CC BY
26
УДК 611.018.74:617.713
Б.Э. МАЛЮГИН, Е.А. МАЛЮТИНА, Х.Д. ТОНАЕВА, С.А. БОРЗЕНОК, Д.С. ОСТРОВСКИЙ
НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» МЗ РФ, 127486, Москва, Бескудниковский бульвар, д. 59а
Изучение процессов миграции эндотелиоцитов роговицы человека в зону ятрогенного дефекта в условиях эксперимента ex vivo
Малюгин Борис Эдуардович — доктор медицинских наук, профессор, тел. (495) 488-85-11, e-mail: malyugin@mntk.ru, ORCID ID: 0000-0001-5666-3493
Малютина Екатерина Алексеевна — аспирант, тел. +7-929-583-22-65, e-mail: malyutinaekaterinamd@gmail.com, ORCID ID:0000-0003-0270-0847
Борзенок Сергей Анатольевич — доктор медицинских наук, профессор, тел. (495) 488-85-52, e -mail: mdborzenok@yandex.ru, ORCIDID: 0000-0001-9160-6240
Тонаева Хадижат Джанхуватовна — кандидат медицинских наук, тел. +7-905-515-66-11, e -mail: dr.tonaeva@gmail.com, ORCID ID: 0000-0002-9034-0660
Островский Дмитрий Сергеевич — аспирант, лаборант, тел. +7-929-632-93-59, e-mail: dmitriy.ostrovskiy@gmail.com, ORCID ID: 0000-0002-2817-7102
Цель исследования — экспериментальное моделирование центрального десцеметорексиса и изучение процессов миграции и фенотипа эндотелиоцитов роговицы человека в эксперименте ex vivo с использованием иммуноги-стохимического анализа.
Материал и метод. Три донора: 31 год (ПЭК 3115±64 кл/мм2); 54 года (ПЭК 2930±86кл/мм2); 69 лет (ПЭК 2865±112кл/мм2). На корнеосклеральных дисках микропинцетом производили десцеметорексис в центре по диаметру 4 мм. Делили роговицу на 4 равные доли, в образце присутствовала периферическая зона с эндотелиоцитами и центральная зона, лишенная клеток. Каждый образец культивировали в питательной среде DMEM/ F12 с добавлением фетальной бычьей сыворотки. Культивацию проводили на протяжении 14 дней. Смену среды производили один раз в 7 суток. Далее материал фиксировали 10 % раствором формалина в течение 2 суток. Для исследования были отобраны маркеры к a-SMA, Ki67, люмикан, Na/Ka АТФ-аза. Исследование образцов проводили на лазерно-ска-нирующем конфокальном микроскопе OlympusFVIOi.
Результаты. К 14 дню эксперимента при исследовании всех образцов роговицы донора №1, 2 и 3, выраженной экспрессии маркера a-SMA в зоне дефекта, не было зарегистрировано. Определяются единичные клетки, экспрес-сирующие маркер ki67. Отмечается активная экспрессия маркеров клюмикану и Na/K АТФ-азе в зоне сформированного дефекта.
Заключение. По результатам проведенного исследования, к 14 дню эксперимента нами было отмечено полное или почти полное восстановление дефекта во всех образцах. Большая площадь, которую заполнили новые клетки, была зарегистрирована у молодого донора с максимальной ПЭК в центре. Полученные данные свидетельствуют о сохранении фенотипа и функциональной активности эндотелиоцитов, что обосновывает перспективность методики центрального десцеметорексиса как способа лечения пациентов с первичной эндотелиально-эпителиаль-ной дистрофией роговицы Фукса.
Ключевые слова: эндотелий роговицы человека, миграция, культивация, иммуноцитологический анализ, a-SMA, ki67, люмикан, Na/K АТФ-аза.
DOI: 10.32000/2072-1757-2018-16-5-151-157
(Для цитирования: Малюгин Б.Э., Малютина Е.А., Борзенок С.А., Тонаева Х.Д., Островский Д.С. Изучение процессов миграции эндотелиоцитов роговицы человека в зону ятрогенного дефекта в условиях эксперимента ex vivo. Практическая медицина. 2018. Том 16, № 5, C. 151-157)
B.E. MALYUGIN, E.A. MALYUTINA, Kh.D. TONAEVA, S.A. BORZENOK, D.S. OSTROVSKIY
The S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution of the MH of RF, 59a Beskudnikovskiy Blvd, Moscow, Russian Federation, 127486
Study of human cornea endothelial cells migration into iatrogenic defect zone in experiment ex vivo
Malyugin B.E. — D.Sc. (medicine), Professor, tel. (495) 488-85-11, e-mail: malyugin@mntk.ru, ORCID ID: 0000-0001-5666-3493 Malyutina EA — post-graduate student, tel. +7-929-583-22-65, e-mail: malyutinaekaterinamd@gmail.com, ORCID ID: 0000-0003-0270-0847 Borzenok S.A. — D.Sc. (medicine), Professor, tel. (495) 488-85-52, e-mail: mdborzenok@yandex.ru, ORCID ID: 0000-0001-9160-6240 Tonaeva KM.D. — PhD (medicine), tel. +7-905-515-66-11, e-mail: dr.tonaeva@gmail.com, ORCID ID: 0000-0002-9034-0660 Ostrovskiy D.S. — post-graduate student, laboratory assistant, tel. +7-929-632-93-59, e-mail: dmitriy.ostrovskiy@gmail.com, ORCID ID: 0000-0002-2817-7102
Objective: experimental modeling of central descemetorhexis and human cornea endothelial cells migration and phenotype study in experiment ex vivo with imminohystochemical analyses.
Materials and methods: Three donors of 31 y.o. (endothelial cells density 3115±64 kl/mm2), 54 y.o. (ECD 2930±86 kl/mm2), 69 y.o. (ECD 2865±112 kl/mm2). Central circular descemethorhexis (d=4.00 mm) was provided using micro forceps. The cornea was divided into 4 segments with intact endothelial zone and plane (without endotheliocytes) zone. Each sample was cultivated during 14 days in preservative culture DMEM/ F12 with addition of fetal calf serum. The medium was changed once in 7 days. Then the material was fixated in formaldehyde (10%). The staining for particular markers was made: a-SMA, ki67, lumikan and Na/K ATFase. The examination of samples was made on laser-scanning confocal microscope Olympus FV10i.
Results: By the 14th day of experiment, there was no active a-SMA expression in descemetorhexis zone. Single cells with ki67 expression were detected. Active lumican detection was in defect zones of all samples. Also in descemethorhexis zone, the Na/K ATFase expression was detected.
Conclusion: The results show complete or almost complete restoration of the defect by the 14th day of the experiment. The large zone filled with new cells was detected in a young patient with maximal ECD in the center. The obtained data testify that phenotype and functional activity of endotheliocytes were preserved, which substantiates the reliability of the method of central descemethorhexis in treating patients with primary endothelial-epithelial corneal Fuks dystrophy.
Key words: human corneal endothelium, migration, cultivation, immunocytological analyses, limikan, a-SMA, ki67, Na/K ATFase.
(For citation: Malyugin B.E., Malyutina E.A., Borzenok S.A., Tonaeva Kh.L., Borzenok S.A., Tonaeva Kh.D., Ostrovskiy D.S. Study of human cornea endothelial cells migration into iatrogenic defect zone in experiment ex vivo. Practical Medicine. 2018. Vol. 16, no. 5, P. 151-157)
Эндотелиальные клетки роговицы человека являются производными нервного гребня и несут основную функцию в поддержании прозрачности роговицы [1]. Ограничение пролиферативной активности эндотелиоцитов роговицы человека обусловлено блокировкой фазы клеточного цикла G1 [2, 3]. Физиологическая потеря эндотелиальных клеток в год, без влияния на степень прозрачности роговицы, достигает 0,6 % [4]. Травма эндотелия в ходе интраокулярной хирургии ведет к необратимой утрате клеток, угнетению их функциональной активности, а впоследствии — стойкому отеку роговицы и снижению остроты зрения. По литературным данным, первичная эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса (ЭДРФ) зарегистрирована у 4 % населения США, в РФ данный диагноз подтвержден у 3,8 % жителей Европейской части РФ. ЭДРФ является одной из наиболее распространенных заболеваний, требующих трансплантации роговицы. В основе данного заболевания — снижение плотности эндотелиальных клеток (ПЭК), образование утолщенных структур внеклеточного матрикаса в виде выпячиваний — гутт на задней поверхности
Десцеметовой мембраны (ДМ), которые провоцируют феномен светорассеяния и вызывают деградацию зрения даже при отсутствии отека роговицы
[5]. ДМ имеет в норме слоистую структуру и на протяжении жизни индивидуума утолщается с 3 мкм при рождении до 8-10 мкм во взрослом возрасте
[6]. Здоровая ДМ состоит из коллагена IV и VIII типов, гликопротеинов, протеогликанов и имеет два слоя. Для дистрофии Фукса характерны отложения экстрацеллюлярного матрикса, наличие оксидатив-ного стресса клеток эндотелия, усиленные процессы их апоптоза, эпителиально-мезинхимальный переход (ЭМП) и патологическая аутофагия [7, 9, 10].
К хирургическим методам лечения дистрофии роговицы Фукса относят различные виды кератопластики, которые могут сопровождаться риском отторжения трансплантата и имеют существенные ограничения в части доступности донорского материала. Новые разработки в данной области связаны с хирургическими методиками, предполагающими селективную замену ткани роговицы, использование меньшего объема донорского материала, а также применение клеточных технологий [7].
| ОФТАЛЬМОЛОГИЯ. ОТОРИНОЛАРИНГОЛОГИ
я
На ранних стадиях дистрофии роговицы Фукса целесообразно применять варианты задней послойной кератопластики (задняя автоматизированная или лазерная кератопластика, трансплантация Десце-метовой мембраны). Помимо этого, появились единичные сообщения о возможности удаления Десце-метовой мембраны без проведения трансплантации донорской ткани [8]. При этом заполнение зоны дефекта происходит за счет миграции эндотелиоцитов из периферической зоны роговицы, а также увеличения площади клеток, заполняющих зону дефекта. Удаление патологически измененной ДМ при этом не только приводит к удалению гутт, снижающих функциональный потенциал эндотелиоцитов и оптические свойства роговицы, но и обеспечивает более оптимальные условия для миграции клеток. Последнее было доказано в ряде экспериментов invitro [9, 10].
Несмотря на наличие ряда сообщений об использовании технологии центрального десцемето-рексиса в клинике, ряд фундаментальных аспектов данных вмешательств является неизученным. До настоящего момента не проводилась оценка
клеточных механизмов миграции и трансформации эндотелиальных клеток роговицы с использованием современных методов иммуногистохимии.
Цель данного исследования — экспериментальное моделирование центрального десцеметорекси-са и изучение процессов миграции и фенотипа эн-дотелиоцитов роговицы человека в эксперименте ex vivo с использованием иммуногистохимического анализа.
Материал и метод
Работу выполняли в НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России на базе центра фундаментальных и медико-биологических проблем головной организации. Донорский материал получен из глазного банка мНтк как невостребованный для трансплантации в клинике. Экспериментальные исследования проводили в соответствии с протоколами, соответствующими законодательству РФ. Всего было отобрано три донора со следующими исходными данными: №1 — мужчина 31 год, причина смерти — сочетан-
Донор № 1
Рис. 1. Иммуноцитологический анализ эндотелиоцитов донора № 1
А — ядра, окрашенные красителем бис-бензимид (Hoechst 33258); б — экспрессия a-sma; в — экспрессия ki-67; г — экспрессия белка люмикан; д — экспрессия белка Na/K АТФаза. Имму-ноцитохимическое окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, увеличение 100х. Голубая стрелка - зона ятрогенного дефекта (десцеметорексиса); желтая стрелка - интактная эндотелиальная зона роговицы. Красная линия - граница сформированного дефекта.
Figure 1 — Immunological analysis of endotheliocytes of donor 1
a — nuclei dyed with bis-benzimid (Hoechst 33258); b — expression of a-sma; c — expression of ki-67; d — expression of limikan protein; e — expression of Na/K ATFase protein. Immunocytochemical dying, laser scanning confocal microscopy, magnification 100х. Blue arrow — zone of iatrogenic defect (descemetorhexis); yellow arrow — intact endothelial zone of corneal. Red line — border of the formed defect.
А
" " Vf f
ж
ная травма; постмортальный период до введения в эксперимент — 24 часа; ПЭК 3115±64 кл/мм2. №2 — мужчина, 54 года, причина смерти — острая сердечно-сосудистая недостаточность; постмор-тальный период до введения в эксперимент — 26 часов. ПЭК 2930±86. №3 — мужчина 69 лет, причина смерти — острая сердечно-сосудистая недостаточность; постмортальный период до введения в эксперимент — 22 часа; ПЭК 2865±112кл/мм2.
Корнеосклеральные диски (N=3) фиксировали в искусственной камере эндотелиальной стороной кверху, микропинцетом производили десцемето-рексис в центре по диаметру 4 мм. Далее гистологическим ножом роговицу делили на 4 равные доли, так чтобы на каждом образце присутствовала ин-тактная периферическая зона с эндотелиоцитами и центральная зона, лишенная клеток. Каждый образец культивировали в культуральных флаконах объемом 25 см2, в которые добавляли 20 мл полной питательной среды DMEM/ F12 с добавлением фе-тальной бычьей сыворотки — 10%, L-глутамин — 2мМ, антибиотик — 1 %. Культивацию проводили
на протяжении 14 дней. Смену среды производили один раз в 7 суток. Далее материал фиксировали 10 % раствором формалина в течение 2 суток. Для исследования фенотипа эндотелия в процессе культивирования были использованы маркеры к a-SMA, Ki67, люмикан, Na/Ka АТФ-аза. (Abcam, Великобритания). Окрашивание на маркеры к определенному белку проводили согласно протоколу.
Характеристика выбранных маркеров: a-SMA позволяет зарегистрировать переход эпителиальных клеток в мезенхимальные, а также является маркером клеток с тенденцией к гладкомышечной дифференцировке; Ki67 — маркер пролифератив-ной активности клетки экспрессируется только во время деления клетки, а в периоде ее покоя маркер отсутствует; люмикан — основной маркер кератан-сульфатных протеогликанов роговицы; Na/K АТФа-за — ключевой маркер эндотелиоцитов роговицы, свидетельствующий о функциональной активности клеток. Исследование образцов проводили на лазерно-сканирующем конфокальном микроскопе OlympusFVIOi (Olympus, Япония).
Донор №2
Рис. 2. Иммуноцитологический анализ эндотелиоцитов донора №2
а — ядра, окрашенные красителем бис-бензимид (Hoechst 33258); б — экспрессия a-SMA; в — экспрессия ki-67; г — экспрессия люмикан; д — экспрессия Na/K АТФаза.
Иммуноцитохимическое окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, увеличение 100х. Голубая стрелка — зона ятрогенного дефекта (десцеметорексиса); желтая стрелка — интактная эндотелиальная зона роговицы. Красная линия — граница сформированного дефекта.
Figure 2. Immunological analysis of endotheliocytes of donor 2
a — nuclei dyed with bis-benzimid (Hoechst 33258); b — expression of a-sma; c — expression of ki-67; d — expression of limikan protein; e — expression of Na/K ATFase.
Immunocytochemical dying, laser scanning confocal microscopy, magnification 100х. Blue arrow — zone of iatrogenic defect (descemetorhexis); yellow arrow — intact endothelial zone of corneal. Red line — border of the formed defect.
А
Результаты
К 14 дню эксперимента при исследовании образца роговицы донора № 1 выраженной экспрессии маркера а^МА в зоне дефекта не было зарегистрировано. Определяются единичные клетки, экс-прессирующие маркер И67. Отмечается активная экспрессия маркеров к люмикану и Na/ К АТФ-азев зоне сформированного дефекта.
При исследовании образцов роговицы донора № 2 отмечается очень слабая экспрессия маркера а^та в зоне дефекта. Экспрессия маркера клеточной пролиферации И67 зарегистрирована в единичных клетках на всей площади зоны десцеметорексиса. Активная экспрессия к кератансульфатному проте-огликану роговицы — люмикану, детектирована в зоне сформированного дефекта. Выраженная экспрессия Na / К АТФазы также отмечается в клетках в пределах ятрогенного дефекта Десцеметовой мембраны роговицы.
В зоне ятрогенного дефекта ДМ донора №3 отмечается слабая экспрессия маркера а^МА, обнаруживается экспрессия маркераИб7 в единичных клетках, детектирована выраженная экспрессия
маркера к белку люмикан и Na / K АТФаза на всех участках в зоне сформированного дефекта.
Обсуждение результатов
В настоящее время в изучении процесса репарации поврежденных тканей ключевым аспектом является воздействие и активация клеток-предшественников или стволовых клеток (СК) [15, 16]. Перспективным направлением является клеточная терапия (КТ), т. е. по мере развития методов культивирования появились доказательства того, что прогениторные клетки можно выделить, размножить, дифференцировать и/или активировать in vitro, после чего трансплантировать в зону дефекта [14, 17]. В связи с этим перспективы приобрело направление клеточной терапии в виде трансплантации жизнеспособных аутологичных, аллогенных или ксеногенных клеток в целях регенерации поврежденной ткани [13]. Активное развитие клеточных технологий и экспериментов invitro проливает свет на возможный успех ауто-стимуляции миграции эндотелиоцитов и пролиферации эндотелиаль-ных клеток роговицы человека [11, 12], несмотря
Донор № 3
Рис. 3. Иммуноцитологический анализ эндотелиоцитов донора № 3.
Иммуноцитохимическое окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, увеличение 100х. Голубая стрелка —зона ятрогенного дефекта (десцеметорексиса); желтая стрелка — интактная эндотелиальная зона роговицы. Красная линия — граница сформированного дефекта.
А — ядра окрашенные красителем бис-бензимид (Hoechst 33258), б — экспрессия a-SMA, в — экспрессия ki-67, г — экспрессия белка люмикан, д — экспрессия Na/K АТФаза, Figure 3 — Immunological analysis of endotheliocytes of donor 3
a — nuclei dyed with bis-benzimid (Hoechst 33258); b — expression of a-sma; c — expression of ki-67; d — expression of limikan protein; e — expression of Na/K ATFase.
Immunocytochemical dying, laser scanning confocal microscopy, magnification 100х. Blue arrow — zone of iatrogenic defect (descemetorhexis); yellow arrow — intact endothelial zone of corneal. Red line — border of the formed defect.
на то что до последнего времени считалось, что восстановление его дефектов ограничено его сниженной способностью к пролиферации in vivo и ограниченным делением in vitro [15, 16]. Современные методы культивирования позволяют получить из одной донорской роговицы или даже исключительно ее задних слоев количество эндотелиальных клеток, которого могло бы хватить для нескольких трансплантаций [17, 22]. Методы работы с рогович-ным эндотелием принципиально разделяются на 3 большие группы: трансплантация клеточного пласта, трансплантация отдельных кластеров клеток и стимуляция регенерации эндотелия in vivo.
Самая распространенная и изученная группа — это наращивание и трансплантация эндотелиоци-тов в виде пласта, расположенного на поверхности культуральной посуды, покрытой одним из множества вариантов «носителей» — компонентами экс-трацеллюлярного матрикса, децеллюлизированной стромой, десцеметовой или амниотической мембраной или же термореверсивным гелем [18-21]. При трансплантации эндотелиоцитов в виде суспензии или микросфер возникает вопрос о необходимости их направленной миграции в область повреждения, в противном случае клетки просто будут «вымыты» из передней камеры. Для предотвращения «вымывания» клеток предложено, например, «нагружать» их магнитными микросферами перед трансплантацией, а после интракамеральной инъекции создавать локальное магнитное поле [22-24]. Человеческие эндотелиоциты, размноженные in vitro в различных модификациях, были успешно трансплантированы кошкам, кроликам и быкам, а также пересажены в перфузируемый донорский человеческий глаз [21, 22, 25, 26].
Для замещения дефекта роговичного эндотелия предложено использовать эндотелиальные проге-ниторы, полученные из пуповинной крови. В эксперименте на кроликах с удаленным эндотелием и Десцеметовой мембраной получены многообещающие результаты — восстановление толщины и прозрачности роговицы за счет замещения роговичного эндотелия трансплантированными клетками [27]. Еще одним вариантом регенерации эндотелия роговицы, осуществленным группой японских ученых в 2013 г., стало усиление регенераторных возможностей эндотелия in vivo, для этого авторы предлагают использовать ингибитор Rho-киназы, который снимает молекулярный «блок», препятствующий митозу, и стимулирует деление эндотелия [28]. Использование этого вещества в виде инстилляций показало стимулирующий эффект на регенерацию в эксперименте у больных дистрофией Фукса, а добавление его в питательную среду при культивировании роговичного эндотелия позволило исследователям разработать протокол трансплантации, разрешенный для применения у человека (находится в настоящий момент на этапе клинических испытаний) [29, 30].
Определенный трофический эффект, приводящий к восстановлению функции поврежденного эндотелия, получен также при использовании метода персонализированной КТ (ПКТ), основанной на ин-тракамеральной трансплантации активированных (препаратом Полудан) лейкоцитов в аутологичной сыворотке. Кроме того, ведутся работы в направлении 3D-культивирования клеток роговицы для создания биоинженерных конструкций [31].
Таким образом, доказанным становится факт возможности восстановления эндотелия без использо-
вания аллогенного донорского материала. Кроме того, процессы клеточной регенерации неоднократно были доказаны на моделях животных: кролик, кошка, обезьяна при различных способах формирования дефекта эндотелия (криовоздействие, механическое удаление мембраныи т. д.) [32-37]. При выполнении десцеметорексиса и удалении измененного клеточного матрикса редуцируется процесс контактного торможения и стимулируется миграция здоровых эндотелиоцитов периферического пояска в направлении к центру роговицы [38, 39]. Однако, по данным публикаций, несмотря на восстановление прозрачности роговицы, рефракционный результат в большом проценте является непредсказуемым по причине индукции неправильного астигматизма и формирования очагов фиброза по краю выполненного десцеметорексиса [38-41].
Заключение
По результатам проведенного исследования, к 14 дню эксперимента нами было отмечено полное или почти полное восстановление дефекта во всех образцах. Стоит отметить, что большая площадь, которую заполнили новые клетки, была зарегистрирована у молодого донора с максимальным исходным числом эндотелиальных клеток в центре. При восполнении дефекта роговицы эндотелиаль-ными клетками эпителиально-мезенхимальный переход нами не был отмечен, поскольку выраженной экспрессии маркера a-SMA в зоне дефекта не зарегистрировано, что с нашей точки зрения свидетельствует о сохранении фенотипаизученных клеток. Нами также регистрировались единичные клетки, которые экспрессировали маркер клеточной пролиферации (ki67). Активную экспрессию маркера к белку люмикан, являющемуся важным протеогли-каном роговицы, локализованном во внутритканевом матриксе и Na/K АТФазедетектировалив зоне сформированного дефекта во всех исследуемых образцах.
Совокупность полученных данных свидетельствует о сохранении фенотипа и функциональной активности эндотелиоцитов. Что в свою очередь обосновывает перспективность методики центрального десцеметорексиса как способа лечения пациентов с первичной эндотелиально-эпителиальной дистрофией роговицы Фукса.
ЛИТЕРАТУРА
1. Katikireddy KR, Schmedt T, Price MO, Price FW, Jurkunas UV. Exictence of neural crest-derived progenitor cells in normal and Fuchs endothelial dystrophy corneal endothelium. Am J Pathol. 2016 Oct; 186(10):2736-50.
2. Joyce NC, Meklir B, Joyce SJ, Zieske JD. Cell cycle protein expression and proliferative status in human corneal cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1996 Mar;37(4):645-55.
3. Joyce NC. Proliferative capacity of the corneal endothelium. Prog Retin Eye Res. 2003 May;22(3):359-89.
4. Bourne WM, Nelson LR, Hodge DO. Central corneal endothelial cell changes over a ten-year period. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1997 Mar;38(3):779-82.
5. Oie Y, Watanabe S, Nishida K. Evaluation of visual quality in patients with Fuchs endothelial corneal dystrophy.Cornea. 2016 Nov;35 Suppl 1:S55-S58. Review.
6. Murphy C, Alvarado J, Juster R, Maglio M. Prenatal and postnatal cellularity of the human corneal endothelium: a quantitative histologic study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1984;25(3):312-322.
7. Okumura N, Kakutani K, Inoue R, et al. Generation and feasibility assessment of a new vehicle for cell-based therapy for treating corneal endothelial dysfunction. PLoS One. 2016;11(6): e0158427.
8. Малюгин Б.Э., Измайлова С.Б., Малютина Е.А., Антонова О.П., Гелястанов А.М. Клинико-функциональные результаты хирургического лечения катаракты и первичной эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса методом одномоментной факоэмульсификации и центрального десцеметорексиса // Вестник офтальмологии. — 2017. — №6. — С. 16-22.
я
9. Koizumi N, Okumura N, Kinoshita S. Development of new therapeutic modalities for corneal endothelial disease focused on the proliferation of corneal endothelial cells using animal models. Exp Eye Res. 2012;95(1):60-67.
10. Rizwan M, Peh GS, Adnan K, et al. In vitro topographical model of Fuchs dystrophy for evaluation of corneal endothelial cell monolayer formation. Adv Hea.
11. Peh GS, Chng Z, Ang HP, et al. Propagation of human corneal endothelial cells: a novel dual media approach. Cell Transplant. 2015;24(2):287-304.
12. Peh GS, Adnan K, George BL, et al. The effects of Rho-associated kinase inhibitor Y-27632 on primary human corneal endothelial cells propagated using a dual media approach. Sci Rep. 2015;5:9167.
13. Максимов А.А. Лимфоцит как общая стволовая клетка различных элементов крови в эмбриональном развитии и постфеталь-ной жизни млекопитающих. Folia Haematologica 8.1909, 125-134.
14. Ng KW, Abraham MC, Leong DTW, Morris C, Schantz J-T. Primary culture of specific cell types and the establishment of cell lines. Animal cell culture: essential methods. [Internet]. John Wiley & Sons, Ltd; 2011:205-230. doi:10.1002/9780470669815.ch7.
15. Ahmad S. Concise review: limbal stem cell deficiency, dysfunction, and distress. Stem Cells Trans Med. 2012;1(2):110-115. doi:10.5966/sctm.2011-0037.
16. КаспароваЕ.А., СубботА.М., КалининаД.Б. Пролифера-тивныйпотенциалзаднегоэпителияроговицычеловека. Вестник oфтальмологии. 2013;129(3):82-88.
17. Sabater AL, Guarnieri A, Espana EM, Li W, Prósper F, Moreno-Montañés J. Strategies of human corneal endothelial tissue regeneration. Regen Med. 2013;8(2):183-195. doi:10.2217/ rme.13.11.
18. Mimura T, Yamagami S, Yokoo S, Usui T, Tanaka K, Hattori S, Irie S, Miyata K, Araie M, Amano S. Cultured human corneal endothelial cell transplantation with a collagen sheet in a rabbit model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004;45(9):2992-2997. doi:10.1167/iovs.03-1174.
19. Bayyoud T, Thaler S, Hofmann J, Maurus C, Spitzer MS, Bartz-Schmidt K-U, Szurman P, Yoeruek E. Decellularized bovine corneal posterior lamellae as carrier matrix for cultivated human corneal endothelial cells. Curr Eye Res. 2012;37(3):179-186. doi:10.3109/0 2713683.2011.644382.
20. Teichmann J, Valtink M, Nitschke M, Gramm S, Funk RHW, Engelmann K, Werner C. Tissue engineering of the corneal endothelium: a review of carrier materials. J Funct Biomater. 2013;4(4):178-208. doi:10.3390/jfb4040178.
21. Parikumar P, Haraguchi K, Ohbayashi A, Senthilkumar R, Abraham SJK. Successful transplantation of in vitro expanded human cadaver corneal endothelial precursor cells on to a cadaver bovine's eye using a nanocomposite gel sheet. Curr Eye Res. 2013;39(5):522-526. doi:10.3109/02713683.2013.838633.
22. Koizumi N, Okumura N, Kinoshita S. Development of new therapeutic modalities for corneal endothelial disease focused on the proliferation of corneal endothelial cells using animal models. Exp Eye Res. 2012;95(1):60- 67. doi:10.1016/j.exer.2011.10.014.
23. Patel SV, Bachman LA, Hann CR, Bahler CK, Fautsch MP. Human corneal endothelial cell transplantation in a human ex vivo model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009;50(5):2123-2131. doi:10.1167/ iovs.08-2653.
24. Mimura T, Yamagami S, Usui T, Ishii Y, Ono K, Yokoo S, Funatsu H, Araie M, Amano S. Long-term outcome of iron-endocytosing cultured corneal endothelial cell transplantation with magnetic attraction. Exp Eye Res. 2005;80(2):149-157. doi:10.1016/j.exer.2004.08.021.
25. Mimura T, Yokoo S, Araie M, Amano S, Yamagami S.
Treatment of rabbit bullous keratopathy with precursors derived from cultured human corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005;46(10):3637-3644. doi:10.1167/iovs.05-0462.
26. Fan T, Ma X, Zhao J, Wen Q, Hu X, Yu H, Shi W. Transplantation of tissueengineered human corneal endothelium in cat models. Mol Vis. 2013;19:400- 407.
27. Shao C, Chen J, Chen P, Zhu M, Yao Q, Gu P, Fu Y, Fan X. Targeted transplantation of human umbilical cord blood endothelial progenitor cells with immunomagnetic nanoparticles to repair corneal endothelium defect. Stem Cells Dev. 2015;24(6):756-767. doi:10.1089/scd.2014.0255
28. Shao C, Chen J, Chen P, Zhu M, Yao Q, Gu P, Fu Y, Fan X. Targeted transplantation of human umbilical cord blood endothelial progenitor cells with immunomagnetic nanoparticles to repair corneal endothelium defect. Stem Cells Dev. 2015;24(6):756-767. doi:10.1089/scd.2014.0255.
29. Koizumi N, Okumura N, Ueno M, Kinoshita S. New therapeutic modality for corneal endothelial disease using rho-associated kinase inhibitor eye drops. Cornea. 2014;33 Suppl 11:S25-S31. doi:10.1097/ ICO.0000000000000240.
30. Okumura N, Kinoshita S, Koizumi N. Cell-based approach for treatment of corneal endothelial dysfunction. Cornea. 2014;33 Suppl 11:S37-S41. doi:10.1097/ICO.0000000000000229.
31. Малюгин Б.Э., Борзенок С.А., Колокольцова Т.Д., Комах Ю.А., Желтоножко А.А., Попов И.А., Сабурина И.Н., Репин В.С., Ко-шелева Н.В., Зурина И.М., Давыдова Л.И., Богуш В.Г., Агапов И.И. Разработка биоинженерной конструкции искусственной роговицы на основе пленочного матрикса из спидроинаикультивированных клеток лимбальной зоны глазного яблока. Офтальмохирургия. 2013;4:89- 97. 97.
32. Okumura N, Okazaki Y, Inoue R, et al. Effect of the Rho-associated kinase inhibitor eye drop (ripasudil) on corneal endothelial wound healing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2016;57(3):1284-1292.
33. Okumura N, Inoue R, Okazaki Y, et al. Effect of the Rho kinase inhibitor Y-27632 on corneal endothelial wound healing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015;56(10):6067-6074.
34. Bostan C, Theriault M, Forget KJ, et al. In vivo functionality of a corneal endothelium transplanted by cell-injection therapy in a feline model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2016;57(4):1620-1634.
35. Okumura N, Koizumi N, Kay EP, et al. The ROCK inhibitor eye drop accelerates corneal endothelium wound healing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2013;54 (4):2493-2502.
36. Koizumi N, Okumura N, Ueno M, Kinoshita S. New therapeutic modality for corneal endothelial disease using Rho-associated kinase inhibitor eye drops. Cornea. 2014;33(suppl 11):S25-S31.
37. Okumura N, Sakamoto Y, Fujii K, et al. Rho kinase inhibitor enables cell-based therapy for corneal endothelial dysfunction. Sci Rep. 2016;6: 26113.
38. Iovieno A, Neri A, Soldani AM, Adani C, Fontana L. Descemetorhexis without graft placement for the treatment of Fuchs endothelial dystrophy: preliminary results and review of the literature. Cornea. 2017;36(6):637-641.
39. Moloney G, Petsoglou C, Ball M, et al. Descemetorhexis without grafting for Fuchs endothelial dystrophy-supplementation with topical ripasudil. Cornea. 2017;36(6):642-648.
40. Arbelaez JG, Price MO, Price FW Jr. Long-term follow-up and complications of stripping descemet membrane without placement of graft in eyes with Fuchs endothelial dystrophy. Cornea. 2014;33(12): 1295-1299.
41. Bleyen I, Saelens IE, van Dooren BT, van Rij G. Spontaneous corneal clearing after Descemet's stripping. Ophthalmology. 2013;120(1):215.
