CC BY
42
УДК 615.276:616.233-002:593.95
ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ СВОЙСТВ КОМПЛЕКСА ГЛИКОЗИЛИРОВАННЫХ ПЕПТИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МОРСКИХ ЕЖЕЙ ВИДА STRONGYLOCENTROTUS DROEBACHIENSIS, НА МОДЕЛИ ОСТРОГО БРОНХИТА
Кательникова А.Е.1'2
3 2
Научные руководители - д.м.н. Воробьева В.В. , д.ф.н. Шиков А.Н.
1ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Минздрава России, Россия,191015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, 41 2ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации», Россия,188663, Ленинградская обл., Всеволожскийр-он, пос. Кузьмоловский,245
3ФГБОУ ВО «Смоленский государственный медицинский университет» Минздрава России, Россия, 214019, Смоленск, ул. Крупской, 28
E-mail: spbpharm@,mail.ru - Кательникова Анастасия Евгеньевна v. v. vorobeva@mail. ru - Воробьева Виктория Владимировна alexs 79@mail. ru - Шиков Александр Николаевич
Резюме. Проведено изучение противовоспалительной активности комплекса гликозилированных полипептидов (КГП), выделенных из морских ежей вида Strongylocentrotus droebachiensis, на модели острого бронхита, индуцированного эндотрахеальным введением 1% раствора формалина у крыс-самцов линии Wistar. Животным экспериментальных групп распыляли ингаляционно раствор КГП в дозах 25, 50 и 100 мкг/кг, контрольным животным -препарат сравнения амброксол в дозе 3,6 мг/кг один раз в день на протяжении 7 дней, начиная со дня индукции патологии. Через 24 ч после индукции патологии КГП в дозе 100 мкг/кг снижал общее количество лейкоцитов в бронхоальвеолярном лаваже на 34%, через 48 ч - на 61% по сравнению с контрольной группой животных (р<0,05). По результатам исследования установлена противовоспалительная активность комплекса гликозилированных полипептидов в дозах 25, 50 и 100 мкг/кг массы животного, не уступающая в данной модели, аналогичной активности амброксола (3,6 мг/кг).
Ключевые слова: комплекс гликозилированных полипептидов, острый бронхит, индуцированный формалином; морские ежи, Strongylocentrotus droebachiensis, амброксол
STUDY OF ANTIINFLAMATORY PROPERTIES OF GLYCATED PEPTIDE COMPLEX ISOLATED FROM SEA URCHIN STRONGYLOCENTROTUS DROEBACHIENSIS ON THE MODEL OF ACUTE BRONCHITIS
• 12 Katelnikova А.Е. '
Scientific advisors - Vorobieva V. V., Doctor of Medicine ; Shikov A.N. ' Doctor of Pharmacy
1 Northwest State Medical University of I.I. Mechnikov, Russia, 191015, Saint-Petersburg, Kirochnaya St., 41
Saint-Petersburg Institute of Pharmacy, Russia, 188663, Leningradskaya reg., Vsevolozhskiy district, Kuzmolovskiy, 245
о
Smolensk State Medical University, Russia, 214019, Smolensk, Krupskoy St., 28
Summary. The anti-inflammatory activity of glycosylated polypeptide complex (GPC) extracted from sea urchin Strongylocentrotus droebachiensis was studied on the model of acute bronchitis induced by formalin in rats. The experiment was performed in Wistar male rats. All animals were divided into six groups: four experimental, one control and one intact group. The
animals in the experimental groups were inhalated GPC in the doses of 25 /g/kg, 50 /g/kg and 100 /g/kg and the comparison drug Ambroxol in the dose of 3.6 mg/kg, once a day, starting from the 1th day of acute bronchitis induction and during the following 7 days. Acute bronchitis was induced by endotracheal administration of 1% formalin solution. Bronchopulmonary lavage was analyzed after 24, 48 and 72 hours and histological study of the lung tissue was done after 7 days of administration. Administration of GPC at the dose of 100 /g/kg 24 hours after the pathology induction decreased the total number of leukocytes in bronchoalveolar lavage by 34%. 48 hours after induction of inflammation, GPC at the doses of 50 and 100 /g/kg reduced the number of leukocytes by 54% and 61%, respectively, and 65% after 72 hours for all doses studied, compared to the control group of animals. The number of goblet cells GPC decreased by 15% compared with the control group after 7 days of treatment. Thus, antiinflammatory activities of the GPC in all the studied doses were shown. Further studies of the GPC for treatment of acute bronchitis would be important.
Keywords: glycosylated polypeptide complex; acute bronchitis, formalin; sea urchins; Strongylocentrotus droebachiensis, Ambroxol
Введение. Острые инфекции нижних дыхательных путей по распространенности, тяжести течения, потенциальной опасности развития летальных исходов, сложности эффективной терапии, социальной и экономической значимости лидируют среди важнейших групп заболеваний в современной медицине. Разработка средств этиотропной и патогенетической терапии острых бронхолегочных заболеваний по-прежнему сохраняет приоритетное значение [1,4].
Определенные перспективы в качестве лекарственных средств,
обладающих противовоспалительной
активностью, имеют препараты, созданные на основе природного сырья, в частности морских гидробионтов [2]. Антимикробные пептиды гидробионтов рассматриваются в настоящее время в качестве ведущих факторов системы их врожденного иммунитета [3]. Среди выделенных из морских организмов пептидов найдено 35 новых соединений с антимикробной активностью [9].
Выделенный из морского окуня Epinephelus coioides пептид эпинесидин-1, содержащий 21 аминокислоту, в дозе 500 мг на среднюю массу животного повышал уровень иммуноглобулина G1 и интерлейкина ГЬ-10 в экспериментах на мышах, усиливая реализуемый через Т-
лимфоциты - хелперы 2 типа (Th2) ассоциированный иммунный ответ на инфекцию, вызванную Pseudomonas aeruginosa [11].
Пептид хризопсин-1 из красного пагра Chrysophrys major проявил широкоспектральную противомикробную, а также противовоспалительную активность путем ингибирования TNF-a макрофагов в клеточной линии RAW264 [6]. Циклический тетрапептид аспертеррестид А, источником которого являются морские грибы Aspergillus terreus, оказался способным подавлять вирусы гриппа штаммов A/WSN/33 (H1N1) и A/Hong Kong/8/68(H3N2) [8].
Особый интерес представляет изучение комплекса биологически активных веществ из морских ежей. Например, пептид CEN1 HC, выделенный из зеленого морского ежа Strongylocentrotus
droebachiensis и состоящий из 30 аминокислотных последовательностей, в сочетании с противовоспалительным действием уменьшал количество бактерий S. aureus и метициллинрезистентных S. aureus (MRSA) на моделях инфицированных ран. Экспозиция с пептидом CEN1 HC при концентрациях 0,5 и 2 мг/мл снижала количество бактерий более чем на 90%, проявляя антибактериальную активность не
только в отношение MRSA стафилококков, но и синегнойной палочки [5].
Целью исследования явилась сравнительная оценка эффективности комплекса гликозилированных
полипептидов, выделенных из морских ежей вида Strongylocentrotus droebachiensis с действием амброксола на модели острого бронхита.
Методы исследования. В
эксперименте использованы крысы-самцы линии Wistar весом 200-250±15,0, полученные из питомника лабораторных животных РАМН «Рапполово». Животных содержали в виварии в стандартных условиях на полнорационной
сбалансированной по содержанию питательных веществ диете для лабораторных животных (ГОСТ Р 50258-92). Исследования были выполнены согласно методическим руководствам и нормативным документам, правилам лабораторной практики проведения доклинических исследований в Российской Федерации (ГОСТ Р 53434-2009) и Директиве 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях».
Тестируемая субстанция представляет собой комплекс гликозилированных полипептидов (КГП), выделенных из морских ежей вида Strongylocentrotus droebachiensis. Методами газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ-МС) и
высокоэффективной жидкостной
хроматографии (ВЭЖХ-ELSD) установлено, что субстанция содержит 10-15% пептидов, 35-45% аминокислот, 4-8% фосфолипидов, микроэлементы, сахара. При проведении электрофореза в полиакриламидном геле идентифицированы индивидуальные
пептиды с молекулярными массами 19-15, 6-3,5 и менее 3,5 кДа. Для подтверждения наличия противовоспалительных свойств в качестве препарата сравнения использовали производное дибромбензиламина,
муколитик непрямого действия - амброксол (Амбробене, MERCKLE, GmbH, Германия).
Экспериментальные животные были разделены на 4 экспериментальных, контрольную и интактную группы (n = 28). В качестве индуцирующего острый бронхит агента, использовали 1% раствор формалина [10, 13], который вводили животным с помощью зонда для эндотрахеального введения модели IA-1B-R (Penn-Century Inc., USA) на фоне легкого наркоза «Золетилом» (Virbac S.A., Франция) в дозе 2,6 мг/кг.
Раствор КГП распыляли при помощи ультразвукового ингалятора «Муссон-2» (ФГУП «Алмаз», Россия) в индивидуальные изолированные боксы для животного из расчета 25, 50 и 100 мкг/кг; амброксол - 3,6 мг/кг [7] один раз в день на протяжении 7 дней. Интактная и контрольная группы животных получали аэрозоль
дистиллированной воды. Через 24, 48 и 72 ч введения формалина животных подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации и осуществляли забор бронхолегочного лаважа (БАЛ) с последующим определением количества лейкоцитов и лейкоцитарной формулы (гранулоциты, моноциты, лимфоциты).
Статистический анализ данных выполняли с помощью программного обеспечения Статистика 6.0 (StatSoft, США). Для статистической оценки клеточного состава БАЛ использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), с последующим межгрупповым сравнением (post hoc) с использованием теста Тьюки (post hoc Tukey's). Различия были определены при 0,05 уровне значимости.
Результаты. При оценке
лейкоцитарного состава
бронхоальвеолярного лаважа через 24 и 48 ч после индукции воспаления, в контрольной группе животных отмечено повышение содержания лейкоцитов за счет увеличения популяции моноцитов и гранулоцитов, через 72 ч - благодаря увеличению популяции лимфоцитов (рис. 1). Уровень лейкоцитов в бронхоальвеолярном лаваже контрольных животных статистически значимо превосходил данный показатель интактной группы в 12,7 и 5 раз на
соответствующей временной точке измерения клеточного состава (ANOVA, p<0,05). Увеличение содержания лимфоцитов и моноцитов относительно показателей интактной группы животных в среднем по трем точкам измерения составило 3, 4 и 4,8 раз соответственно. Значительное увеличение популяции гранулоцитов в 62 раза по сравнению с интактными животными зафиксировано через 24 ч, на остальных временных точках в 19 и 5 раз соответственно после инициации патологического процесса. Через
24-72 ч после индукции патологии в экспериментальных группах, получавших КГП в дозе 100 мкг/кг, отмечено достоверное снижение числа лейкоцитов, моноцитов и гранулоцитов по сравнению с контрольной группой животных (рис. 1), аналогично тому, что наблюдается на фоне применения амброксола (рис. 1). Анализ динамики количества лимфоцитов на фоне амброксола и КГП показал рост показателя через 48 ч наблюдения, вслед за которым последовало его снижение (рис.1).
Рисунок 1. Клеточный состав бронхоальвеолярного лаважа крыс через 24, 48 и 72 ч после
индукции острого бронхита: БАЛ - бронхоальвеолярном лаваж; - статистически значимые
#
различия по сравнению с контрольными животными; - различия статистически значимы по сравнению с интактными животными, (тест Тьюки, р < 0,05).
Выводы
На модели катарально-гнойного бронхита, индуцированного формалином [10, 13], показано наличие
противовоспалительных свойств у комплекса гликозилированных
полипептидов (КГП), выделенных из морских ежей вида Strongylocentrotus droebachiensis. Выраженность
противовоспалительной активности КГП в дозе 100 мкг/кг, оцененная по количеству иммуннокомпетентных и фагоцитирующих клеток крови, сопоставима с аналогичной активностью амброксола в дозе 3,6 мг/кг веса экспериментального животного. Но,если механизмы
противовоспалительного действия
амброксола обусловлены снижением
концентрации провоспалительных
цитокинов интерлейкина (ИЛ-)1р, ИЛ-6 и ИЛ-8, активности транскрипционного фактора КБ-кВ, отвечающего за инициирование синтеза провоспалительных факторов в клетке [7], то фармакодинамика изучаемых полипептидов, извлеченных из гидробионтов, пока неизвестна, и представляет интереснейший объект для дальнейших научных исследований.
Литература
1. Казанцев В.А. Инфекции нижних дыхательных путей: парадигма рациональной терапии. // Consilium medicum. - 2013. - Т. 15. - №11. - С. 28-32.
2. Крыжановский С.П. Биологически активные вещества морских ежей -основа для разработки лекарственных препаратов и фармацевтических субстанций. // Бюллетень СО РАМН. - 2013. - Т. 33. - №2. - С. 39-48.
3. Меньшенин А.В., Алешина Г.М., Леонова Ю.Ф. и др. Новый антимикробный пептид из сцифоидной медузы Aurelia aurita. // Вестник СПбГУ. Серия 3. Биология. - 2006. - №4. - С. 116-122.
4. Balsamo R., Lanata L., Egan C.G. Mucoactive drugs. // Eur. Respir. Rev. - 2010.
- N 19 (116). - Р. 127-133.
5. Björn C., Häkansson J., Myhrman E. et al. Anti-infectious and anti-inflammatory effects of peptide fragments sequentially derived from the antimicrobial peptide centrocin 1 isolated from the green sea urchin, Strongylocentrotus droebachiensis. // AMB Express. - 2012. -V. 2, N1. - Р.1-12.
6. Cheung R.C.F., Ng T.B., Wong J.H. et al. Marine natural products with antiinflammatory activity. // Applied microbiology and biotechnology. - 2015. - Р. 1-22.
7. Disse K. The pharmacology of ambroxol review and new results. // Eur. J. Resp. Dis. - 1987. - V. 153. - N7. - P. 255-262.
8. He F., Bao J., Zhang X.Y. et al. Asperterrestide A, a cytotoxic cyclic tetrapeptide from the marine-derived fungus Aspergillus terreus SCSGAF0162. // Journal of natural products.
- 2013. - V. 76, N6. - P. 1182-1186.
9. Kang H.K., Seo C.H., Park Y. Marine peptides and their anti-infective activities. //Marine drugs. - 2015. - V. 13, N1. - P. 618-654.
10. Lee M.J., Jang M., Jung H.S. et al. Ethyl Pyruvate Attenuates Formalin-induced Inflammatory Nociception by Inhibiting Neuronal ERK Phosphorylation. // Molecular Pain. -2012. - V. 8, N1. - P. 40.
11. Lee S.C., Pan C.Y., Chen J.Y. The antimicrobial peptide, epinecidin-1, mediates secretion of cytokines in the immune response to bacterial infection in mice. // Peptides. - 2012.
- V. 36, N 1. - P. 100-108.
12. Lee M.J., Jang M., Jung H.S. et al. Ethyl Pyruvate Attenuates Formalin-induced Inflammatory Nociception by Inhibiting Neuronal ERK Phosphorylation. // Molecular Pain. -2012. - V. 8, N1. - Р. 40.
13. Won K.A., Kang Y.M., Lee M.K. et al. Participation of Microglial p38 MAPK in Formalin-Induced Temporomandibular Joint Nociception in Rats. // Journal of orofacial pain. -2012. - V. 26, N2. -Р. 132-41.
