CC BY
21
Оригинальная статья / Original article УДК 632.91
DOI: 10.18470/1992-1098-2022-4-101-110
Изучение роли микроэлементов для синтеза антигрибных метаболитов штамма бактерии-антагониста Bacillus velezensis
Наталья C. Томашевич1, Татьяна М. Сидорова1, Ольга И. Киселева2, Илья Ю. Курбатов2, Валерия В. Аллахвердян1, Анжела М. Асатурова1
'Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр биологической защиты растений», Краснодар, Россия
2Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича», Москва, Россия
Контактное лицо
Наталья С. Томашевич, к.с.-х.н., с.н.с.
лаборатории микробиологической защиты
растений, ФГБНУ ФНЦБЗР; 350039 Россия,
г. Краснодар, п/о-39.
Тел. +79280388165
Email tom-s2@yandex.ru
ORCID https://orcid.org/0000-0002-7297-5929
Формат цитирования
Томашевич Н.С., Сидорова Т.М., Киселева О.И., Курбатов И.Ю., Аллахвердян В.В., Асатурова А.М. Изучение роли микроэлементов для синтеза антигрибных метаболитов штамма бактерии-антагониста Bacillus velezensis // Юг России: экология, развитие. 2022. Т.17, N 4. C. 101-110. DOI: 10.18470/1992-1098-2022-4-101-110
Получена 21 августа 2022 г.
Прошла рецензирование 29 сентября 2022 г.
Принята 25 октября 2022 г.
Резюме
Цель. Изучить состав экзометаболома бактерий штамма Bacillus velezensis BZR336g c применением с применением двумерной газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (GCxGC-MS) метода при культивировании на питательных средах, различающихся по содержанию микроэлементов.
Материалы и методы. Объект исследования - штамм бактерии B. velezensis BZR 336g. Он является перспективным для разработки на его основе биопрепарата для защиты растений от фитопатогенных грибов. Из жидкой культуры выделяли экзометаболиты и анализировали из метаболомный профиль методом GCxGC-MS. Результаты. Среди идентифицированных соединений можно увидеть предшественники биологически активных метаболитов бактерий штамма B. velezensis BZR336g. Анализ суммарного накопления жирных кислот и их аналогов, а также аминокислот и пептидов бактериями B. velezensis BZR336g на питательных средах, различающихся по содержанию ионов металлов, показывает, что ионы Со2+ в сочетании с ионами Mn2+ и Zn2+ играют важную роль в индуцировании их синтеза. На синтез пептидных составляющих наибольшее влияние оказывает присутствие в питательной среде иона Со2+. Если убрать его из питательной среды, количество пептидов, аминокислот и пептидов уменьшается почти в два раза. Соединения бензольной природы могут выступать в роли прекурсоров ароматических углеводородов, которые также представляют интерес при анализе метаболизма бактерий, так как они обладают антимикробной активностью. Заключение. Количество соединений, которые являются прекурсорами метаболитов липопептидной природы, зависит от содержания ионов металлов в питательной среде. Этот факт может изменяться в зависимости от того, в какой комбинации присутствуют металлы.
Ключевые слова
Экзометаболиты, Bacillus velezensis, антигрибные липопептиды, газовая хроматография-масс-спектрометрия, метаболомный профиль.
© 2022 Авторы. Юг России: экология, развитие. Это статья открытого доступа в соответствии с условиями Creative Commons Attribution License, которая разрешает использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.
Determining the role of microelements for the synthesis of antifungal metabolites of the antagonistic Bacillus velezensis strain
Natalia S. Tomashevich1, Tatiana M. Sidorova1, Olga I. Kiseleva2, Ilya Yu. Kurbatov2, Valeria V. Allahverdyan1 and Anzhela M. Asaturova1
'Federal Research Centre of Biological Plant Protection, Krasnodar, Russia institute of Biomedical Chemistry, Moscow, Russia
Principal contact
Natalia S. Tomashevich, Ph D (Agriculture), Senior Researcher, Microbiological Plant Protection Laboratory, Federal Research Centre of Biological Plant Protection; p/o-39 Krasnodar, Russia 350039 Tel. +79280388165 Email tom-s2@yandex.ru ORCID https://orcid.org/0000-0002-7297-5929
How to cite this article
Tomashevich N.S., Sidorova T.M., Kiseleva O.I., Kurbatov I.Yu., Allahverdyan V.V., Asaturova A.M. Determining the role of microelements for the synthesis of antifungal metabolites of the antagonistic Bacillus velezensis strain. South of Russia: ecology, development. 2022, vol. 17, no. 4, pp. 101-110. (In Russian) DOI: 10.18470/19921098-2022-4-101-110
Received 21 August 2022 Revised 29 September 2022 Accepted 25 October 2022
Abstract
Aim. To study the structure of bacteria exometabolites of the Bacillus velezensis BZR336g strain using the GCxGC-MS method when cultivated on nutrient media differing in the content of microelements. Material and Methods. The object of the study is the B. velezensis BZR336g bacterium strain. It shows promise for the development of a biopreparation on its basis for protecting plants against phytopathogenic fungi. Exometabolites were isolated from the liquid culture and their metabolomic profile was analysed with the GCxGC-MS method using a LECO Pegasus BT-4D device.
Results. Among the identified compounds one can see the precursors of biologically active metabolites of bacteria of the strain B. velezensis BZR336g. Analysis of the total accumulation of fatty acids and their analogs, as well as of amino acids and peptides, by B. velezensis BZR336g bacteria on nutrient media differing in the content of metal ions, shows that Co2+ ions in combination with Mn2+ and Zn2+ ions play an important role in inducing their synthesis. The presence of the Co2+ ion in the nutrient medium has the greatest influence on the synthesis of peptide components. If it is removed from the nutrient medium, the amount of amino acids and peptides decreases by almost two times. Benzene compounds can act as precursors of aromatic hydrocarbons, which are also of interest in the analysis of bacterial metabolism, since they have antimicrobial activity.
Conclusions. The number of compounds that are precursors of lipopeptide metabolites depends on the content of metal ions in the nutrient medium. This fact may vary depending on the combination in which the metals are present.
Key Words
Exometabolites, Bacillus velezensis, antifungal lipopeptides, gas chromatography-mass spectrometry, metabolomic profile.
© 2022 The authors. South of Russia: ecology, development. This is an open access article under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits use, distribution and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
ВВЕДЕНИЕ
Применение полезных микроорганизмов в качестве агентов биоконтроля считается одним из наиболее перспективных методов эффективной и безопасной защиты растений. Род Bacillus включает некоторые из наиболее коммерчески важных бактерий, используемых для производства широкого спектра промышленных ферментов и микробиологических препаратов. Все чаще эти бактерии используют в качестве противогрибных средств биоконтроля [1; 2]. С биотехнологической точки зрения многие штаммы различных видов в пределах рода Bacillus продуцируют широкий спектр биоактивных пептидов и других структурно различных антагонистических веществ. Такие виды как B. subtilis, B. amyloliquefaciens и B. pumilus, являются очень эффективными продуцентами молекул антибиотиков, и их ингибирующая активность против патогенов растений посредством прямого антибиоза является наиболее известным механизмом. Среди указанных выше антибиотиков особый интерес представляют липопептиды бацилл. Благодаря особенностям строения эти соединения амфифильны и устойчивы к гидролизу пептидазами и протеазами, а также нечувствительны к окислению, действию относительно высоких температур. Вместе с тем, их цистеиновые остатки могут окисляться до сульфидов и изменять структуру до характерных внутримолекулярных C-S-связей [3]. Циклические липопептидные соединения с тремя основными семействами итурина, сурфактина и фенгицина, а в последнее время также с представителями семейства курстакинов, являются хорошо известными соединениями с однозначными доказательствами в качестве ключевых факторов в биоконтроле [4].
Синтезом метаболитов бактерий можно управлять путем изменения условий культивирования, способствующих активации генов, ответственных за набор ферментов, необходимых для синтеза того или иного метаболита. Эффективным подходом для раскрытия метаболического потенциала, а также для активации «молчащих» генов является изменение состава макро- и микроэлементов (МЭ) питательной среды. Уровни индукции, подавления или даже ингибирования зависят от различных типов и количества металлов в питательной среде. Были опубликованы многочисленные сообщения о важности ионов металлов в биосинтезе метаболитов, особенно антибиотиков [5]. У некоторых актиномицетов было замечено, что использование металлов в технологии культивирования вызывает изменение биосинтетических метаболических путей, приводящих к формированию новых метаболитов, которые не образуются в изолятах дикого типа при нормальных условиях роста. Кроме того, синтез различных веществ усиливается, когда определенные металлические МЭ добавляются в питательную среду штаммов микроорганизмов, устойчивых к тяжелым металлам [5]. Их важность также подчеркивается тем, что почти 30% всех биосинтетических ферментов микроорганизмов взаимодействуют с металлическим кофактором.
Некоторые металлы с окислительно-восстановительными функциями, такие как Fe, Cu, Mn, Zn, Co, Ni, Mo и Mg, являются ключевыми факторами для многих микробных ферментов, участвующих в путях
биосинтеза метаболитов. Ионы марганца (Mn2+) представляют большую значимость для питания микроорганизмов и, как было установлено, специфически участвуют в различных клеточных процессах, в том числе, в обмене веществ. Очевидно, что Mn2+ является важным регуляторным ионом микроорганизмов и играет значительную роль в биосинтезе предшественников липопептидных метаболитов, таких как жирные кислоты и липиды. Добавление в питательную среду Mn2+ (0,01 мМ) повысило продукцию сурфактина от 0,33 до 2,6 г/л [6]. Цинк (Zn) является важным металлом и, как сообщалось, участвует в различных биохимических реакциях, выполняя каталитические, структурные, окислительно-восстановительные и регуляторные функции. Как и в случае с железом, цинк играет решающую роль в формировании структурных элементов, стабилизации белковых складок микроорганизмов и, что наиболее важно, в регулировании функций различных метаболических ферментов в форме кофакторов и коактиваторов, участвующих в реакциях биосинтеза. Кобальт (Co) является важным металлом, поскольку он действует как кофактор для витамин В12-зависимых ферментов. Роль кобальта в продуцировании метаболитов была хорошо продемонстрирована у различных микроорганизмов, и есть несколько сообщений о регуляции продуцирования антибиотиков у актиномицетов.
Газовая хроматография-масс-спектрометрия (GCxGC-MS), являясь высокочувствительной и высокопроизводительной аналитической платформой, зарекомендовала себя как полезный инструмент для нецелевых исследований первичного метаболизма в различных областях применения [7]. Результаты анализа состава промежуточных соединений, полученных в ходе метаболизма бактерий, дают возможность сделать заключение о синтезе структур, обладающих биологической активностью.
Метаболомное исследование с применением метода GCxGC-MS представляет собой многоступенчатую процедуру. В связи с этим, стандартизация нецелевого протокола метаболомного профилирования методом GCxGC-MS требует комплексной оптимизации преданалитических, аналитических и вычислительных этапов. Основным отличием технологии GCxGC-MS от других аналитических платформ метаболомики, включая жидкостную хроматографию в тандеме с масс-спектрометрией (LC-MS), является необходимость дериватизации экстрактов метаболитов в летучие и термически стабильные производные, причем последние количественно определяются в метаболических профилях. Этот аналитический этап требует особой тщательности при оптимизации нецелевого экспериментального протокола исследования метаболома методом GCxGC-MS. Более того, для надежной идентификации и первичной количественной оценки обнаруженных метаболитов необходимо применять специализированные методики процесси-рования экспериментальных данных [7]. Данный метод позволяет селективно и с высокой чувствительностью обнаруживать и определять различные типы низкомолекулярных соединений в пробах сложного состава.
Цель исследования - c применением GCxGC-MS метода изучить структуру экзометаболитов бактерий штамма B. velezensis BZR336g при культивировании на питательных средах, различающихся по содержанию МЭ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования - оригинальный штамм бактерии B. velezensis BZR 336g из Биоресурсной коллекции Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр биологической защиты растений» (ФГБНУ ФНЦБЗР) «Государственная коллекция энтомоакарифагов и микроорганизмов» и перспективный для разработки на его основе биопрепарата для защиты растений от фитопатогенных грибов [8].
Культивирование штамма бактерии проводили на оптимизированной питательной среде (ОПС) с добавлением комплекса МЭ [9] и ОПС с добавлением комплекса МЭ с поочередным исключением целевых ионов металлов (Mn2+, Zn2+, Co2+). Схема эксперимента включала следующие варианты:
1 вариант - B. velenzensis BZR 336g (ОПС All) -Опытный образец биопрепарата на основе штамма B. velenzensis BZR 336g, культивируемый на ОПС с добавлением комплекса МЭ (С^*; I-; Mn2+; Mo6+; B3+; Co2+; Zn2+; Fe2+);
2 вариант - B. velenzensis BZR 336g (ОПС без Mn2+) - Опытный образец биопрепарата на основе штамма B. velenzensis BZR 336g, культивируемый на ОПС с добавлением комплекса МЭ за исключением Mn2+ (С^*; I-; Mo6+; B3+; Co2+; Zn2+; Fe2+);
3 вариант - B. velenzensis BZR 336g (ОПС без Zn2+)
- Опытный образец биопрепарата на основе штамма B. velenzensis BZR 336g, культивируемый на ОПС с добавлением комплекса МЭ за исключением Zn2+ (Сu2+; I-; Mn2+; Mo6+; B3+; Co2+; Fe2+);
4 вариант - B. velenzensis BZR 336g (ОПС без Co2+)
- Опытный образец биопрепарата на основе штамма B. velenzensis BZR 336g, культивируемый на ОПС с добавлением комплекса МЭ за исключением Co2+ (Сu2+; I-; Mn2+; Mo6+; B3+; Zn2+; Fe2+).
Жидкую культуру (ЖК) на основе штамма B. velenzensis BZR 336g получали методом периодического культивирования в ротационном шейкере-инкубаторе Excella E25 (New Brunswick Scientific, США) при 180 об/мин, + 25,0°С и рН 7,0 в течение 48 часов.
Для выделения биологически активных экзометаболитов штамма B. velenzensis BZR 336g, культивируемого на различных питательных средах, ЖК очищали от микробных компонентов центрифугированием в течение 20 мин. при 10000 об./мин. (Eppendorf AG, Германия). Повторность опыта трехкратная.
Выделение метаболитов из полученной культуральной жидкости проводили экстракцией этилацетатом (х.ч.) (2:1, об./об.) при перемешивании в ротационном шейкере-инкубаторе Excella E25 (New Brunswick Scientific, США) в течение 1ч. После разделения органической и водной части этилацетат упаривали досуха на ротационном вакуумном испарителе IKA RV 10 при температуре 40°С. Для анализа метаболомного профиля опытных образцов биопрепаратов методом GCxGC-MS использовали высушенный экстракт экзометаболитов, которые затем перерастворяли в 100 мл этилацетата (х.ч.) в течение
18 часов в шейкере-инкубаторе, поддерживая температуру 25°С.
Для того, чтобы избавиться от потенциальной контаминации сложными липидами и восками, высушенные экстракты перерастворяли в 500 мкл 50% раствора ацетонитрила, центрифугировали (13 000 g, 2 мин, 4°), и вновь высушивали надосадочную жидкость в центрифужном испарителе Vacufuge Plus (Eppendorf AG, Германия). Для выравнивания содержаний метаболитов проводили нормировку по количеству колониеобразующих единиц.
Для проведения хромато-масс-спектрометрии экзометаболитов использовали этилацетатный экстракт (5-10 мл ЖК). К каждому высушенному досуха образцу добавляли 10 мкл раствора гидрозлорида метоксиамина в пиридине (20 мг/мл) и далее перемешивали в течение 90 мин. в термошейкере ThermoMixer C (Eppendorf AG, Германия) при температуре 30°C. В качестве внутренних стандартов использовали смесь метиловых эфиров жирных кислот. После добавления силилирующего агента MSTFA и внутреннего стандарта к исследуемым образцам, пробирки с реакционной смесью перемешивали в течение 30 мин. в термошейкере при температуре 37°C, переносили в инактивированные стеклянные вставки и направляли на хромато-масс-спектрометрический анализ.
Непосредственно после высушивания образцы подвергали дериватизации.
Для метаболомного профилирования использовали прибор LECO Pegasus BT-4D (LECO, США). Конфигурация прибора включает двумерный газовый хроматограф Agilent 7890B, времяпролетный масс-спектрометр субноминального разрешения и магистральный пробоотборник L-PAL3. В рамках данного эксперимента использовали комбинацию
низкополярной (Rxi-5MS, длина 29,69 м, внутренний диаметр 250 мкм, Restek) и среднеполярной (Rxi-17Sil MS, длина 1,95 м, внутренний диаметр 250 мкм, Restek) хроматографических колонок. Хромато-масс-спектрометр управлялся с помощью ПО ChromaTOF (v.5.51.06.0.64572, (LECO, США)). Перед экспериментом проводили процедуру калибровки с помощью стандарта перфтортрибутиламина (PFTBA, FC43).
Эксперимент проводили в двух технических повторениях для каждого образца. Образец (1 мкл) подавался в хроматограф через нагретый до 250°C инжектор в split-режиме. Стартовая температура в хроматографической печи составляла 60°C и поддерживалась в течение минуты, далее начинался температурный градиент (10^/мин, 12 мин.). Период модуляции составлял 4 с. (горячий пульс - 1,2 секунды, холодный пульс - 0,8 секунды). Температура трансферной линии между газовым хроматографом и масс-спектрометром поддерживалась на уровне 280°C. Ионизацию элюирующих соединений осуществляли методом электронного удара (EI, 70 eV). Выдерживали 350-секундная отсрочка в записи GCxGC-MS файла для выхода неинформативных соединений (силилирующие агенты, пиридин) из хроматографической колонки.
Полученные хромато-масс-спектрометрические данные также обрабатывали в программе ChromaTOF Tile (LECO, США) - времена удерживания, величины m/z и интегрированные площади пиков корректировали. Для уменьшения многомерности экспериментальных данных применяли программное обеспечение ChromaTOF Tile (v.1.01, LECO, США), основанное на
использовании коэффициента Фишера. Принцип обработки этого программного обеспечения заключается в сравнении двух соответствующих областей хроматограммы (т.н. tiles) для обозначения находок низкой и высокой дисперсий. Диапазон анализируемых масс был ограничен m/z = 85 и m/z = 700. Метаболиты идентифицировали на основе их масс-спектров и времени удерживания с использованием библиотек Национального института стандартов и технологий (NIST), библиотек Mainlib и
Feihn, а также открытого репозитория PubChem в Национальном институте здравоохранения (NIH). Для дальнейшей интерпретации выбирали идентификации с показателями прямого и обратного сходства (similarity и reverse similarity) более 800 [10].
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
С помощью метода GCxGC-MS удалось обнаружить соединения, которые накапливались в ходе синтеза метаболитов бактериального штамма (табл. 1).
Таблица 1. Основные экзометаболиты штамма B. velezensis BZR 336g, Table 1. Major exometabolites of B. velezensis strain BZR 336g, detected
обнаруженные методом GCxGC-MS by GCxGC-MS_
Класс
Class
Подкласс
Subclass
a
кр
О -2 S О
1и
еи
Количественная оценка содержания метаболитов (относительные единицы) *
Quantification of metabolites content (relative units) *
к
а р
ОПС All OCM All
ОПС без Mn2+ OCM without Mn2+
ОПС без Zn2+ OCM without Zn2+
ОПС без Co2+ OCM without
Co2+
Карбоновые Аминокислоты,
кислоты и пептиды и аналоги
производные Amino acids, C4H9NO2 85 23 35 23 12
Carboxylic acids peptides, and
and derivatives analogues
Карбоновые Аминокислоты,
кислоты и пептиды и аналоги
производные Amino acids, C6H13NO2 86 3067 9128 16303 10015
Carboxylic acids peptides, and
and derivatives analogues
Карбоновые Аминокислоты,
кислоты и пептиды и аналоги
производные Amino acids, C3H7NO3 218 98 869 190 125
Carboxylic acids peptides, and
and derivatives analogues
Карбоновые Аминокислоты,
кислоты и пептиды и аналоги
производные Amino acids, C10H18N2O3 154 581 972 2096 1351
Carboxylic acids peptides, and
and derivatives analogues
Карбоновые Аминокислоты,
кислоты и пептиды и аналоги
производные Amino acids, C5H7NO3 156 478 2277 1280 3146
Carboxylic acids peptides, and
and derivatives analogues
Бензол и производные Benzene and derivatives Бензойные кислоты и производные Benzoic acids and derivatives C8H8O2 90 83 159 349 87
Бензол и Бензойные кислоты и
производные Benzene and derivatives производные Benzoic acids and derivatives C7H6O4 193 3973 1697 20782 3361
Бензол и производные Benzene and derivatives Бензойные кислоты и производные Benzoic acids and derivatives C7H6O3 269 4 0 131 32
Бензол и Бензойные кислоты и
Benzene and derivatives производные Benzoic acids and derivatives C7H7NO2 266 3696 6750 6679 1572
Бензол и Бензойные кислоты и
Benzene and derivatives производные Benzoic acids and derivatives C7H6O2 105 49873 274784 784745 663921
Бензол и производные Benzene and derivatives Бензойные кислоты и производные Benzoic acids and derivatives C7H6O3 267 571 753 4267 1612
Бензол и
производные Benzene and Бензонитрилы Benzonitriles C7H5NO 176 105 258 384 178
derivatives
Бензол и производные Benzene and derivatives Производные бензоила Benzoyl derivatives CsHsO 91 10257 28018 24191 4880
Бензол и производные Benzene and derivatives Производные бензоила Benzoyl derivatives C7H6O 135 895 1903 6033 2230
Бензол и производные Benzene and derivatives Производные бензоила Benzoyl derivatives CsHsO 121 489 1316 1152 263
Бензол и Бензиловые
производные Benzene and derivatives спирты Benzyl alcohols C7H8O2 179 32312 248709 483806 164416
Бензол и Бензиловые
производные Benzene and derivatives спирты Benzyl alcohols C7H8O 91 24463 233408 233082 191590
Бензол и
производные Benzene and Бензилцианиды Benzyl cyanides C8H7NO 190 19772 45278 61538 21254
derivatives
Бензол и
производные Benzene and Бензилтиоцианаты Benzyl thiocyanates C8H7NS 91 38 190 3029 710
derivatives
Жирные ацилы Fatty acyls Эфиры жирных кислот Fatty acid esters C10H18O2 127 52 59 55 420
Жирные кислоты и
Жирные ацилы Fatty acyls конъюгаты Fatty acids and conjugates C16H30O2 117 6805 36953 17063 8350
Жирные кислоты и
Жирные ацилы Fatty acyls конъюгаты Fatty acids and conjugates C4H6O2 147 4 11 12 8
Жирные кислоты и
Жирные ацилы Fatty acyls конъюгаты Fatty acids and conjugates C5H8O2 157 1065 2875 4139 1294
Жирные ацилы Fatty acyls Жирные кислоты и конъюгаты C6H8O2 169 408 146 6910 1013
Fatty acids and conjugates
Жирные ацилы Fatty acyls
Жирные кислоты и конъюгаты Fatty acids and conjugates_
C5H10O3
145 333 454 1003
668
Жирные ацилы Fatty acyls
Жирные кислоты и конъюгаты Fatty acids and conjugates
C5H8O2
172 4 10
26
Жирные ацилы Fatty acyls
Жирные кислоты и конъюгаты Fatty acids and conjugates
C14H26O2
129 4475 7894 6111 2116
Жирные ацилы Fatty acyls
Жирные кислоты и конъюгаты Fatty acids and conjugates
C10H20O2
117 2528 8411 8116 3464
Жирные ацилы Fatty acyls
Жирные кислоты и конъюгаты Fatty acids and conjugat1es_
C11H22O2
129 668 857 817
757
Жирные ацилы Fatty acyls
Жирные кислоты и конъюгаты Fatty acids and conjugates_
C12H24O2
117 4405 8739 8037 5394
Жирные ацилы Fatty acyls
Жирные кислоты и конъюгаты Fatty acids and conjugates
C17H34O2
117 56131 74155 48971 15998
Жирные ацилы Fatty acyls
Жирные кислоты и конъюгаты Fatty acids and conjugates
C16H32O2
117 97813 136849 105473 44689
Жирные ацилы Fatty acyls
Жирные кислоты и конъюгаты Fatty acids and conjugates
C6H12O2
159 12996 13839 57007 33537
Жирные ацилы Fatty acyls
Жирные кислоты и конъюгаты Fatty acids and conjugates_
C9H16O4
151 169 289 647
293
Жирные ацилы Fatty acyls
Жирные кислоты и конъюгаты Fatty acids and conjugates_
C18H36O2
117 13475 17135 12818 10253
Жирные ацилы Fatty acyls
Жирные кислоты и конъюгаты Fatty acids and conjugates
C8H16O2
117 6944 13268 25799 7647
Жирные ацилы Fatty Acyls
Жирные кислоты и конъюгаты Fatty acids and conjugates
C18H34O2
117 7131 31186 19287 13718
Жирные ацилы Fatty acyls
Жирные кислоты и конъюгаты Fatty acids and conjugates
11202
C15H30O2 117 139647 72406
8
39356
Жирные ацилы Fatty acyls
Жирные кислоты и конъюгаты Fatty acids and conjugates
C6H12O2
147 1986 5050 8830 4141
Жирные ацилы Fatty acyls
Жирные кислоты и конъюгаты Fatty acids and
C11H22O2
117 197 327 450
196
7
conjugates
Жирные ацилы Fatty acyls Жирные спирты Fatty alcohols C14H30O 97 9 10 13 6
Жирные ацилы Fatty acyls Амиды жирных кислот Fatty amides C18H35NO 86 132 1075 980 710
Примечание: * - интегрированные площади под хроматографическими пиками Note: * - integrated areas under chromatographic peaks
Среди идентифицированных соединений можно увидеть предшественники биологически активных метаболитов бактерий штамма B. velezensis BZR336g. Представители рода Bacillus считаются «микробными фабриками» по производству широкого спектра биологически активных молекул, потенциально подавляющих патогенные грибы и бактерии Bacillus spp., продуцирующие нерибосомно синтезированные липопептиды и пептиды, проявляют сильную антимикробную активность, которая основана на их химической структуре [11]. Липопептиды Bacillus состоят из липидного хвоста, связанного с коротким линейным или циклическим олигопептидом, и обладают очень сложными механизмами биосинтеза, катализируемого нерибосомными пептидными синтетазами, большими ферментными комплексами с модульной структурой, где каждый модуль отвечает за включение определенной аминокислоты. Молекулы известных липопептидов содержат от 4 до 16 аминокислотных остатков в L- или D-конфигурации. Семейство сурфактинов (сурфактин, лихенизин, пумилацидин, галобацилин, бамилоцин) представляет собой гептапептиды. Они включают ß-гидрокси-гептациклические депсипептиды с возможными вариациями аминокислот аланина, валина, лейцина или изолейцина в положениях 2, 4 и 7 в циклическом депсипептидном фрагменте и вариациями от Ci3 до Ci6 в цепях ß-гидроксижирных кислот. Фенгицин представляет собой циклический липодекапептид, содержащий ß-гидроксижирную кислоту с боковой цепью, состоящей из 16-19 атомов углерода. Он имеет различные изоформы, которые различаются длиной и разветвлением фрагмента ß-гидроксижирной кислоты, а также аминокислотным составом пептидного кольца. Гомологи фенгицина представляют собой серию липопептидов с вариациями как по длине, так и по разветвлению ß-гидроксижирной кислоты. Эти липопетиды продуцируются многими штаммами, которые были коммерциализированы как агенты биологической борьбы против грибных патогенов растений и как стимуляторы роста растений. Соединения представляют собой циклические гептапептиды с алкильной боковой цепью переменной длины, которая придает свойства поверхностной активности, что приводит к сродству с мембранами грибов. Итурины различаются по структуре, их различия заключаются в типе аминокислотных остатков, а также в длине и разветвлении цепи жирной кислоты. Гетерогенность по длине и разветвлению цепи жирных кислот четко демонстрируется итурином А, который имеет до 8 изомеров с 10-14 атомами углерода и различается конфигурациями цепи жирной кислоты.
Таким образом, прекурсорами метаболитов липопептидной природы являются жирные кислоты и их производные, а также пептидные соединения и аминокислоты. Поэтому среди соединений,
идентифицированных GCxGC-MS методом, мы анализируем жирные кислоты и их производные, а также пептиды и аминокислоты. Следует отметить, что жирные кислоты и их производные представлены значительным набором соединений, среди которых преобладают структуры С6, С10, С11, а также с наличием двойных связей между С=С атомами. Такие структуры соединений в наибольшей степени отражают потенциал бактерий для производства антимикробных метаболитов. Это связано с тем, что такие структуры, являясь предшественниками антимикробных соединений, более других способны в процессе метаболизма превращаться в биологически активные вещества. Если рассматривать роль присутствующих в питательной среде ионов металлов, то можно отметить в отдельных вариантах значение иона Со2+, когда его отсутствие в питательной среде приводит к снижению синтеза жирных кислот почти в 2 раза. Культивирование бактерии в питательной среде без Zn2+ влечет за собой уменьшение накопления жирных спиртов, в то время как на синтез других производных жирных кислот оказывает незначительное либо отрицательное влияние. На синтез пептидных составляющих наибольшее влияние оказывает присутствие в питательной среде ионов Мп2+ и Со2+, так как их количество уменьшается почти в два раза при отсутствии в питательной среде этих микроэлементов (табл. 1).
Анализ суммарного накопления жирных кислот и их аналогов, а также аминокислот и пептидов бактерией В. velezensis BZR336g на питательных средах, различающихся по содержанию ионов металлов, показывает, что ионы Со2+ в сочетании с ионами Мп2+ и Zn2+ играют важную роль в индуцировании их синтеза (рис. 1).
Тот факт, что ионы металлов выступают в роли индукторов продуцирования микроорганизмами биологически активных метаболитов, отмечался и другими авторами, при этом наиболее четко это отмечалось при одновременном присутствии двух-трех ионов металлов в питательной среде. Хотя в отдельных случаях одновременное влияние нескольких МЭ может давать обратный эффект [6]. Это можно отметить и для нашего исследования, когда для большинства изучаемых метаболитов присутствие в питательной среде ионов всех трех металлов зачастую приводит к снижению синтеза предшественников антигрибных метаболитов.
Соединения бензольной природы могут выступать в роли прекурсоров ароматических углеводородов, которые также представляют интерес при анализе метаболизма бактерий, так как они обладают антимикробной активностью. Синтез отдельных структур этих метаболитов так же индуцируется ионами Со2+ и Zn2+. При этом ионы Мп2+ ингибируют синтез некоторых из них. Суммарное
количество соединении этого класса значительно повышается, когда присутствуют ионы двух или нескольких металлов. В наибольшей степени такая
закономерность отмечается в вариантах, одновременно присутствуют ионы Со2+ и Zn2+.
когда
Ol «J in
I IQ
и re
с
3
ai £
(Л c
in о
ГО и
<L> Ul
> Ol
i .к
£ 1
" m
с го
™ Ш
а £
2000000 1500000 1000000 500000 0
Жирные ацилы / Fatty acyls
Аминокислоты, пептиды и аналоги/ Amino acids, peptides, analogues
Бензол и замещенные производные / Benzene andl substituted derivatives
I ОПС All/ОСМАН ОПС без Zn 2+ / OCM without Zn 2+
I ОПС без Mn 2+ / OCM without Mn 2+ ОПС без Co 2+ / OCM without Co 2+
Рисунок 1. Соотношение представленности основных классов экзометаболитов штамма B. velezensis BZR 336g Figure 1. Representation of major classes of B. velezensis strain BZR 336g exometabolites
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате анализа экзометаболитов перспективного штамма бактерий В. velezensis BZR336g методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией обнаружено, что на количество соединений, которые являются прекурсорами метаболитов липопептидной природы, влияет содержание ионов металлов в питательной среде. Это влияние может изменяться в зависимости от того, присутствуют металлы по одному или в сочетании друг с другом. Такая закономерность отмечается для всех трех анализируемых классов соединений. В наибольшей степени она проявляется в сочетаниях Мп2+ и Со2+, Zn2+ и Со2+ для жирных кислот и их аналогов, а также для аминокислот и пептидов. Для соединений бензольных структур это сочетание Со2+ и Zn2+. Полученные результаты дают возможность сделать вывод о содержании ионов металлов в питательной среде для оптимизации продуцирования биологически активных метаболитов, составляющих основу антимикробной активности будущего биопрепарата.
БЛАГОДАРНОСТЬ
1. Исследования выполнены при поддержке гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых - кандидатов наук № МК-1651.2021.5.
2. Авторы выражают благодарность ЦКП «Протеом человека» (ИБМХ) за выполнение масс-спектрометрических экспериментов. ACKNOWLEDGMENT
1. The research was supported by grant of the President of the Russian Federation for state support of young Russian scientists No. MK-1651.2021.5.
2. The authors are grateful to the Human Proteome Core Facility, Institute of Biomedical Chemistry (IBMC) for assistance with the generation of mass spectrometry data.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
1. Harwood C.R, Mouillon J.-M., Pohl S., Arnau J. Secondary metabolite production and the safety of industrially important members of the Bacillus subtilis group // FEMS Microbiology Reviews. 2018. V. 42. P. 721-738. DOI: 10.1093/femsre/fuy028
2. Сидорова Т.М., Асатурова А.М., Хомяк А.И. Биологически активные метаболиты Bacillus subtilis и их роль в контроле фитопагенных микроорганизмов (обзор) // Сельскохозяйственная биология. 2018. Т. 53. С. 29-37. DOI: 10.15389/agrobiology.2018.1.29rus
3. Максимов И.В., Черепанова Е.А., Бурханова Г.Ф., Хайруллин Р.М., Сингх Б.П. Перспективы применения бактерий - продуцентов липопептидов для защиты растений (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 2020. Т. 56. С. 19-34. DOI: 10.31857/S0555109920010134
4. Fira D., Dimkic I., Beric T., Lozo J., Stankovic S. Biological control of plant pathogens by Bacillus species // Journal of biotechnology. 2018. V. 285. P. 44-55. DOI: 10.3389/fmicb.2017.00925
5. Dubey M.K., Meena M., Aamir M., Zehra A., Upadhyay R.S. Regulation and role of metal ions in secondary metabolite production by microorganisms // New and future developments in microbial biotechnology and bioengineering. 2019. P. 259-277.
DOI: 10.1016/B978-0-444-63504-4.00019-0
6. de Oliveira Schmidt V.K., de Souza Carvalho J., de Oliveira D., de Andrade C.J. Biosurfactant inducers for enhanced production of surfactin and rhamnolipids: an overview // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2021. V. 37. N 21. P. 27-43. DOI: 10.1007/s11274-020-02970-8
7. Papadimitropoulos, ME.P., Vasilopoulou, C.G., Maga-Nteve, C., Klapa, M.I. Untargeted GC-MS Metabolomics. In: Theodoridis, G., Gika, H., Wilson, I. (eds). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology. 2018. V. 1738. Humana Press, New York, NY. DOI: 10.1007/978-1-4939-7643-0_9
8. Асатурова А.М., Дубяга В.М. Штамм бактерий Bacillus subtilis для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов: пат. 2553518 Рос. Федерация № RU2013151377/10A. Заявл. 20.11.2013; опубл. 20.06.2015.
9. Asaturova A.M., Gyrnets E.A., Allakhverdian V.V., Astakhov M.M., Saenko K.U. The study of the antifungal activity of the Bacillus subtilis BZR 336g strain under the conditions of periodic cultivation with the addition of citric acid, corn extract and some microelements // XI International Scientific and Practical Conference «Biological Plant Protection is the Basis of Agroecosystems Stabilization». 2020. V. 21. P. 9. DOI: 10.1051/bioconf/20202100015
10. Koek M.M., Jellema R.H., van der Greef J. et al. Quantitative metabolomics based on gas chromatography mass spectrometry: status and perspectives // Metabolomics. 2011. V. 7. P. 307-328. DOI: 10.1007/s11306-010-0254-3
11. Сидорова Т.М., Асатурова А.М., Аллахвердян В.В. Особенности антагонизма бактерий рода Bacillus по отношению к грибам Fusarium при защите от болезни и контаминации микотоксинами // Юг России: экология, развитие. 2021. Т. 16. N 4. С. 86-103. DOI: 10.18470/19921098-2021-4-86-103
REFERENCES
1. Harwood C.R., Mouillon J.-M., Pohl S., Arnau J. Secondary metabolite production and the safety of industrially important members of the Bacillus subtilis group FEMS. Microbiology Reviews, 2018, vol. 42, pp. 721-738. DOI: 10.1093/femsre/fuy028
2. Sidorova T.M., Asaturova A.M., Homyak A.I. Biologically active metabolites of Bacillus subtilis and their role in the control of phytopathogenic microorganisms
(review). Agricultural Biology, 2018, vol. 53, no. 1, pp. 29-37. (In Russian) DOI: 10.15389/agrobiology.2018.1.29rus
3. Maksimov I.V., Cherepanova E.A., Burkhanova G.F., Khairullin R.M., Singkh B.P. Prospects and applications of lipopeptide-producing bacteria for plant protection (review). Applied Biochemistry and Microbiology, 2020, vol. 56, no. 1, pp. 19-34. (In Russian) DOI: 10.31857/S0555109920010134
4. Fira D., Dimkic I., Beric T., Lozo J., Stankovic S. Biological control of plant pathogens by Bacillus species. Journal of biotechnology, 2018, vol. 285, pp. 44-55. DOI:
КРИТЕРИИ АВТОРСТВА
Наталья С. Томашевич разработала научный дизайн, концепцию и написала статью. Татьяна М. Сидорова разработала концепцию, проанализировала и интерпретировала материал, написала статью. Валерия В. Аллахвердян собрала материал. Анжела М. Асатурова разработала научный дизайн, корректировала рукопись до подачи в редакцию. Ольга И. Киселева и Илья Ю. Курбатов провели эксперименты, обработали экспериментальные данные. Все авторы в равной степени несут ответственность при обнаружении плагиата, самоплагиата или других неэтических проблем.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
5. Dubey M.K., Meena M., Aamir M., Zehra A., Upadhyay R.S. Regulation and role of metal ions in secondary metabolite production by microorganisms. New and future developments in microbial biotechnology and bioengineering, 2019, pp. 259277. DOI: 10.1016/B978-0-444-63504-4.00019-0
6. de Oliveira Schmidt V.K., de Souza Carvalho J., de Oliveira D., de Andrade C.J. Biosurfactant inducers for enhanced production of surfactin and rhamnolipids: an overview. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2021, vol. 37, no. 21, pp. 27-43. DOI: 10.1007/s11274-020-02970-8
7. Papadimitropoulos ME.P., Vasilopoulou C.G., Maga-Nteve C., Klapa M.I. Untargeted GC-MS Metabolomics. In: Theodoridis G., Gika H., Wilson I. (eds). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology. 2018, vol 1738. Humana Press, New York, NY. DOI: 10.1007/978-1-4939-7643-0_9
8. Asaturova A.M., Dubyaga V.M. Shtamm bakterii Bacillus subtilis dlya polucheniya biopreparata protiv fitopatogennykh gribov [Bacillus subtilis bacterial strain for obtaining a biological product against phytopathogenic fungi]. Patent RF N RU2013151377/10A (In Russian)
9. Asaturova A.M., Gyrnets E.A., Allakhverdian V.V., Astakhov M.M., Saenko K.U. The study of the antifungal activity of the Bacillus subtilis BZR 336g strain under the conditions of periodic cultivation with the addition of citric acid, corn extract and some microelements. XI International Scientific and Practical Conference «Biological Plant Protection is the Basis of Agroecosystems Stabilization», 2020, vol. 21, p. 9. DOI: 10.1051/bioconf/20202100015
10. Koek M.M., Jellema R.H., van der Greef J. et al. Quantitative metabolomics based on gas chromatography mass spectrometry: status and perspectives. Metabolomics, 2011, vol. 7, pp. 307-328. DOI: 10.1007/s11306-010-0254-3
11. Sidorova T.M., Asaturova A.M., Allakhverdyan V.V. Specific features of antagonism of Bacillus bacteria against toxinogenic Fusarium fungi in protecting plants against disease and contamination with mycotoxins (review). South of Russia: ecology, development, 2021, vol. 16, no. 4, pp. 86-103. (In Russian) DOI: 10.18470/1992-1098-2021-4-86-103
AUTHOR CONTRIBUTIONS
Natalia S. Tomashevich participated in the scientific design, concept development and writing of the article. Tatiana M. Sidorova undertook analysis, interpretation and development of the scientific material and participated in the writing of the article. Valeria V. Allahverdyan collected material. Anzhela M. Asaturova participated in the scientific design and proofread the manuscript before submission to the Editor. Olga I. Kiseleva and Ilya Yu. Kurbatov conducted experiments and processed experimental data. All authors are equally responsible for plagiarism, self-plagiarism and other ethical transgressions.
NO CONFLICT OF INTEREST DECLARATION
The authors declare no conflict of interest.
10.3389/fmicb.2017.00925
ORCID
Наталья C. Томашевич / Natalia S. Tomashevich http://orcid.org/0000-0002-7297-5929
Татьяна М. Сидорова / Tatiana M. Sidorova http://orcid.org/0000-0003-4281-5278
Ольга И. Киселева / Olga I. Kiseleva http://orcid.org/0000-0003-3032-1983
Илья Ю. Курбатов / Ilya Yu. Kurbatov https://orcid.org/0000-0002-3704-092
Валерия В. Аллахвердян / Valeria V. Allahverdyan http://orcid.org/0000-0002-8679-6139
Анжела М. Асатурова / Anzhela M. Asaturova http://orcid.org/0000-0002-0060-1995
