CC BY
39
© Коллектив авторов, 2019
Донецкова А. Д.1, 2, Шарова Н.И.1, Никонова М.Ф.1, Литвина М.М.1, Комогорова В.В.1, Митин А.Н.1
Изучение роли ИЛ-7 в восстановлении численности Т-клеток после индукции лимфопении в отсутствие тимопоэза у мышей
1 ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115522, г. Москва, Россия
2 ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, 117997, г. Москва, Россия
Резюме. В работе исследовано влияние ИЛ-7 на динамику восстановления пула Т-клеток после индукции лимфопении у тимэктомированных мышей. Показано, что введение реком-бинантного ИЛ-7 в отсутствие тимопоэза неспособно компенсировать недостаточность регенерации периферического отдела Т-клеточного звена иммунной системы при лим-фопении, индуцированной сублетальным облучением. Повышение уровня гомеостати-ческой пролиферации на фоне введения рекомбинантного ИЛ-7 в отсутствие поступления Т-клеток из тимуса ведет к усилению конверсии фенотипа оставшихся радиорезистентных наивных Т-лимфоцитов в фенотип центральных T-клеток, относительному накоплению последних и, возможно, гибели части активно пролиферирующих Т-клеток. Следствием развивающихся событий может стать резкое сужение репертуара Т-клеточных рецепторов, нарушение полноценного иммунного надзора и развитие онкологических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний.
Ключевые слова: Т-лимфоциты; Т-клетки памяти; лимфатические узлы; селезенка; костный мозг; ИЛ-7; ионизирующая радиация; регенерация; проточная цитометрия
Статья поступила 09.07.2019. Принята в печать 16.08.2019.
Для цитирования: Донецкова А.Д., Шарова Н.И., Никонова М.Ф., Литвина М.М., Комогорова В.В., Ми-тин А.Н. Изучение роли ИЛ-7 в восстановлении численности Т-клеток после индукции лимфопении в отсутствие тимопоэза у мышей. Иммунология. 2019; 40 (5): 29-43. doi: 10.24411/0206-4952-2019-15004.
Финансирование. Работа проведена в рамках госзадания ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России на 2018 г. по теме: «Генетический контроль радиочувствительности и механизмы пострадиационного восстановления иммунной системы».
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Donetskova A.D.1, 2, Sharova N.I.1, Nikonova M.F.1, Litvina M.M.1, Komogorova V.V.1, Mitin A.N.1
Role of IL-7 in T-cell regeneration after lymphopenia induction in thymectomized mice
1 NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, 115522, Moscow, Russia
2 Pirogov Russian National Research Medical University (RNRMU), Ministry of Health of Russian Federation, 117997, Moscow, Russia
Abstract. We investigated the effect of IL-7 on the T cell regeneration after lymphopenia induction in thymectomized mice. We showed that the recombinant mouse interleukin-7 administration in thymectomized mice was not able to compensate for the weak peripheral T cell regeneration during lymphopenia induced by sublethal irradiation. Administration of recombinant IL-7 without T cells from the thymus induced increase of the homeostatic proliferation and the phenotype conversion of the remaining radioresistant naive T-lymphocytes into central memory-phenotype T cells, the relative accumulation of the memory-phenotype T cells and possibly death of a part of actively-proliferating T cells. As a result of that events might be a progressive narrowing of T cell receptor repertoires, impaired immune surveillance and the development of cancer, autoimmune and infectious diseases.
Для корреспонденции
Донецкова Альмира Дмитриевна -доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории дифференцировки лимфоцитов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, доцент кафедры иммунологии ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва, Россия E-mail: almira_donetskova@yahoo.com http://orcid.org/0000-0003-2465-2444
For correspondence
Donetskova Almira D. - MD, PhD, Lead Researcher of Laboratory of Lymphocyte Differentiation, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Associate Professor of Immunology Department, Pirogov Russian National Research Medical University (RNRMU), Ministry of Health of Russian Federation, Moscow, Russia E-mail: almira_donetskova@yahoo.com http://orcid.org/0000-0003-2465-2444
Keywords: T-lymphocytes; memory T-cells; lymph nodes; spleen; bone marrow; IL-7; ionizing radiation; regeneration; flow cytometry
Received 09.07.2019. Accepted 16.08.2019.
For citation: Donetskova A.D., Sharova N.I., Nikonova M.F., Litvina M.M., Komogorova V.V., Mitin A.N. Role of IL-7 in T-cell regeneration after lymphopenia induction in thymectomized mice. Immunologiya. 2019; 40 (5): 29-43. doi: 10.24411/0206-4952-2019-15004.
Funding. The work was carried out within the framework of the state task of the NRC Institute of Immunology FMBA of Russia for 2018 on the topic: "Genetic control of radiosensitivity and mechanisms of bacterial recovery of the immune system".
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Введение
Многие вопросы, связанные с восстановительными процессами в Т-клеточной популяции, были рассмотрены еще в 1970-е годы [1, 2]. Однако системное изучение гомеостатических процессов в лимфоидной ткани началось на рубеже 1980-1990-х годов. Тогда было установлено, что лимфопения различного генеза ведет к усилению гомеостатической пролиферации - пролиферации периферических лимфоцитов в отсутствие контакта с антигеном - и частичному восстановлению численности лимфоцитов. В опытах с повторными пассажами Т-клеток в лимфопеническое окружение было показано их многократное увеличение, которое в отдельных экспериментах в 1015 раз превышало изначальный уровень [3]. Позже была установлена роль интерлейкина-7 (ИЛ-7) в этом процессе. В модели лим-фопении на мышах было показано, что гомеостати-ческая пролиферация не запускалась при переносе мышам дикого типа Т-клеток без рецептора к ИЛ-7, а также нормальных Т-клеток мышам, нокаутированным по гену 1Ь7 [4]; в обоих случаях трансплантированные Т-клетки погибали в течение 2-4 нед. Для наивных Т-клеток была установлена роль распознавания Т-клеточным рецептором (ТКР) комплексов аутологич-ных МНС с пептидом [5]; включение гомеостатической пролиферации происходило при субоптимальной стимуляции Т-клеточного рецептора [6]. Таким образом, в состоянии покоя жизнеспособность наивных Т-клеток поддерживается синергией слабых сигналов от ТКР при контакте с собственными комплексами МНС-пептид и антиапоптотических сигналов, индуцированных ИЛ-7. Объем фоновой активации через ТКР не достигает уровня, необходимого для вхождения в клеточный цикл.
Костимуляция высокими дозами (или относительно высокими дозами в условиях лимфопении) ИЛ-7 или других цитокинов, рецепторы которых имеют общую у-цепь, может индуцировать гомеостатическую пролиферацию наивных Т-лимфоцитов. Усиление гомеостатической пролиферации сопровождается конверсией фенотипа наивных Т-клеток в фенотип Т-клеткок памяти [79]. Этот феномен состоит в том, что наивные Т-клетки, вступившие в активное деление, выходят из него измененными, на их поверхности экспрессируется молекула СБ44, служащая у мышей маркером Т-клеток памяти.
Поскольку при этом наивные Т-клетки не утрачивают маркера СБ62Ь, фенотипически (СВ62ЬЫ®ЬСБ44Ы®Ь) они оказываются идентичными центральным Т-клеткам памяти [7, 10, 11], но, в отличие от центральных Т-клеток памяти, они не проходят стадию специфической активации антигеном и формирования эффекторных Т-клеток [7]. Это превращение сопровождается функциональными изменениями, в частности у них снижен порог индукции эффекторных функций. Одновременно с конверсией фенотипа Т-клеток происходит смена хе-мокиновых рецепторов, что обусловливает изменение путей их рециркуляции. По своим миграционным характеристикам эти клетки также оказываются практически идентичными центральным Т-клеткам памяти [12], не выполняя при этом защитных функций в силу своей поликлональности и неспецифичности к таргетным антигенам, поэтому их иногда называют суррогатными Т-клетками памяти [13].
В настоящее время механизмы данных явлений изучает ограниченное число научных коллективов. В данной работе исследована способность ИЛ-7 влиять на регенерацию периферических Т-лимфоцитов, гомео-статическую пролиферацию и конверсию фенотипа наивных Т-клеток при индуцированной пострадиационной лимфопении у тимэктомированных животных -в условиях, исключающих влияние тимопоэза на процесс восстановления периферического звена Т-клеточ-ной иммунной системы.
Материал и методы
В исследовании были использованы мыши линии С57БЬ/6, самки весом 18-20 г, полученные из питомника «Столбовая» (ФЛ «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России). Все манипуляции с экспериментальными мышами проводились в строгом соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (БТ8 N123).
В возрасте 7-8 нед мыши были тимэктомированы. Ти-мэктомию проводили с помощью вакуумного отсоса под общей анестезией. Для анестезии мышам внутрибрю-шинно вводили 10 мкл 10% раствора золетила и 5 мкл 2% раствора ксилы в 185 мкл стерильной дистиллированной воды. Через 1 мес после тимэктомии (восстановительный период) мышей подвергали воздействию у-излучения
137Cs на установке «Стебель» в дозе 4 Гр (сублетальная доза облучения). На следующий после облучения день мышам вводили рекомбинантный ИЛ-7 мыши (R&D Systems) внутрибрюшинно в дозе 1 мкг/мышь. Введение ИЛ-7 повторяли еженедельно. Забой мышей и исследование лимфоидных органов проводили через 5, 10, 20, 30 и 60 сут после облучения. Контролем служили тимэк-томированные облученные в те же сроки мыши без введения ИЛ-7 и интактные мыши соответствующего возраста. В каждой точке исследования было использовано по 7 мышей в опытной и контрольных группах.
Селезенку и лимфатические узлы (по 2 подмышечных, 2 плечевых и 2 паховых) извлекали, освобождали от соединительной ткани. Выделенные органы измельчали, клетки суспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР) («ПанЭко», Россия) с 1% BSA (Sigma, США) и 0,1% NaN3 (Sigma, США), эритроциты селезенки удаляли с помощью лизирующего буфера (eBioscience, США). Клетки костного мозга (КМ) получали из 4 костей (2 бедренных и 2 большеберцовых), промывая их ФСБР под давлением с помощью шприца, далее их обрабатывали аналогично суспензии клеток, полученной из селезенки. Численность клеток в органе определяли путем подсчета в камере Горяева. Жизнеспособность клеток после выделения превышала 95% (методом эксклюзии 0,1% раствора трипанового синего).
В полученных суспензиях клеток методом проточной цитометрии определяли процент и абсолютное содержание Т-хелперов - CD3+CD4+, цитотокси-ческих Т-лимфоцитов (ЦТЛ) - CD3+CD8+, регулятор-ных Т-клеток (Грег) - CD3+CD4+CD25+Foxp3+, возрастной фенотип Т-хелперов и ЦТЛ (по особенностям со-экспрессии маркеров CD44 и CD62L [9, 11, 14]), уровень спонтанной пролиферации по экспрессии внутриклеточного маркера пролиферации Ki-67.
Для проточной цитометрии клетки инкубировали с моноклональными антителами к поверхностным маркерам в течение 30 мин при 4 °С. Затем клетки отмывали и пермеабилизировали в течение 40 мин буфером фирмы eBioscience (США) (Foxp3 Fixation/Permeabilization Buffer), согласно методическим указаниям фирмы, повторно отмывали и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте с моноклональными антителами против Ki-67 или Foxp3, снова отмывали и сразу анализировали на проточном цитометре. Учитывая минорность фракции Трег, для уменьшения ошибки анализировали >105 клеток, попадающих в гейт лимфоцитов. Лазерную цитометрию клеток осуществляли на проточном цитометре BD FACSCanto™ II (Becton Dickinson) в стандартном режиме. Анализ данных проводили с помощью программного обеспечения FlowJo (Treestar).
Использовали следующие комбинации моно-клональных антител фирмы eBioscience (США) (препараты для изотипических контролей той же фирмы):
1. Анти-CD3 -FITC + анти-CD4-PerCP-Cy5.5 + анти-CD8-APC-eFluor780 + анти-CD44-PE-Cy7 + анти-œ62L-PE + анти-Кь67-АРС
2. Анти-СБ3-Р1ТС + анти-СБ4-РегСР-Су5.5 + анти-СБ25-АРС + анти-Рохр3-РБ.
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием методов непараметрического анализа. Исследованные показатели представляли в виде Ме (Ь-В), где Ме - медиана, Ь - нижний квартиль, Н - верхний квартиль. Для сопоставления двух групп по количественным признакам использовали непараметрический ^/-критерий Манна-Уитни. Различие групп считали статистически значимым при р < 0,05. Обработку проводили в программном пакете ЗгагЗойЗгайзйса 12.0.
Результаты и обсуждение
Роль ИЛ-7 в восстановительном процессе периферического отдела Т-клеточного иммунитета изучали на модели сублетально облученных тимэктомированных мышей линии С57БЬ/6. Удаление тимуса за 1 мес до облучения позволяло исключить вклад тимуса в восстановление периферических Т-лимфоцитов. КМ в проведенном исследовании рассматривался в качестве как центрального, так и периферического лимфоидного органа, поскольку изучалось Т-клеточное звено иммунитета, по отношению к которому КМ является периферической клеточной нишей.
На первом этапе работы оценили субпопуляционный состав, возрастной фенотип и уровень спонтанной пролиферации Т-лимфоцитов в периферических лимфо-идных органах и КМ через 1 мес после тимэктомии.
Во всех лимфоидных органах отмечено снижение численности Т-клеток относительно показателей интактных мышей соответствующего возраста (рис. 1, табл. 1): в селезенке - в 1,2 раза, в лимфатических узлах - в 1,5 раза, в КМ - в 2,6 раза. Развивающаяся Т-лимфопения в равной степени затрагивала
1,2
1,0
0,8
0,6 —
M -- =-
Е
0,0 — * I I
ш
Все Т-клетки
CD4+-Т-клетки
CD8+- CD4-CD8--Т-клетки Т-клетки
□ Лимфатические узлы □ Селезенка
Трег
I КМ
Рис. 1. Численность основных Т-клеточных субпопуляций в лимфоидных органах тимэктомированных мышей, нормализованная к показателям интактных мышей
Таблица 1. Численность основных субпопуляций Т-лимфоцитов в лимфоидных органах тимэктомированных и интактных мышей, млн
Группа Орган CD3+ С03+С04+ 003+008+ С03+С04-С08- С03+С04+С025+Еохр3+
Интактные Селезенка 33,5 17,4 10,9 2,4 2,2
(п = 4) (28,7-36,5) (14,1-21,6) (9,2-13,1) (2,0-5,0) (1,9-2,6)
Лимфатические 9,8 5,4 4,0 0,4 0,6
узлы (8,8-12,7) (4,8-6,5) (3,6-5,6) (0,3-0,6) (0,5-0,7)
КМ 5,1 1,4 2,5 1,1 н.д.
(4,7-5,8) (1,4-1,6) (2,3-3,0) (1,0-1,2)
После Селезенка 28,3 16,1 9,2 2,6 1,7
тимэктомии (15,7-34,3) (8,4-19,8) (5,6-11,0) (1,7-3,5) (1,0-2,0)
(п = 8) Лимфатические 6,5* 3,2* 2,8* 0,3 0,4
узлы (3,6-7,8) (1,9-3,9) (1,5-3,3) (0,2-0,5) (0,2-0,5)
КМ 2,0** 0,5** 1,0** 0,5** н.д.
(1,8-2,1) (0,4-0,5) (0,9-1,0) (0,5-0,5)
Примечание. Здесь и в табл. 2-4: * -р < 0,05; ** -р < 0,01 по сравнению с интактными мышами.
все основные субпопуляции. Численность Т-хелперов в селезенке уменьшилась в 1,1 раза, в лимфатических узлах - в 1,7 раза, в КМ - в 3,1 раза. Количество ЦТЛ снизилось в селезенке в 1,2 раза, в лимфатических узлах - в 1,5 раза и в КМ - в 2,7 раза. Все отличия в лимфатических узлах и КМ были статистически значимыми (р < 0,05), а в селезенке - статистически недостоверными (р > 0,05). В КМ тимэктомия тоже приводила к значимому (в 2,1 раза) снижению числа СВ3+СВ4-СБ8--клеток, составляющих большую часть Т-лимфоцитов КМ. Численность Трег в лимфатических узлах и селезенке снизилась после тимэктомии пропорционально снижению всей Т-клеточной популяции, но эта разница не была статистически значимой.
Таким образом, тимэктомия приводила к пропорциональному снижению численности основных субпопуляций Т-лимфоцитов во всех лимфоидных органах и их перераспределению с преимущественным заселением селезенки.
Также мы оценили возрастную структуру Т-хелперов и ЦТЛ у тимэктомированных животных. С этой целью исследовали возрастной фенотип Т-клеточных субпопуляций по коэкспрессии поверхностных маркеров СБ44
и СБ62Ь: наивные Т-клетки (Тпагге) - СВ62Ь+СВ441отт; центральные Т-клетки памяти (Теш) - СБ62Ь+СБ44Ы811; эффекторные Т-клетки памяти (Теш) - СБ62Ь-СБ44Ы811 и терминально-дифференцированные Т-клетки (Т1ф -СВ62ЬСБ4410*. Так как задача нашего исследования -изучить механизмы Т-клеточного гомеостаза в условиях лимфопении, наибольший интерес для нас представляли наивные Т-клетки и центральные Т-клетки памяти, на анализе которых мы и сосредоточили свое внимание (табл. 2 и 3).
В КМ снижение всех возрастных субпопуляций Т-клеток было пропорциональным и не изменило их соотношение. В селезенке доля наивных Т-хелперов снизилась с 42,7 до 28,6%, а наивных ЦТЛ - с 55,6 до 32,7%, но только последний показатель был статистически значимым. В лимфатических узлах снижение доли наивных Т-клеток было статистически значимым по сравнению с показателем интактных мышей как среди Т-хелперов, так и среди ЦТЛ и составило 63,4 против 75,7% для Т-хелперов и 69,1 против 77,2% для ЦТЛ. Уменьшение доли наивных Т-клеток обусловлено исключительно снижением их абсолютного количества (для Т-хелперов лимфатических узлов и ЦТЛ во всех
Таблица 2. Доля наивных и центральных Т-клеток памяти среди СБ4+- и СБ8+-Т-лимфоцитов в лимфоидных органах тимэкто-мированных и интактных мышей, %
Группа Орган Тпагуе/С03+С04+ Тст/С03+С04+ Тпагуе/С03+С08+ Тст/С03+С08+
Интактные Селезенка 42,7 7,5 55,6 20,0
(п = 4) (28,8-44,9) (6,2-7,6) (47,4-58,0) (17,7-20,5)
Лимфатические 75,7 4,5 77,2 16,2
узлы (71,3-77,2) (3,7-5,1) (76,7-79,2) (15,2-17,2)
КМ 8,6 7,2 11,5 18,3
(7,8-9,1) (6,3-8,1) (10,3-12,8) (16,1-21,5)
После Селезенка 28,6 5,9 32,7* 22,6
тимэктомии (24,4-33,7) (4,5-6,2) (29,5-42,9) (17,6-25,4)
(п = 8) Лимфатические 63,4* 5,1 69,1** 22,6*
узлы (61,3-64,2) (3,9-6,1) (66,8-72,6) (18,2-25,1)
КМ 6,7 5,9 8,1 27,8
(5,0-7,1) (4,8-7,3) (7,4-10,7) (24,0-28,5)
Таблица 3. Численность наивных и центральных Т-клеток памяти в лимфоидных органах тимэктомированных и интактных мышей, млн
Группа Орган CD3CD4naive CD3+CD4+cm CD3CD8+naive CD3+CD8+cm
Интактные (n = 4) Селезенка 7,6 (4,5-9,2) 1,3 (0,9-1,6) 5,9 (5,1-6,4) 2,1 (1,9-2,3)
Лимфатические узлы 4,1 (3,7-4,6) 0,2 (0,2-0,3) 3,1 (2,9-4,3) 0,7 (0,6-0,9)
КМ 0,12 (0,12-0,13) 0,11 (0,09-0,12) 0,32 (027-0,34) 0,48 (0,45-0,52)
После тимэктомии (П = 8) Селезенка 4,4 (2,2-6,3) 0,9 (0,4-1,1) 2,7* (1,7-4,4) 1,8 (1,2-2,2)
Лимфатические узлы 2,0** (1,3-2,4) 0,2 (0,1-0,2) 1 9** (1,1-2,2) 0,6 (0,3-0,8)
КМ 0,03** (0,02-0,03) 0,03** (0,02-0,03) 0,09** (0,07-0,11) 0,25** (0,23-0,28)
периферических лимфоидных органах изменения были статистически значимыми) и не сопровождалось ростом числа центральных Т-клеток памяти. Даже в случае статистически значимого увеличения доли ЦТЛ с фенотипом центральных клеток памяти в лимфатических узлах не отмечено роста их абсолютного количества.
Полученные данные свидетельствовали о том, что развивавшаяся после удаления тимуса Т-лимфопения не сопровождалась конверсией фенотипа наивных Т-клеток в Т-клетки памяти, которая обычно сопровождает процесс восстановления численности Т-клеток при повышении уровня их гомеостатической пролиферации, которую мы в свою очередь оценили по уровню экспрессии внутриклеточного маркера пролиферации Кт-67. Оказалось, что доля К1-67+-клеток среди всех возрастных субпопуляций как Т-хелперов, так и ЦТЛ не только не повышалась, но и в случае наивных Т-хелперов даже была статистически значимо снижена (табл. 4).
Таким образом, мы установили, что тимэктомия у мышей линии С57БЬ/6 приводила к развитию дефицита всех периферических Т-клеток в основном за счет наивных Т-лимфоцитов. При этом развивавшаяся Т-лимфопения не вела к компенсаторному усилению гомеостатической пролиферации Т-клеток и конверсии фенотипа наивных Т-клеток в центральные Т-клетки памяти в отсутствие контакта с антигеном.
На следующем этапе работы исследовали влияние ИЛ-7 на динамику восстановления пула Т-клеток после
индукции лимфопении у тимэктомированных мышей у-облучением в сублетальной дозе. ИЛ-7 вводили 1 раз в неделю внутрибрюшинно в дозе 1,0 мкг на мышь начиная с 1-х суток после облучения. Полученные данные по содержанию основных субпопуляций Т-лимфоцитов во вторичных лимфоидных органах и КМ тимэктомиро-ванных сублетально облученных мышей представлены в табл. 5, 6 и 7.
После сублетального облучения тимэктомирован-ных мышей имевшаяся у них Т-лимфопения усугубилась - численность Т-клеточных субпопуляций снизилась к 5-м суткам в лимфатических узлах c 60 до 10% от уровня интактных мышей для Т-хелперов, с 68 до 7% для ЦТЛ и с 64 до 12% для Трег, а в селезенке -с 93 до 52%, с 84 до 37% и с 79 до 33% соответственно (рис. 2). Все изменения были статистически значимыми по сравнению с тимэктомированными необлученными мышами (p < 0,05). Дальнейшая динамика восстановления периферических Т-клеток носила волнообразный характер и к 60-м суткам, последнему дню наблюдения, достигала 11% для Т-хелперов, 10% для ЦТЛ и 12% для Трег от уровня интактных мышей в лимфатических узлах и соответственно 44, 62 и 42% в селезенке. На 60-е сутки все отличия также были статистически значимыми в сравнении с тимэктомированными необ-лученными мышами (p < 0,05, см. рис. 2). Таким образом, выраженная пострадиационная Т-лимфопения в большей степени затрагивала лимфатические узлы,
Таблица 4. Доля пролиферирующих (Ki-67+) наивных и центральных Т-клеток памяти среди Т-хелперов и цитоксических Т-лимфоцитов в лимфоидных органах тимэктомированных и интактных мышей, %
Группа Орган CD3+CD4+naive CD3+CD4+cm CD3+CD8+naive CD3+CD8+cm
Интактные (n = 4) Селезенка 2,7 (2,6-3,7) 20,4 (19,7-27,7) 5,1 (4,8-5,5) 15, (13,5-17,2)
Лимфатические узлы 2,2 (2,0-2,3) 25,1 (23,1-26,2) 3,7 (3,5-3,9) 13,8 (12,5-14,0)
После тимэктомии (n = 8) Селезенка 3,1 (2,8-3,3) 26,2 (23,1-27,7) 4,8 (4,2-5,3) 16,6 (15,0-17,8)
Лимфатические узлы 1,4* (1,2-1,5) 22,7 (17,6-25,7) 3,9 (3,7-4,7) 12,6 (12,4-13,7)
Таблица 5. Абсолютное содержание основных субпопуляций Т-лимфоцитов в лимфатических узлах тимэктомированных суб-летально облученных мышей, млн
Параметр 5 сут 10 сут 20 сут 30 сут 60 сут
Группа без введения ИЛ-7
Количество мышей 6 6 6 6 6
CD3+CD4+ 0,5 (0,4-0,6) 0,4 (0,3-0,6) 0,9 (0,3-1,3) 0,6 (0,4-1,1) 0,6 (0,3-0,8)
CD3+CD8+ 0,3 (0,2-0,4) 0,2 (0,1-0,3) 0,6 (0,2-0,9) 0,4 (0,4-0,8) 0,4 (0,2-0,6)
CD3+CD4+25+Foxp3+ 0,1 (0,1-0,1) 0,1 (0,0-0,1) 0,1 (0,1-0,2) 0,1 (0,1-0,2) 0,1 (0,1-0,1)
Группа с еженедельным введением ИЛ-7
Количество мышей 7 7 7 7 7
CD3+CD4+ 0,5 (0,38-0,7) 0,7* (0,6-0,8) 0,6 (0,5-0,7) 1,1 (0,9-1,4) 0,3 (0,3-0,4)
CD3+CD8+ 0,3 (0,2-0,5) 0,3* (0,3-0,4) 0,4 (0,3-0,4) 0,91* (0,7-1,1) 0,3 (0,3-0,5)
CD3+CD4+25+Foxp3+ 0,1 (0,1-0,1) 0,1 (0,1-0,1) 0,1 (0,1-0,1) 0,2 (0,1-0,2) 0,1 (0,1-0,1)
Примечание. Здесь и в табл. 6, 7: * - р < 0,05, ** - р < 0,01 по сравнению с тимэюпомированными сублетально облученными мышами, не получавшими ИЛ-7.
Таблица 6. Абсолютное содержание основных субпопуляций Т-лимфоцитов в селезенке тимэктомированных сублетально облученных мышей, млн
Параметр 5 сут 10 сут 20 сут 30 сут 60 сут
Группа без введения ИЛ-7
Количество мышей 6 6 6 6 6
CD3+CD4+ 9,0 (7,5-12,6) 10,3 (6,3-11,5) 5,2 (4,1-5,2) 8,1 (7,1-10,6) 7,6 (5,27-10,6)
CD3+CD8+ 4,03 (3,15-5,8) 5,97 (4,4-6,8) 2,8 (2,1-3,0) 5,4 (4,6-7,1) 6,76 (4,9-7,2)
CD3+CD4+25+Foxp3+ 0,7 (0,7-0,8) 1,19 (0,8-1,5) 0,5 (0,3-0,6) 0,8 (0,7-1,2) 0,9 (0,7-1,8)
Группа с еженедельным введением ИЛ-7
Количество мышей 7 7 7 7 7
CD3+CD4+ 5,5 (3,7-10,0) 7,8 (6,3-8,3) 4,5 (3,4-6,0) 7,6 (6,9-10,5) 4,6* (3,0-6,0)
CD3+CD8+ 2,9 (2,7-5,5) 4,2 (3,1-6,3) 2,5 (2,0-2,7) 6,6 (4,4-7,4) 4,7* (2, 9-5,1)
CD3+CD4+25+Foxp3+ 0,4 (0,3-0,8) 0,8* (0,6-0,9) 0,6 (0,4-0,9) 0,9 (0,7-1,1) 0,7 (0,5-1,0)
Таблица 7. Абсолютное содержание основных субпопуляций Т-лимфоцитов в костном мозге тимэктомированных сублетально облученных мышей, млн
Параметр 5 сут 10 сут 20 сут 30 сут 60 сут
Группа без введения ИЛ-7
Количество мышей 6 6 6 6 6
CD3+CD4+ 1,0 (0,7-1,1) 0,2 (0,1-0,2) 0,1 (0,1-0,1) 0,4 (0,3-0,8) 0,6 (0,4-0,7)
CD3+CD8+ 1,8 (1,3-2,1) 0,22 (0,15-0,25) 0,15 (0,12-0,22) 0,75 (0,69-1,12) 1,1 (0,9-1,8)
Группа с еженедельным введением ИЛ-7
Количество мышей 7 7 7 7 7
CD3+CD4+ 1,2 (0,7-1,4) 0,17 (0,2-0,2) 0,1* (0,1-0,2) 0,3* (0,2-0,4) 0,83 (0,8-1,0)
CD3+CD8+ 1,9 (1,4-2,6) 0,3** (0,3-0,4) 0,2 (0,2-0,2) 0,4 (0,3-0,9) 2,2 (1,4-2,5)
а не селезенку, а последующее восстановление в отсутствие тимопоэза было неэффективным и в основном происходило в селезенке.
Динамика изменений численности Т-клеток в КМ носила отличный от вторичных лимфоидных органов характер, увеличиваясь с 32 до 66% для Т-хелперов и с 38 до 70% для ЦТЛ от уровня интактных мышей к 5-м суткам после облучения, а затем опускаясь до 5% на 20-е сутки для обеих субпопуляций (p = 0,01 для субпопуляции Т-хелперов, p = 0,03 для субпопуляции ЦТЛ), к 60-м суткам восстанавливалась до уровня тимэктомированных необлученных мышей (p > 0,05 для обеих субпопуляций) (рис. 3).
Еженедельное введение ИЛ-7 тимэктомированным сублетально облученным мышам существенно не изменило динамику восстановления Т-клеток в лимфатических узлах (см. рис. 2 и табл. 5). Несмотря на значимые отличия на 10-е сутки для Т-хелперов и ЦТЛ (одинаковое увеличение в 1,7 раза) и на 30-е сутки только для ЦТЛ (увеличение в 1,4 раза), к 60-м суткам после облучения численность Т-клеточных субпопуляций в обеих группах не имела статистически значимых отличий. В селезенке введение ИЛ-7, статистически значимо не влияя на динамику восстановления обеих субпопуляций Т-клеток, приводило к еще более выраженному их дефициту на 60-е сутки после облучения (см. табл. 6).
Рис. 2. Динамика восстановления Т-клеточных субпопуляций во вторичных лимфоидных органах тимэктомированных мышей после сублетального облучения
Нормализованные по отношению к показателям интактного контроля данные. По оси абсцисс - сутки после облучения; А - Т-хелперы лимфатических узлов; Б - Т-хелперы селезенки; В - ЦТЛ лимфатических узлов; Г - ЦТЛ селезенки; Д - Трег лимфатических узлов; Е - Трег селезенки.
Количество Т-хелперов было в 2,2 раза, а ЦТЛ в 1,3 раза ниже, чем в группе тимэктомированных облученных мышей (см. рис. 2). Восстановление Трег во вторичных лимфоидных органах при назначении ИЛ-7 изменилось незначительно, и в конце периода восстановления количество Трег статистически значимо не отличалось от уровня группы тимэктомированных облученных мышей (см. табл. 5 и 6).
В КМ на фоне введения ИЛ-7 облученным тим-эктомированным мышам численность основных Т-клеточных субпопуляций (см. рис. 3 и табл. 7), статистически значимо отличаясь в некоторых точках (20-е и 30-е сутки для Т-хелперов и 10-е сутки для
ЦТЛ), в конце периода восстановления в 1,5-2 раза превосходила уровень контрольных тимэктомиро-ванных облученных мышей, но эта разница не была статистически значимой. Такие результаты обусловлены большими разбросами показателей из-за малой представленности Т-клеток в КМ, и, скорее всего, их анализ не является репрезентативным при данном дизайне эксперимента.
В целом, оценивая влияние ИЛ-7 на количественное восстановление периферических Т-клеток после индукции лимфопении сублетальным облучением в отсутствие тимопоэза, можно говорить, как минимум, о неэффективности и даже отрицательном влиянии избытка
ф
0 10 20 30
Интактные —4
—в— Т/экт + облуч + ИЛ-7
40 50
Т/экт + облуч
60
0 10 20
Интактные —ф— Т/экт + облуч + ИЛ-7
30 40 50 60 # Т/экт + облуч
Рис. 3. Динамика восстановления Т-клеточных субпопуляций в клеточном мозге тимэктомированных мышей после сублетального облучения
Нормализованные по отношению к показателям интактного контроля данные. По оси абсцисс - сутки после облучения. А - Т-хелперы; Б - ЦТЛ.
данного цитокина на пострадиационную регенерацию Т-клеточного звена иммунной системы.
Отсутствие поступления новых Т-клеток из тимуса предполагало изменение соотношения основных возрастных субпопуляций Т-клеток при пострадиационном восстановлении, а именно наивных Т-клеток и центральных Т-клеток памяти. Данные по содержанию основных возрастных субпопуляций Т-лимфоцитов во вторичных лимфоидных органах и КМ представлены в табл. 8-10.
У тимэктомированных мышей на 5-е сутки после сублетального облучения численность наивных Т-клеток по отношению к показателям интактных мышей упала в лимфатических узлах с 48 до 4% для Т-хелперов (рис. 4А) и с 62 до 2% для ЦТЛ (рис. 5 А), в селезенке - с 58 до 21% (рис. 4Б) и с 47 до 12% (рис. 5Б), соответственно. Все изменения были статистически значимыми (p < 0,05). Также во вторичных лимфоидных органах снизилась
численность Т-клеток памяти, в наибольшей степени затронув клетки с фенотипом центральных Т-клеток памяти, которые наравне с наивными Т-клетками представляют долгоживущие и отражающие Т-клеточный гомеостаз субпопуляции. Так, их количество в лимфатических узлах снизилось с 64 до 13% для Т-хелперов (см. рис. 4А) и с 85 до 10% для ЦТЛ (см. рис. 5 А) по отношению к показателям интактных мышей, а в селезенке -с 67 до 39% (см. рис. 4Б) и с 86 до 69% (см. рис. 5Б), соответственно (для всех показателей p < 0,05). В целом, численность центральных Т-клеток памяти пострадала меньше, чем наивных Т-клеток. На протяжении всего периода восстановления количество наивных Т-клеток во вторичных лимфоидных органах оставалось примерно на одном уровне (см. рис. 4 и 5), статистически значимо более низком в сравнении с соответствующим показателем у тимэктомированных необлученных мышей (p < 0,05). В то же время динамика численности
Таблица 8. Абсолютное содержание основных возрастных субпопуляций Т-клеток в лимфатических узлах тимэктомированных сублетально облученных мышей, млн
Параметр Время, сут
5 10 20 30 60
Группа без введения ИЛ-7
Количество мышей 6 6 6 6 6
CD3+CD4+naive 0,16 (0,13-0,18) 0,09 (0,06-0,14) 0,35 (0,16-0,58) 0,2 (0,14-0,56) 0,26 (0,1-0,47)
CD3+CD4+cm 0,03 (0,02-0,04) 0,03 (0,02-0,05) 0,05 (0,02-0,05) 0,08 (0,05-0,15) 0,05 (0,02-0,05)
CD3+CD8+naive 0,06 (0,05-0,09) 0,05 (0,04-0,09) 0,17 (0,07-0,3) 0,15 (0,09-0,26) 0,17 (0,07-0,19)
CD3+CD8+cm 0,07 (0,04-0,08) 0,05 (0,05-0,09) 0,26 (0,1-0,32) 0,26 (0,16-0,43) 0,16 (0,1-0,25)
Группа с еженедельным введением ИЛ-7
Количество мышей 7 7 7 7 7
CD3+CD4+naive 0,16 (0,15-0,32) 0,11 (0,1-0,13) 0,17 (0,17-0,26) 0,43 (0,3-0,6) 0,13 (0,08-0,2)
CD3+CD4+cm 0,04 (0,03-0,07) 0,04 (0,03-0,05) 0,03 (0,02-0,04) 0,16* (0,11-0,18) 0,03 (0,03-0,04)
CD3+CD8+naive 0,09 (0,07-0,18) 0,11* (0,09-0,12) 0,11 (0,09-0,14) 0,23 (0,17-0,32) 0,06 (0,06-0,11)
CD3+CD8+cm 0,09 (0,06-0,1) 0,09 (0,07-0,13) 0,17 (0,1-0,21) 0,52 (0,37-0,55) 0,21 (0,2-0,29)
Примечание. Здесь и в табл. 9, 10: * - р < 0,05 по сравнению с тимэктомированнъми сублетально облученными мышами, не получавшими ИЛ-7.
Таблица 9. Абсолютное содержание основных возрастных субпопуляций Т-клеток в селезенке тимэктомированных сублетально облученных мышей, млн
Параметр Время, сут
5 10 20 30 60
Группа без введения ИЛ-7
Количество мышей 6 6 6 6 6
СБ3+СБ4+па1Уе 1,64 (1,35-1,78) 1,22 (0,94-1,77) 0,98 (0,81-1,26) 1,15 (0,44-2,44) 1,76 (0,16-2,72)
СБ3+СБ4+сш 0,51 (0,46-0,62) 0,21 (0,17-0,34) 0,25 (0,19-0,31) 0,27 (0,23-0,57) 0,25 (0,1-0,57)
СБ3+СБ8+па1Уе 0,69 (0,53-0,98) 0,99 (0,73-1,59) 0,56 (0,42-0,72) 0,86 (0,58-1,25) 0,94 (0,23-1,53)
СБ3+СБ8+сш 1,46 (1,21-1,97) 0,88 (0,63-1,29) 1,18 (0,86-1,33) 2,91 (2,29-3,68) 2,73 (1,68-3,56)
Группа с еженедельным введением ИЛ-7
Количество мышей 7 7 7 7 7
СБ3+СБ4+па1Уе 1,15 (0,58-1,67) 0,78* (0,49-0,91) 0,52 (0,45-0,98) 1,22 (1,05-1,75) 0,71 (0,32-0,92)
СБ3+СБ4+сш 0,28 (0,19-0,5) 0,15* (0,09-0,16) 0,14 (0,13-0,18) 0,4 (0,35-0,58) 0,17 (0,14-0,24)
СБ3+СБ8+па1Уе 0,53 (0,33-0,56) 0,74 (0,52-0,87) 0,45 (0,29-0,69) 0,79 (0,76-0,94) 0,37 (0,27-0,58)
СБ3+СБ8+сш 1,1 (0,67-2,26) 0,82 (0,47-1,02) 0,93 (0,87-1,17) 3,23 (2,56-4,53) 2,09 (1,77-3,1)
Таблица 10. Абсолютное содержание основных возрастных субпопуляций Т-клеток в костном мозге тимэктомированных суб-летально облученных мышей, млн
Параметр Время, сут
5 10 20 30 60
Группа без введения ИЛ-7
Количество мышей 6 6 6 6 6
СБ3+СБ4+па1Уе 0,01 (0,01-0,01) 0 (0-0) 0 (0-0) 0 (0-0,01) 0,02 (0,01-0,02)
СБ3+СБ4+сш 0,01 (0,01-0,02) 0,01 (0,01-0,01) 0 (0-0,01) 0,01 (0,01-0,02) 0,02 (0,02-0,02)
СБ3+СБ8+па1Уе 0,02 (0,02-0,03) 0,01 (0-0,01) 0,01 (0,01-0,01) 0,01 (0,01-0,03) 0,03 (0,02-0,04)
СБ3+СБ8+сш 0,35 (0,29-0,4) 0,03 (0,02-0,05) 0,04 (0,03-0,05) 0,17 (0,09-0,23) 0,44 (0,27-0,59)
Группа с еженедельным введением ИЛ-7
Количество мышей 7 7 7 7 7
СБ3+СБ4+па1Уе 0,01 (0,01-0,01) 0 (0-0) 0 (0-0) 0 (0-0,01) 0,02 (0,02-0,03)
СБ3+СБ4+сш 0,01 (0,01-0,02) 0,01 (0,01-0,02) 0 (0-0) 0,01 (0,01-0,01) 0,04 (0,03-0,05)
СБ3+СБ8+па1Уе 0,02 (0,01-0,03) 0,01 (0,01-0,01) 0,01 (0-0,02) 0,01 (0,01-0,01) 0,04 (0,02-0,07)
СБ3+СБ8+сш 0,42 (0,3-0,58) 0,05 (0,04-0,05) 0,05 (0,03-0,05) 0,12 (0,07-0,23) 0,83* (0,49-0,95)
О '-2
1,0
0,8 0,6 0,4 0,2
0,0
Рис. 4. Динамика восстановления численности возрастных субпопуляций Т-хелперов у тимэктомированных мышей после сублетального облучения
Нормализованные по отношению к показателям интактного контроля данные. По оси абсцисс - сутки после облучения. А - лимфатические узлы; Б - селезенка.
Интактные Тпа1уе Т/экт + 4 гр Тпа1уе Т/экт + 4 гр + ИЛ-7 Tcm Т/экт + 4 гр Тст Т/экт + 4 гр + ИЛ-7
20
40
60
J 1,8
1,6
- Интактные 1,4
— Tnaive Т/экт + 4 гр 1,2
— Tnaive Т/экт + 4 гр + ИЛ-7 1,0
■ Tcm Т/экт + 4 гр 0,8
Tcm Т/экт + 4 гр + ИЛ-7 0,6
0,4
0,2
0,0
0
20
40
60
0
20
40
60
Рис. 5. Динамика восстановления численности возрастных субпопуляций цитотоксических Т-лимфоцитов у тимэктомированных мышей после сублетального облучения
Нормализованные по отношению к показателям интактного контроля данные. По оси абсцисс - сутки после облучения. А - лимфатические узлы; Б - селезенка.
лимфоцитов с фенотипом центральных Т-клеток памяти в лимфатических узлах имела в разной степени выраженный пик на 20-е или на 30-е сутки, приближающийся по значению к показателям тимэктомирован-ных необлученных мышей: для Т-хелперов - на 20-е сутки (р = 0,25 относительно тимэктомированных необлученных мышей); для ЦТЛ - на 20-е сутки (р = 0,06) и 30-е сутки (р = 0,08). К 60-м суткам после облучения численность лимфоцитов с фенотипом центральных Т-клеток памяти возвращалась к минимальным значениям, статистически значимо отличающимся от уровня тимэктомированных необлученных мышей (р < 0,05 как
для Т-хелперов, так и для ЦТЛ). Среди ЦТЛ селезенки на 30-е сутки после облучения был отмечен рост численности клеток с фенотипом центральных Т-клеток памяти, который статистически значимо превышал уровень тимэктомированных необлученных мышей (р < 0,05) и сохранялся до конца периода восстановления на 60-е сутки (см. рис. 5).
Более эффективно пострадиационное восстановление наивных и центральных Т-клеток памяти происходило в КМ тимэктомированных мышей (рис. 6). До облучения численность наивных Т-хелперов и ЦТЛ составляла соответственно 25 и 28% от уровня интакт-
а 2,0
1,8
- Интактные 1,6
1,4
—•— Tnaive Т/экт + 4 гр
1,2
m Tnaive Т/экт + 4 гр + ИЛ-7
1,0
Tcm Т/экт + 4 гр 0,8
Tcm Т/экт + 4 гр + ИЛ-7 0,6
0,4
0,2
0,0
0
20
40
60
0
20
40
60
Рис. 6. Динамика восстановления численности возрастных субпопуляций Т-клеток костного мозга у тимэктомированных мышей после сублетального облучения
Нормализованные по отношению к показателям интактного контроля данные. По оси абсцисс - сутки после облучения; А - Т-хелперы; Б - ЦТЛ.
25,0
20,0
15,0 --
10,0 --
5,0 --
0,0
*
-1
I-1
*
пг—I
Й
I.
*
1-1 *
1—1
ПЙПп
Лимфатические Селезенка узлы
КМ
э
6,0
Д Интактные П Т/эктомия
□ Т/эктомия + 4 гр
□ Т/эктомия + 4 гр + ИЛ-7
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
I—*-1
Г7--1
*
И-1
*
-1
П—I
Л
*
и—I
*
г—-1
Ип , Пи,
Лимфатические Селезенка узлы
КМ
Рис. 7. Соотношение Тпа1уе/Тст в лимфоидных органах контрольных и тимэктомированных сублетально облученных мышей в конце периода восстановления * -р < 0,05; А - Т-хелперы; Б - ЦТЛ.
*
I—I—*
20,0 15,0 10,0 5,0 0,0
^ тА 1
7 : *
№ 15_ 1
г
э
30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0
Е,
0 5 10 20 30 60
10
20
30
60
8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0
Э
£
45,0 40,0 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0
№
т.
Интактные
Й
0 5 10 20 30 60
10 20 30 60
14,0 12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0
I
40,0 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0
I
0 5 10 20
I Т/эктомия □ Т/эктомия + облуч □ Т/эктомия + облуч + ИЛ-7
30 60
10 20 30 60
Рис. 8. Изменение доли пролиферирующих (К1-67+) Т-клеток в лимфатических узлах тимэктомированных мышей после сублетального облучения, %
По оси абсцисс - сутки после облучения. # -р < 0,05 по сравнению с интактными мышами; * -р < 0,05 в сравнении с тимэкто-мированными сублетально облученными мышами, не получавшими ИЛ-7. А - все Т-хелперы; Б - все ЦТЛ; В - наивные Т-хелперы; Г - наивные ЦТЛ; Д - центральные Т-хелперы памяти; Е - центральные ЦТЛ памяти.
#
0
5
А
0
5
0
5
ных мышей, после облучения снижалась, достигая на 10-20-е сутки минимума в 2% (р < 0,05). К 60-м суткам численность наивных Т-хелперов поднималась до 15% (р > 0,05), наивных ЦТЛ - до 10% (р < 0,05). Центральные Т-хелперы памяти с 26% от уровня интактного контроля через минимум в 3% (р < 0,05) восстанавливались до 16% (р > 0,05), а ЦТЛ с фенотипом центральных клеток памяти, составляя 52% от уровня интактного контроля до облучения, снижались до 6% (р < 0,05), а к 60-м суткам достигали 90% от уровня интактного контроля (р < 0,05), т. е. к 60-м суткам численность ЦТЛ с фенотипом центральных Т-клеток памяти уже статистически значимо превышала соответствующий показатель у не-облученных тимэктомированных мышей и практически достигала уровня, наблюдаемого у интактных мышей.
В целом, к концу периода наблюдения - на 60-е сутки после сублетального облучения - численность возрастных Т-клеточных субпопуляций характеризовалась значимым по сравнению с контрольными группами снижением числа как наивных Т-лимфоцитов, так и Т-лимфоцитов с фенотипом центральных Т-клеток
памяти, но с изменением соотношения в пользу последних, что наглядно представлено на графике (рис. 7).
Еженедельное введение ИЛ-7 облученным тимэкто-мированным мышам мало повлияло на динамику восстановления наивных Т-клеток и центральных Т-клеток памяти (табл. 8 и 9). Так, в лимфатических узлах (см. рис. 4 и 5) введение ИЛ-7 привело к увеличению численности всех возрастных субпопуляций Т-клеток на 10-е сутки восстановления, при этом возрастание было статистически значимо только для субпопуляции наивных ЦТЛ (р < 0,05), и на 30-е сутки - только для Т-хелперов с фенотипом центральных Т-клеток памяти (р < 0,05). В селезенке (см. рис. 4 и 5) после введения ИЛ-7 пострадиационное восстановление численности исследованных возрастных субпопуляций Т-клеток протекало еще менее эффективно, при этом на 10-е сутки одновременное снижение количества наивных Т-хелперов и Т-хелперов с фенотипом центральных Т-клеток памяти относительно показателей мышей, не получавших ИЛ-7, было статистически значимым (р < 0,05). В КМ еженедельное введение ИЛ-7 приво-
Ж
0
10 20 30 60
0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,0
*
т Ь г-
I*1
0 5 10 20 30 60
10
20
30
60
*
Е,
лД
10
20
30
60
А |т
1 1 ДА
5 10
■ Интактные
20
Ж
30
Т/эктомия
60
0,20 0,15 0,10 0,05 0,00
л р
□ Т/эктомия + облуч
0 5 10 20
□ Т/эктомия + облуч + ИЛ-7
30
60
Рис. 9. Изменение абсолютного количества пролиферирующих (К-67+) Т-клеток в лимфатических узлах тимэктомированных мышей после сублетального облучения, млн
По оси абсцисс - сутки после облучения. # - р < 0,05 в сравнении с интактными мышами; * - р < 0,05 в сравнении с тимэкто-мированными сублетально облученными мышами, не получавшими ИЛ-7. А - все Т-хелперы; Б - все ЦТЛ; В - наивные Т-хелперы; Г - наивные ЦТЛ; Д - центральные Т-хелперы памяти; Е - центральные ЦТЛ памяти.
0
5
0
5
0
5
0
Э
э
э
25 20 15 10
5 0
10 8
6 4 2 0
40 35 30 25 20 15 10
50
ш
10
20
10
20
5 10
I Интактные
20
30
30
60
1: ^ т[
№ с г Г
1
60
|Т| 4 ъ_
—к
30
I Т/эктомия
60
э
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
20 15 10 5 0
50 40 30 20 10 0
I
10
20
10
20
30
30
□ Т/эктомия + облуч
□ Т/эктомия + облуч + ИЛ-7
60
*
1 I щ_
г
л
0 5 10 20 30 60
*
¡т
1 1- ' И. X_ 1
60
Рис. 10. Изменение доли пролиферирующих (К-67+) Т-клеток в селезенке тимэктомированных мышей после сублетального облучения, %
По оси абсцисс - сутки после облучения. # - р < 0,05 в сравнении с интактными мышами; * - р < 0,05 в сравнении с тимэкто-мированными сублетально облученными мышами, не получавшими ИЛ-7. А - все Т-хелперы; Б - все ЦТЛ; В - наивные Т-хелперы; Г - наивные ЦТЛ; Д - центральные Т-хелперы памяти; Е - центральные ЦТЛ памяти.
■к
•к
•к
0
5
0
5
0
5
0
0
5
дило к накоплению лимфоцитов с фенотипом центральных Т-клеток памяти в конце периода восстановления после сублетального облучения (см. рис. 6), при этом для ЦТЛ это отличие было статистически значимым (р < 0,05).
Наиболее интересный результат был получен при анализе соотношения наивных и центральных Т-клеток памяти в конце срока восстановления - на 60-е сутки после сублетального облучения (см. рис. 7). В группе тимэктомированных сублетально облученных мышей на фоне введения рекомбинантного ИЛ-7 наблюдалось снижение соотношения Тпшуе/Теш относительно группы мышей, не получавших ИЛ-7, во всех лимфоид-ных органах как для Т-хелперов, так и для ЦТЛ. Статистически значимым это снижение было для Т-хелперов лимфатических узлов и КМ, а также для ЦТЛ лимфатических узлов (для всех показателей р < 0,05). В целом полученные данные свидетельствовали о том, что дополнительное введение ИЛ-7 на фоне лимфопении в отсутствие тимопоэза вело к относительному накоплению лимфоцитов с фенотипом центральных Т-клеток
памяти, причиной чего могла быть избыточная гомео-статическая пролиферация, которую мы также исследовали.
После сублетального облучения тимэктомированных мышей уровень гомеостатической пролиферации Т-клеточных субпопуляций значительно возрастал как в лимфатических узлах, так и в селезенке, возвращаясь к нормальным значениям на 60-е сутки восстановительного периода (рис. 8-11).
Доля пролиферирующих (К1-67+) Т-клеток в лимфатических узлах достигала пика дважды - на 5-е и 2030-е сутки после облучения (см. рис. 8), значимо превышая уровень необлученных мышей (р < 0,05). Причем только второй пик и только на 20-е сутки сопровождался ростом (восстановлением до уровня необлученных животных) абсолютного количества пролиферирующих СБ4+- и СБ8+-Т-клеток (см. рис. 9). Таким образом, пик на 20-е сутки мы рассматривали в качестве истинного пика усиления гомеостатической пролиферации в лимфатических узлах тимэктомированных мышей после сублетального облучения. Данный пик четко просле-
Э
Э
0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00
0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00
10
20
30
10
20
30
5 10
I Интактные
20
60
п
1
1 т т
и ЙпН ¡ъ
60
т
т
г 1т,
1
30
Т/эктомия
60
э
3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
10
20
*
4
1. *
И
1 1 т *
III Г1
|Т |Г
30
□ Т/эктомия + облуч
0 5 10 20
□ Т/эктомия + облуч + ИЛ-7
30
10 20 30 60
к.
60
г[
Й Гп « т ГС
60
Рис. 11. Изменение абсолютного количества пролиферирующих (Ki-67+) Т-клеток в селезенке тимэктомированных мышей после сублетального облучения, млн
По оси абсцисс - сутки после облучения. # - р < 0,05 в сравнении с интактными мышами; * - р < 0,05 в сравнении с тимэкто-мированными сублетально облученными мышами, не получавшими ИЛ-7. А - все Т-хелперы; Б - все ЦТЛ; В - наивные Т-хелперы; Г - наивные ЦТЛ; Д - центральные Т-хелперы памяти; Е - центральные ЦТЛ памяти.
0
0
5
5
0
0
5
5
0
живался для наивных Т-клеток, тогда как у лимфоцитов с фенотипом центральных Т-клеток памяти он смешался к 30-м суткам в случае Т-хелперов или растягивался на период с 20-х по 30-е сутки в случае ЦТЛ.
В селезенке аналогичный пик усиления гомеоста-тической пролиферации для Т-хелперов приходился на 30-е сутки, а для ЦТЛ - на 10-е сутки после сублетального облучения (рис. 10), так же значимо превышая уровень необлученных мышей (р < 0,05). В обоих случаях он не сопровождался ростом абсолютного числа проли-ферирующих наивных Т-клеток, а число пролифериру-юших лимфоцитов с фенотипом центральных Т-клеток памяти достигало максимума на 30-е сутки даже в случае ЦТЛ (рис. 11). Таким образом, рассматривая только наивные и центральные Т-клетки памяти в качестве от-вечаюших на гомеостатические сигналы изменением уровня пролиферации, мы расценили увеличение численности пролиферирующих Т-клеток на 30-е сутки после сублетального облучения в качестве истинного пика гомеостатической пролиферации в селезенке тимэкто-мированных мышей.
Исходя из вышеизложенного мы заключили, что уровень гомеостатической пролиферации у сублетально облученных тимэктомированных мышей увеличивался последовательно: сначала в лимфатических узлах (20-е сутки), затем в селезенке (30-е сутки) и сначала в наивных Т-клетках (20-е сутки), а затем в центральных Т-клетках памяти (30-е сутки). Таким образом, наивные Т-клетки, преимущественно локализующиеся в лимфатических узлах, в условиях пострадиационной лимфопении активно пролиферировали, но их количество не достигало начального уровня (до облучения) (рис. 4 и 5). При этом изменялась экспрессия поверхностных маркеров (СБ62Ь, СБ44) и пополнялся пул лимфоцитов с фенотипом центральных Т-клеток памяти, которые в свою очередь также активно про-лиферировали и в результате восстанавливали численность более эффективно, чем наивные Т-клетки (рис. 4 и 5).
Введение ИЛ-7 в период восстановления тимэкто-мированных мышей после сублетального облучения приводило к еще более выраженному усилению го-
меостатической пролиферации (рис. 8-11) и синхронизации пика, оцениваемого по абсолютному количеству пролиферирующих Т-лимфоцитов, на 30-е сутки (рис. 9 и 11). Отличия по численности Ki-67+ Т-клеток на 30-е сутки в данной группе мышей при сравнении с мышами, не получавшими ИЛ-7, были статистически значимыми для суммарных популяций Т-хелперов и ЦТЛ, во всех вторичных лимфоидных органах (р < 0,05), а также всех возрастных субпопуляций ЦТЛ за исключением наивных ЦТЛ в селезенке (рис. 9 и 11). К 60-м суткам численность пролифери-рующих Т-лимфоцитов снижалась до уровня мышей, не получавших ИЛ-7, а в случае ЦТЛ селезенки - даже ниже этого уровня. Соответственно усиление гомеоста-тической пролиферации в ходе пострадиационной регенерации Т-клеточного звена периферической иммунной системы в отсутствие тимопоэза на фоне введения ИЛ-7, наблюдаемое на пике этого усиления, по всей видимости, и стало основной причиной дополнительного накопления Т-лимфоцитов с фенотипом центральных Т-клеток памяти, или, другими словами, усиления
■ Литература
1. Ярилин А.А., Полушкина Э.Ф. Радиационное повреждение и восстановление Т-лимфоцитов. II. Динамика восстановления субпопуляций Т-клеток. Радиобиология. 1981; 21 (2): 193-7.
2. Andreson R.E., Warner N.L. Ionizing radiation and the immune response. Adv. Immunol. 1976; 24: 215-335.
3. Rocha B., Dautigny N., Pereira P. Peripheral T lymphocytes: expansion potential and homeostatic regulation of pool sizes and CD4/ CD8 ratios in vivo. Eur. J. Immunol. 1989; 19: 905-11.
4. Schluns K.S., Kieper W.C., Jameson S.C., Lefrancois L. Inter-leukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat. Immunol. 2000; 1: 426-32.
5. Beutner U., MacDonald H.R. TCR-MHC class II interaction is required for peripheral expansion of CD4 cells in a T cell-deficient host. Int. Immunol. 1998; 10: 305-10.
6. Van Oers N.S., Killeen N., Weiss A. ZAP-70 is constitutively associated with tyrosine-phosphorylated TCR zeta in murine thymocytes and lymph node T cells. Immunity. 1994; 1: 675-85.
7. Cho B.K., Rao V.P., Ge Q. et al. Homeostasis-stimulated proliferation drives naive T cells to differentiate directly into memory T cells. J. Exp. Med. 2000; 192: 549-56.
конверсии фенотипа наивных Т-клеток в Т-клетки памяти, по сравнению с мышами, не получавшими ИЛ-7.
Подводя итог, можно констатировать, что введение ИЛ-7 в отсутствие тимопоэза не способно компенсировать недостаточную регенерацию периферического отдела Т-клеточного звена иммунной системы при лимфопении, индуцированной сублетальным облучением. Повышение уровня гомеостатической пролиферации на фоне введения рекомбинантного ИЛ-7 в отсутствие поступления наивных Т-клеток ведет к усилению конверсии фенотипа оставшихся радиорезистентных наивных Т-лимфоцитов в центральные Т-клетки памяти и относительному накоплению последних, возможно, к гибели части активно пролиферирующих Т-клеток и, как следствие, к более выраженному дефициту основных Т-клеточных популяций в селезенке на 60-е сутки после облучения. Следствием развивающейся картины должно стать значительное сужение репертуара Т-клеточных рецепторов, снижение возможности осуществлять полноценный иммунный надзор и повышение риска развития онкологических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний.
8. Kieper W.C., Jameson S.C. Homeostatic expansion and phe-notypic conversion of naive T cells in response to self peptide/MHC ligands. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1999; 96: 13 306-11.
9. Sprent J., Surh C.D. Normal T cell homeostasis: the conversion of naive cells into memory-phenotype cells. Nat. Immunol. 2011; 12: 478-84.
10. Goldrath A.W., Bogatzki L.Y., Bevan M.J. Naive T cells transiently acquire a memory-like phenotype during homeostasis driven proliferation. J. Exp. Med. 2000; 192: 557-64.
11. Sallusto F., Geginat J., Lanzavecchia A. Central memory and effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance. Annu. Rev. Immunol. 2004; 22: 745-63.
12. Haluszczak C., Akue F.D., Hamilton S.E. et al. The antigen-specific CD8 + T cell repertoire in unimmunized mice includes memory phenotype cells bearing markers of homeostatic expansion. J. Exp. Med. 2009; 206: 435-48.
13. Ярилин А. А. Гомеостатические процессы в иммунной системе. Контроль численности лимфоцитов. Иммунология. 2004; 25 (5): 312-20.
14. Bansal S.S., Ismahil M.A., Goel M., Patel B. et al. Activated T lymphocytes are essential drivers of pathological remodeling in ischemic heart failure. Circ. Heart Fail. 2017; 10 (3): e003688.
■ References
1. Yarilin A.A., Polushkina E.F. Irradiation damage and restoration of T lymphocytes. II. Dynamics of restoration of T-cells subpopulations. Radiobiologiya. 1981; 21 (2): 193-7. (in Russian)
2. Andreson R.E., Warner N.L. Ionizing radiation and the immune response. Adv. Immunol. 1976; 24: 215-335.
3. Rocha B., Dautigny N., Pereira P. Peripheral T lymphocytes: expansion potential and homeostatic regulation of pool sizes and CD4/ CD8 ratios in vivo. Eur. J. Immunol. 1989; 19: 905-11.
4. Schluns K.S., Kieper W.C., Jameson S.C., Lefrancois L. Inter-leukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat. Immunol. 2000; 1: 426-32.
5. Beutner U., MacDonald H.R. TCR-MHC class II interaction is required for peripheral expansion of CD4 cells in a T cell-deficient host. Int. Immunol. 1998; 10: 305-10.
6. Van Oers N.S., Killeen N., Weiss A. ZAP-70 is constitutively associated with tyrosine-phosphorylated TCR zeta in murine thymocytes and lymph node T cells. Immunity. 1994; 1: 675-85.
7. Cho B.K., Rao V.P., Ge Q., et al. Homeostasis-stimulated proliferation drives naive T cells to differentiate directly into memory T cells. J. Exp. Med. 2000; 192: 549-56.
8. Kieper W.C., Jameson S.C. Homeostatic expansion and phe-notypic conversion of naive T cells in response to self peptide/MHC ligands. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1999; 96: 13 306-11.
9. Sprent J., Surh C.D. Normal T cell homeostasis: the conversion of naive cells into memory-phenotype cells. Nat. Immunol. 2011; 12: 478-84.
10. Goldrath A.W., Bogatzki L.Y., Bevan M.J. Naive T cells transiently acquire a memory-like phenotype during homeostasis driven proliferation. J. Exp. Med. 2000; 192: 557-64.
11. Sallusto F., Geginat J., Lanzavecchia A. Central memory and effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance. Annu. Rev. Immunol. 2004; 22: 745-63.
12. Haluszczak C., Akue F.D., Hamilton S.E., et al. The antigen-specific CD8 + T cell repertoire in unimmunized mice includes memory phenotype cells bearing markers of homeostatic expansion. J. Exp. Med. 2009; 206: 435-48.
13. Yarilin A.A. Homeostatic processes in the immune system. Control of lymphocyte population. Immunologiya. 2004; 25 (5): 312-20. (in Russian)
14. Bansal S.S., Ismahil M.A., Goel M., Patel B., et al. Activated T lymphocytes are essential drivers of pathological remodeling in ischemic heart failure. Circ. Heart Fail. 2017; 10 (3): e003688.
