CC BY
25
Изучение противовирусной активности препарата Панавир при экспериментальной инфекции, вызванной вирусом кори
в культурах клеток
С. Г. МАРКУШИН, А. А. ЛИТВИН*
НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН, Москва * Национальная исследовательская компания, Москва
Antiviral Activity of Panavir in Experimental Infection Due to Morbillivirus in Cell Cultures
S. G. MARKUSHIN, A. A. LITVIN
I. I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow National Research Company, Moscow
Исследована антивирусная активность препарата Панавир на экспериментальной модели инфекции, вызванной вирусом кори, в перевиваемых культурах клеток Veгo и В-16. Показано, что при множественности заражения (0,001—0,0001 ТЦД50/кл) Панавир ингибирует размножение вируса кори.
Ключевые слова: панавир, антивирусная активность, вирус кори
Antiviral activity of Panavir was studied in a model of experimental infection due to Morbillivirus in subcultures of cells Vero and B-16. It was shown that at multiplicity of the infection (0.001—0.0001 TCD50/cell) Panavir inhibited reproduction of the virus in concentrations of 12—100 Mcg/0.2 ml.
Key words: panavir, antiviral activity, Morbillivirus
Корь занимает важное место в инфекционной патологии человека, являясь одной из наиболее распространённых детских инфекций. Для неё характерны достигающие больших размеров вспышки и эпидемии. В развивающихся странах смертность от кори составляет более одного миллиона человек в год. В США и европейских странах, включая Россию, отмечается в настоящее время «повзросление» кори, т. е. увеличивается число случаев заболевания молодых людей и взрослых. В связи с этими обстоятельствами Всемирная организация здравоохранения поставила задачу снижения смертности от данного заболевания на 95%, а заболеваемости корью на 90% по сравнению с уровнями, которые наблюдались до начала широкомасштабной программы вакцинации против кори.
Вакцинация против кори показывает высокую эффективность. Вместе с тем, учитывая большое количество серьёзных осложнений в процессе заболевания корью, а также недостаточно эффективную вакцинацию против кори в отдельных районах земного шара, важное значение
© С. Г. Маркушин, А. А. Литвин, 2009
Адрес для корреспонденции: 105064 Москва, М. Казенный пер., 5А. НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова
имеют другие способы борьбы с данной инфекцией, в частности, разработка препаратов, способных воздействовать на вирус кори на различных этапах его внутриклеточной репродукции.
Цель настоящего исследования заключалась в оценке противовирусной активности препарата Панавир на экспериментальной модели инфекции, вызванной вирусом кори, в перевиваемых культурах клеток.
Материал и методы
В работе использовали отечественный вакцинный штамм Л-16 вируса кори, относящийся к генетической линии 1. В процессе исследования были использованы инфекционные дозы штамма Л-16 в диапазоне от 1 до 0,0001 ТЦД50/кл.
Действие препарата на репродукцию вакцинного штамма Л-16 наблюдали в культуре перевиваемых клеток Vero, полученных из Национального института биологических стандартов (Лондон, Великобритания), а также в перевиваемой культуре В-95 (перевиваемая культура лимфобластов мармозетов), полученной из Института Р. Коха (Берлин, Германия). Обе культуры использовали в виде однодневного монослоя клеток, выращенного в 96-луночных пластиковых панелях фирмы Costar. Для пересева и проддержания культур использовали синтетические среды RPMI-1640 и MEM с добавлением 5% фетальной сыворотки HyClone с добавлением глутамина и гентамицина.
Препарат Панавир был предоставлен фирмой «Национальная исследовательская компания» в виде лиофилизиро-ванной субстанции. Разведения препарата, содержащие раз-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Таблица 1. Цитотоксическое действие препарата Панавир на клеточные культуры Vero и В-95а
Концентрация препарата мкг/0,1 мл 1000 100 50 25 12,5 6,25 3,1 1,0 0,5 0,25
% жизнеспособных клеток Уего на 4-й день
после внесения препарата 0 50 100 100 100 100 100 100 100 100
% жизнеспособных клеток В-95а на 4-й день
после внесения препарата 0 50 100 100 100 100 100 100 100 100
Таблица 2. Вирулицидное действие препарата Панавир при температуре 4°С
Материал в пробе Титр вируса ТЦД50/мл 0 час 144 часа
Штамм Л-16 вируса кори Штамм Л-16 вируса кори + Панавир* 104-0 1030 104-0 102-°
Примечание. * Концентрация препарата Панавир в пробе составляла 5 мг/мл. К 1,0 мл. вируссодержащей жидкости с титром 2Х1040 ТЦД50/кл добавляли 1,0 мл препарата Панавир с концентрацией 10 мг/мл. Нулевые пробы титровали в начале опыта.
личные его концентрации были сделаны на питательных средах RPMI-1640 и MEM. Для изучения противовирусного действия препарата Панавир, последний в различных концентрациях вносили в инфицированные вирусом культуры клеток Vero и В-95а в момент заражения, за 1 час до заражения и через 1 час после заражения клеток вирусом. Инфекционную активность вируса кори учитывали по результатам титрования начиная с 3-го дня после инфекции, учитывая количество симпластов в каждой лунке и используя формулу Рида и Мен-ча для подсчёта титра вируса кори.
Результаты и обсуждение
В первой серии экспериментов проводилось изучение цитотоксического действия Панавира на перевиваемые культуры клеток, выбранных для проведения исследования. С этой целью препарат в различных концентрациях вносили в культуру клеток Vero (однодневную, в каждую лунку вносили по 30000 клеток). Концентрации препарата варьировали в пределах от 10 мг/мл до 0,5 мкг/мл. Монослой клеток наблюдали в течение 10 дней. Полная гибель клеток наблюдалась на вторые сутки при концентрации препарата 10 мг/мл. Значительная часть клеток погибала через три дня при концентрации 1 мг/мл. При более низких концентрациях цитотоксический эффект не наблюдался . Аналогичные результаты наблюдались в отношении перевиваемой культуры В-95а. Следует отметить, что данная культура частично отслаивается от стекла через 4—5 дней, поэтому опыты с применением данной культуры проводились в период 5 дней (табл. 1).
Полученные данные позволяли сделать вывод, что препарат Панавир в концентрации ниже 500 мкг/мл не обладал цитотоксическими свойствами в отношении вышеупомянутых клеточных культур и это позволяло использовать более низкие концентрации препарата для изучения его антивирусного действия. Однако прежде было целесообразно исследовать вирулицидное действие этого препарата, учитывая его широкий спектр действия. С этой целью к 1 мл вируссодержащей
жидкости штамма Л-16 вируса кори добавляли равное количество препарата Панавир в концентрации 10 мг/мл и инкубировали при температурах 37°С и 4°С различные периоды времени. Аликвоты отбирались и титровались в культуре Уего. Результаты опытов представлены в табл. 2.
Было обнаружено, что при температуре 37°С происходит быстрая инактивация вируса, даже при отсутствии препарата, что не позволяло исследовать его вирулицидное действие. Данные, полученные при инкубации вируса с препаратом при температуре 4°С, позволяют сделать вывод о том, что препарат в концентрации 5 мг/мл обладает слабым вирулицидным действием.
В следующей серии экспериментов было исследовано антивирусное действие препарата в отношении вируса кори. С этой целью клетки Уего были инфицированы штаммом Л-16 с различной множественностью заражения (0,1 ТЦД50/кл, 0,001 ТЦД50/кл, 0,0001 ТЦД50/кл) при концентрациях препарата в диапазоне от 100 мкг/0,2 мл до
0, 1 мкг/0,2 мл. Через 4 дня инкубации при 37°С пробы замораживали и затем их титровали в культуре клеток Уего. Результаты опытов представлены в табл. 3.
Как видно из табл. 3, препарат обладал антивирусным действием в отношении вируса кори при концентрациях 100 мкг/0,2 мл — 12 мкг/0,2 мл при множественности заражения: 0,001—0,0001 ТЦД50/кл. Эффект подавления вирусной репродукции особенно проявлялся при множественности заражения 0,0001 ТЦД50/кл: снижение инфекционного титра вируса достигало 2—3 ^.
Представляло интерес выяснить, на какой стадии цикла репродукции вируса кори действует препарат Панавир. С этой целью препарат вносили в среду за 1 ч до инфицирования клеток вирусом, одновременно с инфицированием и через час после инфицирования. Результаты исследования отражены в табл. 4, 5. Как видно из данной
Таблица 3. Влияние воздействия препарата Панавир на репродукцию вакцинного штамма Л-16 вируса кори в культуре клеток Vero
Пробы Титр вируса ТЦЦ50/мл
Множественность Множественность Множественность
заражения заражения заражения
0,1 ТЦЦ50/кл 0,001 ТЦЦ50/кл 0,0001 ТЦЦ50/кл
Штамм Л-16 (контроль) 104-с 104-0 103-0
Штамм Л-16 + панавир (100 мкг/0,2мл) 1040 1020 1020
Штамм Л-16 + панавир (50 мкг/ 0,2 мл) 104-0 103-0 101-0
Штамм Л-16 + панавир (25 мкг/0,2 мл) 104-0 103-0 <101-1
Штамм Л-16 + панавир (12,5 мкг/0,2 мл) 1040 103-25 10«
Штамм Л-16 + панавир (6 мкг/0,2 мл 104-25 103-0 101-0
Штамм Л-16 + панавир (3 мкг/0,2 мл) 104-5 104-0 101-5
Примечание. Суточный монослой клеток Vero (30 000 кл/лунка) инфицировали вирусом кори с множественностью заражения 0,1 ТЦД50/кл, 0,001 ТЦД50/кл, 0,0001 кл/кл. Вирус вносили в объеме 0,1 мл. На 4-день с момента
инфицирования клетки замораживали. Затем пробы титровали в культуре клеток Vero.
Таблица 4. Влияние препарата Панавир на репродукцию вируса кори в клетках Vero в зависимости от момента внесения препарата (в дозе 100 мкг/0,2 мл)
Вариант опыта Титр вируса ТЦЦ50/мл
Препарат внесён за 1 час до инфекции 102-5
Препарат внесён одновременно с вирусной инфекцией 102-5
Препарат внесён через 1 час после вирусной инфекции 103-5
Контроль (размножение вируса без препарата) 104-0
Примечание. Суточный монослой клеток Vero (30 000 клеток/ лунка) инфицировали вирусом с множественностью 0,0001 ТЦД50/кл. Вирус вносили в объеме 0,1 мл. В различное время: за 1 час до инфекции, одновременно и через 1 час после инфекции вносили препарат в дозе 100 мкг. Конечный объём среды после внесения препарата был равен 0,2 мл. На 4-е сутки клетки замораживали и затем пробы титрировали.
Таблица 5. Влияние препарата Панавир, внесённого за час до заражения, на репродукцию штамма Л-16
вируса кори в клетках В-95а
Проба Титр вируса ТЦЦ50/кл
Контроль (размножение вируса без препарата) 103-5
Вирус + препарат 10 мкг/0,2 мл 102С
Вирус + препарат 50 мкг/0,2 мл 102С
Вирус + препарат 6 мкг/0,2 мл 103С
таблицы, штамм Л-16 активно репродуцировался в контроле. Внесение препарата за 1 ч до адсорбции вируса на клетках приводило к снижению вирусной репродукции на 1,5 ^. Аналогичные результаты были получены при внесении препарата в момент инфекции. В то же время внесение препарата через 1 ч после адсорбции вируса на клетках незначительно снижало титр вируса. Полученные факты свидетельствуют о том, что препарат действует на ранних стадиях цикла репродукции вируса кори. Можно предполагать, что антивирусное действие препарата Панавир обусловлено нарушением адсорбции вируса на клеточной поверхности. Учитывая полисахаридную природу препарата, можно допустить наличие конкуренции между молекулами препарата и полисахаридными компонентами клеточных рецепторов за связывание с вирусными рецепторами в момент адсорбции.
Выводы
1. Препарат Панавир обладает вирулицид-ным действием.
2. Препарат ингибирует размножение вируса кори в концентрации 12—100 мкг/0,2 мл в клетках различного происхождения, инфицированных с множественностью заражения 0,001—0,0001 ТЦД50/кл.
3. Изучение особенностей действия препарата позволяет сделать вывод, что его активность проявляется на ранних стадиях взаимодействия вируса и клеток. Возможно, препарат препятствует адсорбции вируса на клетках.
4. Препарат обладает достоверным антивирусным действием в отношении вируса кори.
