CC BY
3ского отделения Российской академии наук (ИПХЭТ СО РАН), ipcet@mail.ru, ул. Социалистическая, 1, Бийск, 659322, Россия. Тел. (3854) 30-14-73.
Люханова Инна Владимировна, инженер кафедры общей физики физико-технического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Петрозаводский государственный университет» (ПетрГУ), luhanova@yandex. ги, пр. Ленина, 33, г Петрозаводск, 185910, Россия. Тел. (8142) 71-96-54.
Алешина Людмила Александровна, профессор кафедры физики твердого тела физико-технического факультета, кандидат физико-математических наук Федеральногое государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Петрозаводский государственный университет» (ПетрГУ), а^Мпа@ psu.karelia.ru, пр. Ленина, 33, г Петрозаводск, 185910, Россия. Тел. (8142) 71-96-54, ул. Социалистическая, 1, Бийск, 659322, Россия. Тел. (3854) 30-
УДК 661.728.7:66.083.4
ИЗУЧЕНИЕ РЕАКЦИОННОЙ СПОСОБНОСТИ К ФЕРМЕНТАТИВНОМУ ГИДРОЛИЗУ СУБСТРАТОВ НА ОСНОВЕ ПРОДУКТОВ БЕЗРЕАГЕНТНОГО МЕТОДА ПРЕДОБРАБОТКИ ПЛОДОВЫХ ОБОЛОЧЕК ОВСА
И.Н. Павлов1, Е.И. Макарова1, Д.А. Чибиряев1' 2
Проведено исследование зависимости реакционной способности к ферментации субстратов на основе продуктов, полученных на универсальной термобарической установке. В качестве субстратов использованы образцы волокнистых продуктов после обработки в условиях термобарического воздействия с декомпрессией и гидротермической обработки, а также техническая целлюлоза после облагораживания волокнистого продукта. Установлено, что волокнистый продукт после обработки в динамичном режиме обладает реакционной способностью к ферментации в 2,5 раза выше по отношению к продукту, полученному обработкой в статичном режиме. Показана целесообразность применения технологии термобарического воздействия при введении динамичного режима прогрева и выдержки продукта.
Ключевые слова: ферментативный гидролиз, реакционная способность, целлюлоза, недревесное целлюлозосодержащее сырье, термобарическое воздействие, гидротермическая обработка.
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что целлюлозосодержащее сырье (ЦСС) довольно устойчиво к ферментативному гидролизу, что связано с наличием прочной матрицы, образованной лигнином, целлюлозой и гемицеллюлозами. С целью обеспечения доступности полимерных цепей целлюлозы для действия ферментов проводится предварительная обработка лигноцеллюлоз-ного сырья [1, 2]. Особое внимание уделяется безреагентному методу воздействия для получения субстратов, обладающих высокой реакционной способностью к ферментативному гидролизу [3-5].
Целью данной работы являлось изучение реакционной способности к ферментативному гидролизу субстратов, полученных из плодо-
вых оболочек овса на новом оборудовании -универсальной термобарической установке.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Универсальная термобарическая установка (УТБ) (рисунок 1) создана для расширения возможностей метода термобарической обработки. На данном виде оборудования апробированы методики: 1) термобарического воздействия (ТБВ) на исходное сырье в водной среде и 2) гидротермической обработки (ГТО). Метод ТБВ, в свою очередь, является модификацией известного метода взрывного автогидролиза, условием реализации которого является декомпрессия системы на конечной фазе проведения процесса.
По методике ТБВ обработка заключается в том, что водная суспензия исходного сырья помещается в реакционную камеру и усредняется посредством перекачивания на платформе. После чего реактор устанавливается на сборник и вся последующая обработка (нагрев до заданных значений температуры и
давления) проводится в статичном положении. После выдержки в камере проводится декомпрессия давления, т.е. ее моментальный сброс при разрыве мембраны, установленной в нижней части реакционной камеры. Это вызывает выброс обработанного продукта в приемный сборник и испарение примерно 1/3 воды.
По методике ГТО исходное сырье, находясь в жидкой фазе в виде суспензии, подвергается экстракции горячей водой при постоянном перекачивании реакционной камеры на платформе. Процесс происходит в динамичных условиях нагрева и последующей выдержки массы при заданных значениях температуры и давления. После завершения процесса осуществляется охлаждение реакционной массы в камере и выгрузка.
1 - реакционная камера; 2 - сборник; 3 - платформа; 4 - датчик температуры; 5 -датчик давления; 6 - патрубок отвода неконденсируемых газов Рисунок 1 - Схема универсальной термобарической установки
В обоих случаях полученный продукт первоначально отжимали, промывали дистиллированной водой с температурой 20-30 °С для удаления водорастворимых веществ, повторно фильтровали и затем высушивали при комнатной температуре, после чего анализировали на содержание основных компонентов согласно общепринятым методикам [6]. В жидкой фракции определяли концентрацию редуцирующих веществ (РВ) в пересчете на глюкозу спектрофотометрическим методом с
использованием динитросалицилового реактива.
Ферментативный гидролиз субстратов проведен в ацетатном буфере с использованием ферментного комплекса, состоящего из ферментных препаратов «Целлолюкс-А» (производитель ООО ПО «Сиббиофарм», г. Бердск) и «Брюзайм BGX» (поставщик - компания «Русфермент», г. Москва) по методике, подробно представленной в [7, 8]. Для контроля концентрации РВ каждые 8 ч проводили отбор проб объемом 2 см3. Концентрацию пентоз в пересчете на ксилозу в готовых гидролизатах определяли спектрофотометрическим методом с использованием орсина [9].
Выход РВ на навеску субстрата (5 г) без вычета нецеллюлозных примесей (золы и лигнина), а также выход пентоз от массового содержания пентозанов в субстрате рассчитан с учетом коэффициента 0,9, связанного с присоединением молекулы воды к ангидроглюкоз-ным и ангидроксилозным остаткам соответствующих мономерных звеньев в результате ферментативного гидролиза.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
По представленным методикам проведена наработка образцов [10], в качестве исходного сырья для которых взяты отходы зернового производства - плодовые оболочки овса (ПОО). Массовая доля кислотонераство-римого лигнина в исходном сырье составляет 18,0 % (в пересчете на абсолютно сухое сырье - а.с.с.), массовая доля целлюлозы, определенная методом Кюршнера (а.с.с.) - 36,0 %, массовая доля золы (а.с.с.) - 5,0 %, пентозанов - 33,0 %. Далее проведено исследование зависимости реакционной способности к ферментации субстратов от способа их получения на УТБ. В качестве субстратов использованы образцы волокнистых продуктов (ВП) непосредственно после обработки по методикам ТБВ и ГТО, а также техническая целлюлоза (ТЦ), полученные из ВП при облагораживании (обработка перекисью водорода в щелочной среде) по методике [11]. Для сравнения эффективности используемых методик предобработки проведен также ферментативный гидролиз нативных ПОО. Массовые доли (м.д.) основных компонентов ВП и ТЦ - субстратов представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Характеристики волокнистых продуктов и технических целлюлоз - субстратов
Субстрат Метод обработки Выход, % на а.с.в. М.д. компонента, % РВ в фильтрате, г/л
Целлюлоза* Лигнин Зола Пентозаны
ПОО Без обработки - 36,0 18,0 5,0 33,0 -
ВП ТБВ 71,9 43,8 18,1 4,6 19,6 1,2
ВП ГТО 43,9 69,9 25,5 4,7 3,9 7,0
ТЦ ТБВ, облагораживание - 71,3 6,8 5,9 28,3 -
Примечание: * - в волокнистых материалах определена массовая доля целлюлозы по Кюршнеру, в полученных из них целлюлозах - массовая доля а-целлюлозы.
О 8 16 24 32 40 48 56 64 72
Продолжительность ферментации, <1
—•— ПОО; -■— ВП после ГТО;
—ВП после ТБВ; —с^ТЦ из ВП после ТБВ
Рисунок 2 - Зависимость концентрации РВ от продолжительности ферментации
Все образцы были обработаны в одинаковых условиях на УТБ: температура 197 °С, давление в реакционной камере 1,5 МПа, время выдержки 400 с. Исследования проводились при гидромодуле системы 1:30.
Визуально отмечено, что в результате проведенных обработок (ТБВ и ГТО) на установке УТБ частицы ПОО сохраняли свою первоначальную форму. Отмечено изменение окраски полученных образцов от темно-бежевого после ТБВ до темно-коричневого цвета для продукта прошедшего ГТО. Темная окраска образцов ГТО свидетельствует о более глубоком протекании окислительных процессов. В нагретом и взорванном ВП ТБВ м.д. пентозанов снизилась до 19,5 %, т.е. потеря составила менее половины от начальной концентрации. Лигнин и зола остались на уровне исходного сырья.
В отличие от него ВП ГТО подвергся большему гидролитическому расщеплению, в результате сопровождающего автогидролиза. Потеря сухих веществ составила 56,1 % и обусловлена удалением большей части пен-тозанов вследствие гидролиза, их доля в ВП составила 3,9 %. Выход растворимой части веществ в жидкую фазу способствует концентрированию целлюлозы в твердой фазе, что приводит к повышению ее м.д. в ВП до 69,9 %.
При облагораживании образец ВП ТБВ частично превращался в волокнистую массу с потерей формы частиц. При этом м.д. лигнина уменьшилась в 2 раза и составила 6,8 % в образце ТЦ. Результаты исследования ферментативного гидролиза в виде зависимостей концентрации РВ в гидролизате от продолжительности ферментации представлены на рисунке 2. В таблице 2 показаны характеристики полученных гидролизатов по концентрации РВ и пентозанов в гидролизате после 72 ч ферментативного гидролиза. Наименьшую реакционную способность по выходам РВ и пентозанов показал субстрат нативных ПОО, около 5,4 % и 0,8 % соответственно, что указывает на наличие прочной лигноцеллюлозной структуры, придающей ей устойчивость к ферментативному гидролизу.
В сравнении с ПОО субстрат ВП ТБВ становится более доступным к ферментативному воздействию, о чем свидетельствует повышение реакционной способности и достижение выходов РВ до 20,3 % и пентоз до 11,1 % (от содержания пентозанов в субстрате), не смотря на отсутствие видимых изменений в структуре.
Таблица 2 - Характеристики гидролизатов после 72 ч ферментативного гидролиза
Субстрат ПОО ВП ТБВ ВП ГТО ТЦ ВП ТБВ
Концентрация РВ в гидролизате, г/л 2,0 7,5 21,9 30,3
Выход РВ в пересчете на глюкозу, % 5,4 20,3 59,1 81,8
Концентрация пентоз в гидролизате, г/л 0,1 0,8 1,4 6,4
Выход пентоз от содержания пентозанов в субстрате, % 0,8 11,1 96,9 61,1
ТЦ, полученная после облагораживания ВП ТБВ, обладает высокой реакционной способностью, и выход РВ после 72 ч гидролиза достигает 81,8 %, что превышает выход РВ образца ВП ТБВ в 4 раза, и в 15 раз - нативных ПОО. Выход пентоз при гидролизе образца ТЦ ВП ТБВ в 5,5 раз выше выхода ВП ТБВ и составляет 61,1 % и в 76 раз выше соответствующего показателя нативных ПОО. Это подтверждает доступность целлюлозы и гемицеллюлоз после удаления лигнина облагораживанием образца ВП ТБВ, что сопровождается изменением химического состава субстрата с накоплением гидролизуемых компонентов.
Ферментативный гидролиз образца ВП ГТО обеспечивает выход РВ 59 %. Это связано с тем, что водная горячая обработка приводит к структурным изменениям продукта и образованию микропор, которые увеличивают восприимчивую площадь поверхности и делают целлюлозу более доступной для гидролитических ферментов, несмотря на высокое значение м.д. лигнина в субстрате 25,5 %. Высокий уровень лигнина в данном субстрате свидетельствует о том, что в ходе гидротермической обработки происходил обратный процесс реполимеризации растворенного лигнина при его взаимодействии с продуктами деструкции гемицеллюлоз.
ВЫВОДЫ
Полученные результаты показывают, что ТЦ из ВП, прошедшего обработку в условиях ТБВ, обладает высокой реакционной способностью к ферментации. В то же время ВП ТБВ не претерпевает видимых изменений после обработки и содержит нерастворимый лигнин, что препятствует действию ферментов и затруднению гидролиза.
Субстрат ВП ГТО, показал удовлетворительную реакционную способность. Анализ продукта после обработки показывает, что в условиях динамичного режима перекачивания
сырье претерпевает качественные изменения, что повышает его реакционную способность в 2,5 раза по отношению к обработке в статичном режиме, даже при проведении декомпрессии. Таким, образом, обработка ПОО при постоянном перекачивании приводит к наиболее выраженному проявлению автогидролиза, что влечет изменение химического состава и нарушение прочности структуры исходного сырья. Поэтому целесообразным является разработка технологии термобарического воздействия в динамичных условиях прогрева и выдержки продукта.
Работа выполнена в рамках проекта фундаментальных исследований № 5 «Химическое обогащение возобновляемого «концентрированного» целлюлозосодержащего сырья в различных средах в реакторах под давлением» Программы 3 Президиума РАН.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Taherzaden M.J., Karimi K. Enzyme-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials: a review // BioResources, 2007. - 2 (4). - P. 707-738.
2. Разумовский С.Д., Подмастерьев В.В., Зеле-нецкий А.Н. Механо-химические методы активации процессов предобработки биомассы // Катализ в промышленности. - 2010. - № 5. - С. 53-57.
3. Будаева, В. В. Свойства мискантуса после обработки в реакторе высокого давления - 2009 / В.В. Будаева, Н.В. Бычин, Г.В. Сакович // Ползунов-ский вестник. - 2010. - № 4-1. - С. 144-149.
4. Будаева, В.В. Ферментативный гидролиз продуктов гидротермобарической обработки ми-скантуса и плодовых оболочек овса / В.В. Будаева, Е.И. Макарова, Е.А. Скиба, Г.В. Сакович // Катализ в промышленности. - 2013. - № 3. - С. 60-66.
5. Цуканов С.Н., Будаева В.В. Гидротермо-барический способ получения целлюлозы из отходов злаков // Ползуновский вестник. - 2011. -№ 4-1. С. 236-239.
6. Оболенская А.В., Ельницкая З.П., Леонович А.А. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы. - М.: Экология, 1991. - 320 c.
7. Макарова Е.И., Будаева В.В., Митрофанов
Р.Ю. Использование мультиэнзимных композиций для гидролиза нетрадиционного целлюлозосодер-жащего сырья // Ползуновский вестник. - 2010. - № 4-1. - С. 192-198.
8. Макарова, Е. И. Результаты ферментации целлюлозы мискантуса в ацетатном буфере и водной среде / Е.И. Макарова // Химия в интересах устойчивого развития. - 2013. - Т.21. - № 2. - С. 219-225.
9. ГОСТ 10820-75. Целлюлоза. Метод определения массовой доли пентозанов. Издание официальное. - М.: Изд-во стандартов, 1991. - 8 с.
10. Павлов И.Н., Будаева В.В., Сакович ГВ. Термобарическая обработка плодовых оболочек овса в водной среде / Химическая технология и биотехнология новых материалов и продуктов: тезисы докладов IV Международной конференции РХО им. Д.И. Менделеева: в 2 т. - г. Москва, 24-25 октября 2012. - М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева: ИФХЭ им. А.Н.Фрумкина РАН, 2012 г - Т. 2 - С. 135-137.
11. Химическое обогащение возобновляемого «концентрированного» целлюлозосодержащего сырья [Текст]: отчет о НИР (заключительный): Институт проблем химико-энергетических технологий Сибирского отделения РАН; рук. Сакович Г.В.; ис-полн.: Будаева В.В., Золотухин В.Н., Митрофанов Р.Ю., Обрезкова М.В., Скиба Е.А. и др. - Бийск, 2011. - 78 с. - Библиогр.: с. 77. - № Государственной регистрации 02201250091. Инв. № О-315.
Павлов Игорь Николаевич, научный сотрудник лаборатории биоконверсии, кандидат технических наук, доцент Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем химико-энергетических технологий Сибирского отделения Российской академии наук (ИПХЭТ СО РАН), pawlow-in@mail.ru, ул. Социалистическая, 1, Бийск, 659322, Россия. Тел. 8903 958 4140.
Макарова Екатерина Ивановна, младший научный сотрудник лаборатории биоконверсии, аспирант Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем химико-энергетических технологий Сибирского отделения Российской академии наук (ИПХЭТ СО РАН), assl@ mail.ru, ул. Социалистическая, 1, Бийск, 659322, Россия. Тел. (3854) 30-59-85, факс (3854) 30-17-25.
Чибиряев Дмитрий Андреевич, студент группы БТ-73 Бийского технологического института АлтГТУ им. И.И. Ползунова, практикант-дипломник 2013 года в лаборатории биоконверсии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем химико-энергетических технологий Сибирского отделения Российской академии наук (ИПХЭТ СО РАН), chidim@ngs.ru, ул. Социалистическая, 1, Бийск, 659322, Россия. Тел. (3854) 30-59-85, факс (3854) 30-17-25.
УДК 577.151:633.13(075.3)
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ МАТЕРИАЛОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СПОСОБА ИХ ПОДГОТОВКИ
Е.А. Скиба, Т.О. Момот, Н.В. Бычин, В.Н. Золотухин
В статье приведены результаты исследования зависимости ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных материалов плодовых оболочек овса и мискантуса от способа их подготовки. Показано, что удаление из субстратов продуктов деструкции лигнина (ингибитора) способствует повышению эффективности ферментативного гидролиза.
Ключевые слова: мискантус, плодовые оболочки овса, лигноцеллюлозный материал, ферментативный гидролиз, ингибитор, продукты деструкции лигнина.
ВВЕДЕНИЕ
Структура лигноцеллюлозной матрицы как древесного, так и недревесного сырья, является очень прочной, поэтому для её успешной ферментативной деструкции требуется предварительная химическая или физико-химическая обработка. В литературе описана предварительная химическая обработка при нормальном давлении раствором серной или соляной кислоты, позволяющая повысить скорость ферментолиза не менее, чем в два раза по сравнению с исходным сырьём [1].
В данной работе лигноцеллюлозный материал получен из недревесного целлюлозо-содержащего сырья обработкой раствором азотной кислоты.
Азотнокислый способ выбран в силу доступности реагента для нашей промышленной зоны, накопленного опыта использования реагента (включая регенерацию при необходимости), а также возможности получения азотных удобрений на основе отработанного варочного раствора в рамках создания комплексной переработки целлюлозосодержащего сырья.
Из литературы известно, что химиче-
