крапивницы у детей. Дифференциальная диагностика (часть II) // Медицинская иммунология, 2013. Т. 15, № 4. С. 313-324. [Sinelnikova N.A., Kalinina N.M., Savenkova N.D. Chronic urticaria in childhood. Chronic urticaria forms in children. Differential diagnostics (part II). Meditsinskaya immunologiya = Medicine Immunology (Russia), 2013, Vol. 15, no. 4. pp. 313-324. (In Russ.)]
8. Goh C.L., Tan K.T. Chronic autoimmune urticaria: where we stand? Indian J. Dermatol., 2009, Vol. 54, no. 3, pp. 269-274.
9. Jin C.Y., Wang D.L., Fang Z.D. Effect of integrative Chinese and western medicine in treating chronic urticaria and its impact on interleukin-10 and interleukin-8 in peripheral blood. Zhongguo ZhongXi Yi Jie HeZaZhi, 2008, Vol. 28, no. 4, pp. 358-360.
10. Kaplan A.P., Greaves M. Pathogenesis of chronic urticaria. Clin. Exp. Allergy, 2009, Vol. 39, no. 6, pp. 777787.
11. O'Garra, A., Vieira P.L., Goldfeld A.E. IL-10-producing and naturally occurring CD4+ Tregs: limiting collateral damage. Journal of Clinical Investigation, 2004, Vol. 114, is. 10, pp. 1372-1378.
12. Zuberbier T. A Summary of the New International EAACI/GA2LEN/EDF/WAO Guidelines in Urticaria. W Allergy Org. J., 2012, no. 5, pp. 1-5.
Авторы:
Баранова Н.И. — д.б.н., доцент, заведующая центральной научно-исследовательской лаборатории, ГБОУДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Министерства здравоохранения РФ, г. Пенза, Россия
Левашова О.А. — к.б.н., доцент, старший научный сотрудник центральной научно-исследовательской лаборатории, ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Министерства здравоохранения РФ, г. Пенза, Россия
Коженкова С.В. — аспирант кафедры аллергологии и иммунологии ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Министерства здравоохранения РФ, г. Пенза, Россия
Поступила 13.02.2015 Принята к печати 17.02.2015
Authors:
Baranova N.I., PhD, MD (Biology), Associate Professor, Head, Central Research Laboratory, Penza Institute of Postgraduate Medical Education, Penza, Russian Federation
Levashova O.A., PhD (Biology), Associate Professor, Senior Research Associate, Central Research Laboratory, Penza Institute of Postgraduate Medical Education, Penza, Russian Federation
Kozhenkova S.V., PhD Fellow, Department of Allergology and Immunology, Penza Institute of Postgraduate Medical Education, Penza, Russian Federation
Received 13.02.2015 Accepted 17.02.2015
