CC BY
215
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 615.281.8.03:616.98:578.831.3].036.8
Е. И. Исаева1, В. Е. Небольсин2, И. С. Козулина2, О. В. Морозова1
Изучение противовирусной активности Ингавирина® in vitro в отношении метапневмовируса человека
'ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России; 2ОАО «Валента Фарм», Москва
Исследовали противовирусную активность Ингавирина® в отношении инфекции, вызванной метапневмовирусом человека (HMPV) in vitro. В работе были использованы пермиссивная для HМРV клеточная линия человека Chang Conjunctiva, клон 1-5С4, и штамм HMPV, выделенный в институте вирусологии имени Д. и. ивановского. Проведенные экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что при внесении в питательную среду ингавирина® в концентрации от 50 до 500 мкг/мл через 24 ч после инфицирования HMPV он эффективно подавляет репродукцию вируса на 2,2-3,3 lg соответственно. В концентрации 500 мкг/мл ингавирин® защищал клетки от инфекции HMPV при внесении его за 24 ч до инфицирования клеток.
Ключевые слова: метапневмовирус человека, Ингавирин®, рибавирин, клеточная линия человека Chang Conjunctiva, клон 1-5С4, противовирусная активность
In vitro investigation of the antiviral activity of Ingavirin® against human metapneumovirus
E. I. Isayeva1, V. E. Nebolsin2, I. S. Kozulina2, O. V. Morozova1
1D. I. Ivanovsky Research Institute of Virology, Ministry of Health and Social Development of Russia, Moscow;
2OAO Valenta Pharm, Moscow
The antiviral activity of Ingavirin® against human metapneumovirus (HMPV) infection was investigated in vitro. The investigation used the human cell line ChangConjunctiva, permissive for HMPV, clone 1-5C4, and the HMPV strain isolated at the D. I. Ivanovsky Research Institute of Virology. The experimental studies suggest that when added at a concentration of 50 to 500 pg/ml to a nutrient medium 24 hours after HMPV infection, Ingavirin® suppressed effectively virus replication by 2.2-3.3 logs, respectively. When used at a concentration of 500 pg/ml 24 hours before cell infection, Ingavirin® protected cells from HMPV infection.
Key words: human metapneumovirus; Ingavirin®; Ribavirin; the human cell line ChangConjunctiva, clone 1-5C4; antiviral activity
Метапневмовирус человека (HMPV) впервые был выделен из респираторных образцов у детей с ОРЗ неясной этиологии в Нидерландах и Швеции в 2001 г. Впоследствии он был обнаружен у людей всех возрастов на всех континентах. В настоящее время многие зарубежные исследователи рассматривают HMPV в качестве одного из лидирующих патогенов в этиологической структуре вирусных заболеваний нижних дыхательных путей в детском возрасте и у пожилых пациентов [1, 6, 9, 11, 17]. Известно, что HMPV способен проникать в ЦНС, приводя к развитию тяжелых энцефалитов [14].
Несмотря на ограниченные данные о патогенезе HMPV-инфекции в организме человека, в настоящее время ведутся исследования по разработке специфических противовирусных препаратов. В качестве потенциальной терапевтической стратегии рассматривается применение рибавирина, сульфатидсиалила липида (NMSO3), моноклональных антител, ингибиторов вирусно-клеточного слияния, а также наномолекул siRNAs, обладающих специфической анти-HMPV-активностью [10, 12, 20].
Имеются достижения в исследованиях по созданию моноклональных нейтрализующих антител к F-белку HMPV, которые оказались способными нейтрализовать прототипные штаммы А и В подгрупп HMPV in vitro [15].
Между тем самый инновационный подход, который открывает новую терапевтическую концепцию, - использование siRNAs - наномолекул, обладающих специфической анти-HMPV-активностью, заключаю-
щейся в подавлении репликации РНК HMPV, продемонстрировали С. Deffrasnes и соавт. [10].
На экспериментальных моделях in vitro было показано, что рибавирин оказывает эффективное действие на HMPV, значительно снижая вирусную нагрузку. Риба-вирин применяют для лечения тяжелых случаев ОРВИ, однако его использование ограничено токсичностью препарата [19].
Тем не менее в настоящее время в клинической практике врача лечение заболеваний, ассоциированных с HMPV, остается симптоматическим. Умеренное и тяжелое течение инфекции может требовать поддерживающей гидратации и дополнительной оксигенотерапии. Пациентам с тяжелой дыхательной недостаточностью необходима искусственная вентиляция легких [16, 18]. В связи с этим поиск противовирусных препаратов остается весьма актуальной проблемой.
В последние годы в качестве противовирусного средства применяется препарат Ингавирин®, который обладает способностью подавлять активность вирусов гриппа А H3N2 и H1N1, гриппа В, парагриппа, аденовируса и активно изучается в клинической практике [1-5, 8].
Задачей настоящего исследования являлось установление эффективности противовирусного лекарственного препарата Ингавирин® в отношении HМРV на экспериментальной модели in vitro.
Материалы и методы
Вирус. В исследовании использовали авторский вирулентный штамм метапневмовируса (HMPV), выде-
Контактная информация:
Исаева Елена Ивановна, канд. биол. наук, вед. науч. сотр.; e-mail: [email protected]
34
ленный из носоглоточного смыва ребенка и депонированный в Государственную коллекцию вирусов (рег. № 2476).
Культура клеток. Исследование проводили на пер-миссивной для HMPV эпителиальной клеточной линии человека Chang Conjunctiva, клон 1-5С4. В работе использовали монослой перевиваемой клеточной линии Chang Conjunctiva, выращенный на среде 199 и Игла МЕМ (1:1) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Hy Clone , США), L-глутамина и антибиотиков. Все вируссодержащие пробы включали трипсин в концентрации 5 мкг/мл.
Определение активности HMPV. Детекцию РНК HMPV в супернатантах инфицированной эпителиальной клеточной линии человека Chang Conjunctiva, клон 1-5С, проводили с помощью ПЦР. За титр вируса принимали наибольшее разведение супернатанта зараженной культуры, в котором идентифицировали РНК HMPV.
Инфекционный титр вируса определяли общепринятым методом путем внесения 10-кратных разведений вируса на подготовленный монослой клеток. Вирус был адсорбирован в течение 1 ч при 37°С, после чего была добавлена соответствующая среда, содержащая 2% сыворотки и 2 мкг/мл трипсина. Инфицированные клетки инкубировали в течение 5-6 дней при 37°С. После этого в надосадочной жидкости клеточной культуры определяли инфекционный титр HMPV (представлен как среднее е значение lg ± m).
В опытах использовали множественность заражения для инфицирования 0,01 и 0,1 ТЦИД50/клетка. Питательная среда поддержки содержала 2 мкг/мл трипсина («Sigma» США), необходимого для репликации этого вируса [10].
Препараты. Противовирусный препарат Ингавирин® производства ОАО «Валента Фарм».
В качестве референс-препарата был использован Ри-бавирин (ООО «Озон», Россия).
Включенные в исследование препараты зарегистрированы, внесены в Государственный реестр лекарственных средств РФ и разрешены к применению.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для выделения РНК вируса применяли коммерческие тест-системы «Рибо-сорб» производства «Амплисенс» (Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Для амплификации HMPV использовали тест-системы производства «Амплисенс» (Россия). Также были использованы праймеры для ПЦР, любезно предоставленные профессором С. О. Вязовым (Эссен, Германия) из области N-гена [17]. ПЦР проводили в двухраундовом режиме по 35 циклов каждый: 94°С - 1 мин, 60°С - 1 мин и 72°С - 2 мин в режиме автоматической амплификации на приборе «Терцик» (ЗАО «ДНК-Технология», Москва). Продукты ПЦР анализировали методом горизонтального электрофореза в 1,7% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, с последующей визуализацией в ультрафиолетовом спектре. Количество продукта анализировали, используя денситометрическую компьютерную программу Image J. 1.36 I на флюоресцентном ПЦР-анализаторе Ала1/4 (Biosan).
Исследование цитотоксического действия противовирусных препаратов на культуре клеток. В системе доклинического исследования лекарственных препаратов первым этапом является оценка токсичности соединений для культуры клеток [7]. Как правило, в процессе исследования токсичности соединений изучают влияние различных концентраций препаратов на морфологию клеток, на которых проводят все дальнейшие исследования.
Токсичность препаратов оценивали по жизнеспособ-
ности незараженных клеток культуры Chang Conjunctiva путем воздействия различных концентраций препаратов. Монослой клеточной линии Chang Conjunctiva культивировали в присутствии лекарственных препаратов, добавленных в концентрациях от 12,5 до 1000 мкг/мл в течение 96 ч при 37°С. Результаты учитывали по появлению цитодеструктивных изменений и изменению морфологических свойств культуры клеток. Концентрацию препарата, ингибирующую значение оптической плотности на 50% по сравнению с клеточным контролем, принимали за 50% цитотоксическую дозу (ЦТД50).
Параметры токсичности рассчитывали, используя установленные в эксперименте значения максимальной переносимой концентрации (МПК), т. е. максимальной концентрации, которая еще не вызывает видимые цитодеструктивные изменения в тканевой культуре.
Противовирусную активность препаратов изучали в культуре клеток Chang Conjunctiva. Инфицирование проводили дозой вируса 0,01 и 0,1 ТЦИД50/клетка на соответствующей среде с добавлением трипсина. Кон-троли вируса и клеток культивировали в этой же среде. Далее планшеты инкубировали в термостате с СО2 в течение 24 ч при 37°С, после чего к инфицированным клеткам культуры Chang Conjunctiva добавляли препараты в двукратной концентрации в 100 мкл среды за 24 ч до инфицирования и через 24 ч после инфицирования клеток. После инкубации клеток с исследуемыми препаратами при 37°С через 5-6 дней учитывали результат в ПЦР
Оценка противовирусного действия препаратов в культуре клеток включала количественное изучение подавления репродукции HMPV в культуре клеток Chang Conjunctiva. Противовирусный эффект препаратов in vitro оценивали по общепринятым показателям: снижение уровня накопления вируса под воздействием препарата (Alg), коэффициент ингибирования (КИ) [1].
Статистическая обработка данных. Статистический анализ результатов выполнен с применением ПО Microsoft Excel на персональном компьютере.
Инфекционные титры вируса рассчитывали по методу Рида и Менча [13].
Статистическую обработку результатов, касающихся эффективности лекарственных препаратов в отношении HMPV, проводили по методу Стьюдента. Достоверность различий определяли по величине р. Различия считали достоверными при р < 0,05, высокодостоверными при р < 0,001, недостоверными прир > 0,05.
Результаты и обсуждение
При исследовании способности 11 клеточных линий человека и животных поддерживать репродукцию вируса, наиболее чувствительной к HMPV оказалась эпителиальная клеточная культура человека Chang Conjunctiva, клон 1-5С4 [1]. Изучение противовирусной эффективности препаратов проводили на пермис-сивной для HMPV клеточной линии Chang Conjunctiva в присутствии трипсина. Результаты опыта учитывали на 5-6-е сутки после заражения вирусом, когда уровень накопления HMPV достигал максимума.
Результаты исследования цитотоксического действия противовирусных препаратов Ингавирин® и рибавирин на морфологию клеток линии Chang Conjunctiva представлены на рис. 1.
Препарат Ингавирин® до концентрации 500 мкг/мл не обладал цитотоксическими свойствами, видимые изменения морфологии клеток не отмечены на протяжении всего наблюдения. При максимальной концентрации 1000 мкг/мл деструктивные изменения происходили в 50% клеток линии Chang Conjunctiva.
35
120 -|
£
♦ ингавирин рибавирин
Рис. 1. Влияние концентрации препаратов на жизнеспособность клеток Chang Conjuctiva.
Рибавирин оказался более токсичным для культуры Chang Conjunctiva, величина МПК составила 100 мкг/мл. В концентрации до 100 мкг/мл он не вызывал видимые цитодеструктивные изменения в клеточной линии. В концентрации 300 мкг/мл рибавирина морфология у 50% клеток была изменена.
Результаты изучения эффективности препаратов в отношении HMPV на культуре клеток Chang Conjunctiva по подавлению инфекционной активности вируса представлены в табл. 1-2. Из табл. 1 следует, что Ингавирин® снижает инфекционный титр HMPV так же эффективно, как и рибавирин, и подавление инфекционной активности HMPV зависит от концентрации препаратов.
Через 24 ч после инфицирования Ингавирин® в концентрации 50-500 мкг/мл подавлял репродукцию вируса на 2,2-3,3 lg, КИ составил от 43,3 до 64,8%.
Внесение лекарственного средства в культуру клеток Chang Conjunctiva за 24 ч до инфицирования вирусом в концентрациях препарата 50-300 мкг/мл не влияло на
Рис. 2. Влияние различных концентраций препарата Ингавирин® на репродукцию метапневмовируса.
По оси абсцисс - концентрация препарата Ингавирин®, мкг/мл, по оси ординат - количество РНК метапневмовируса по конечной точке в пробах.
репродукцию вируса, при максимальной концентрации 500 мкг/мл инфекционная активность вируса была подавлена на 3,1 lg при КИ 61,4%.
Активность химиопрепарата рибавирин в отношении HMPV была достаточно высокой (см. табл. 2), что согласуется с данными зарубежных исследователей [19]. Эффективным оказалось использование препарата после инфицирования клеточной культуры вирусом в концентрации 50 мкг/мл. Частичное снижение инфекционного титра HMPV получено при внесении препарата за 24 ч до инфицирования.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что защитные свойства Ингавирина® зависят от дозы HMPV, используемой для заражения клеток Chang Conjunctiva. В частности, показано, что препарат в концентрации 50-300 мкг/мл не защищает от действия вируса клетки, инфицированные при множественности заражения 0,1 ТЦИД50. В то же время препарат, внесенный за 24 ч до заражения вирусом в концентрации 300 мкг/мл и выше, защищал культуру клеток от действия
Противовирусная активность препарата Ингавирин® в отношении HMPV
Таблица 1
Схема внесения препарата Инфицирующая доза вируса Концентрация препарата, мкг/мл Инфекционный титр вируса***
уровень накопления вируса, lg подавление репродукции вируса, Alg* КИ**, %
0,1 50 5,04 ± 0,75 0,04
0,01 50 4,0 ± 0,4 0,5 ± 0,1 11,1
0,1 100 4,75 ± 0,66 0,25 ± 0,15 4,9
0,01 100 3,8 ± 0,6 0,7 ± 0,2 15,6
За 24 ч до инфицирования 0,1 300 4,25 ± 0,88 0,75 ± 0,55 14,8
0,01 300 3,0 ± 0,3 1,5 ± 0,4 33,3
0,1 500 1,96 ± 0,97 3,12 ± 0,97 61,4
0,01 500 1,50 ± 0,6 3,0 ± 0,7 66,6
0,01 50 2,88 ± 0,94 2,2 ± 0,9 43,3
0,01 50 2,1 ± 0,3 2,4 ± 0,7 53,3
0,1 100 2,67 ± 0,77 2,87 ± 0,64 56,5
Через 24 ч после 0,01 100 1,5 ± 0,2 3,0 ± 0,9 ,66,6
инфицирования 0,1 300 2,04 ± 0,83 3,04 ± 0,83 59,9
0,01 300 1,3 ± 0,1 3,2 ± 0,8 71,1
0,1 500 1,79 ± 0,8 3,29 ± 0,8 64,8
0,01 500 1,0 ± 0,1 3,5 ± 0,9 77,7
Контроль вируса без 0,1 - 5,08 ± 0,75 - -
внесения препарата 0,01 - 4,5 ± 0,4 - -
Примечание. Здесь и в табл. 2: * - разность между уровнями накопления вируса; ** - коэффициент ингибирования; *** - средние значения по результатам 3 независимых опытов при 4 повторностях для каждой концентрации препарата.
36
Таблица 2
Противовирусная активность препарата рибавирина в отношении НМРУ
Схема внесения препарата Инфицирующая доза вируса Концентрация препарата, мкг/мл Инфекционный титр вируса***
уровень накопления вируса, lg подавление репродукции вируса, Alg* КИ**, %
0,1 25 4,5 ± 0,3 0,6 ± 0,2 11,8
0,01 25 3,5 ± 0,8 1,0 ± 0,3 22,2
За 24 ч до инфицирования 0,1 50 3,28 ± 0,7 1,2 ± 0,4 22,2
0,01 50 2,0 ± 0,5 2,5 ± 0,5 44,4
0,1 25 3,1 ± 0,5 2,0 ± 0,3 44,4
Через 24 ч после 0,01 25 2,0 ± 0,9 2,5 ± 0,7 55,6
инфицирования 0,1 50 1,8 ± 0,75 3,25 ± 0,8 64,0
0,01 50 0,9 ± 0,2 3,6 ± 1,2 80,7
Контроль вируса без 0,1 - 5,08 ± 0,75 - -
внесения препарата 0,01 - 4,5 ± 0,4 - -
HMPV при инфицирующей дозе 0,01 ТЦИД50.
Как следует из представленных результатов, Инга-вирин®, внесенный после заражения клеток вирусом HMPV, подавляет инфекционные свойства наиболее эффективно, причем степень подавления инфекционной активности вируса прямо пропорциональна концентрации препарата и зависит от инфицирующей дозы вируса. Так, при внесении препарата в концентрации от 50 до 500 мкг/мл через 24 ч после заражения клеток вирусом в дозе 0,01 ТЦИД50 происходило достоверное торможение продукции вируса, о чем свидетельствует снижение инфекционного титра вируса на 2,0 lg и более в зависимости от концентрации Ингавирина®.
Результаты, касающиеся подавления инфекционной активности вируса, коррелировали с показателями, полученными в ПЦР (рис. 2).
Было важно установить, насколько эффективно сохраняется воздействие препаратов на инфекционную активность HMPV при дальнейшем пассировании.
При последующем определении инфекционной активности вируса после первого воздействия препаратов способность к репродукции HMPV была подавлена под влиянием Ингавирина® на 1,9 ± 0,77 lg при использовании препарата за 24 ч до заражения в концентрации 500 мкг/мл. Результаты исследования показали, что и после воздействия Ингавирина® через 24 ч после инфицирования клеток вирусом препарат сохраняет свое влияние на HMPV. Инфекционный титр вируса после воздействия ингавирина в концентрации 500 мкг/мл снизился на 2,5 ± 0,75 lg, 300 мкг/мл - на 1,8 ± 0,5 lg, 100 мкг/мл - на 1,5 ± 0,47 lg и 50 мкг/мл - на 1,0 ± 0,2 lg. Под влиянием рибавирина инфекционный титр вируса снижен на 1,1 ± 0,7 lg в тех же условиях проведения эксперимента при максимальной концентрации 50 мкг/мл.
Таким образом, результаты изучения противовирусных препаратов в отношении HMPV свидетельствуют о том, что Ингавирин® более эффективно подавляет репродукцию вируса при внесении препарата после инфицирования монослоя клеток. При этом следует заметить, что сохраняется статистически достоверная зависимость от концентрации препарата и множественности заражения вирусом. Противовирусная эффективность Ингавирина® в отношении HMPV оказалась сравнимой по подавлению инфекционной активности вируса и характеру воздействия с Рибавирином.
Результаты, полученные при исследовании сохранения влияния препаратов на инфекционную активность HMPV, показали, что только Ингавирин® сохраняет противовирусную активность, причем при всех изученных концентрациях препарата при применении его через 24 ч после инфицирования клеток вирусом.
Таким образом, среди исследуемых препаратов на модели in vitro в отношении HMPV активность Ингавирина® сопоставима с эффективностью рибавирина, однако преимуществом Ингавирина® является то, что он менее токсичен и не оказывает негативное побочное действие. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности применения препарата Ингавирин® при HMPV-инфекции у детей и пожилых пациентов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Козулина И. С. Новые инфекционные агенты - метапневмовирус и бокавирус человека: Дис. ... канд. мед. наук. - М., 2010.
2. Колобухина Л. В., Малышев Н. А., Меркулова Л. Н. и др. Изучение эффективности и безопасности нового противовирусного препарата Ингавирин при лечении больных гриппом // Рус. мед. журн. - 2008. - Т. 16, № 23. - С. 1-15.
3. Колобухина Л. В., Меркулова Л. Н., Бурцева Е. И. и др. Эффективность Ингавирина в лечении гриппа у взрослых // Тер. арх. - 2009. - Т. 81, № 3. - С. 51-54.
4. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Максимов В. А. и др. Изучение лечебной эффективности нового отечественного препарата Ин-гаверин в отношении возбудителя гриппа А (H3N2) // Антибиотики и химиотер. - 2008. - Т. 53, № 7-8. - С. 27-30.
5. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Лыков М. В. и др. Изучение эффективности Ингаверина in vitro в отношении «мексиканского» пандемического подтипа H1N1 вируса гриппа А, штаммы A/Califomia/04/2005 и A/Califomia/07/2009 // Антибиотики и химиотер. - 2009. - Т. 54, № 3-4. - С. 15-17.
6. Мажуль Л. А., Шилдген О., Исаева Е. И., Вязов С. О. // Вопр. вирусол. - 2007. - № 3. - С. 4-8.
7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2005.
8. Шишкина Л. Н., Небольсин В. Е., Кабанов А. С. и др. Эффективность Ингаверина in vitro и in vivo в отношении штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1/09) // Журн. микроби-ол. - 2011. - № 2. - С. 93-96.
9. Cilia G., Onate E., Perez-Yarza E. G. et al. Viruses in community-acquired pneumonia in children aged less than 3 years old: High rate of viral coinfection // J. Med. Virol. - 2008. - Vol. 80, N 10. - P. 1843-1849.
10. Deffrasnes C., Cote S., Boivin G. Analysis of replication of the human metapneumovirus in different cell lines by real-time PCR // J. Clin. Microbiol. - 2005. - Vol. 43. - P.488-490.
11. Landry M. L., Cohen S., Ferguson D. Prospective study of human metapneumovirus detection in clinical samples by use of light diagnostics direct immunofluorescence reagent and real-time PCR // J. Clin. Microbiol. - 2008. - Vol. 46. - P. 1098-1100.
12. MillerS. A.. Tollefson S., Crowe J. E. et al. Examination of a fusogenic hexameric core from human metapneumovirus and identification of a potent synthetic peptide inhibitor from the heptad repeat 1 region. // J. Virol. - 2007. - Vol. 81. - P. 141-149.
13. ReedL., MuenchH. A simple method of estimating 50% endpoints // Am. J. Hyg. - 1938. - Vol. 27. - P. 493-497.
14. Schildgen O., Geikowski T., Glatzel T. et al. Frequency of human metapneumovirus in the upper respiratory tract of children with symptoms of an acute otitis media //Eur. J. Pediatr. - 2005. - Vol. 164, № 6. - P. 400-401.
37
15. Ulbrandt N. D., Ji H., Patel N. K. et al. Isolation and characterization of monoclonal antibodies which neutralize human metapneumovirus in vitro and in vivo // J. Virol. - 2006. - Vol. 80. - P. 7799-7806.
16. Van den Hoogen B. G., de Jong J. C., Groen J. et al. A newly discovered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease // Nat. Med. - 2001. - Vol. 7. - P. 719-724.
17. Viazov S., Ratjen F., Scheidhauer R. et al. High prevalence of human metapneumovirus infection in young children and genetic heterogeneity of the viral isolates // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol. 41, N 7. - P. 3043-3045.
18. Wilkesmann A., Schildgen O., Eis-Hubinger A. M. et al. Human metapneumovirus infections cause similar symptoms and clinical
severity as respiratory syncytial virus infections // Eur. J. Pediatr. -2006. - Vol. 165, N 7. - P. 467-475.
19. Wyde P. R., Chetty E. H., Jewell A. M. et al. Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by Ribavirin and immune serum globulin in vitro // Antiviral Res. - 2003. - Vol. 60. - P. 51-59.
20. Wyde P. R., Moylett E. H., Chetty E. H. et al. Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by NMSO3 in tissue culture assays // Antiviral Res. - 2004. -Vol. 63. - P. 51-59.
Поступила 30.09.11
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 615.371:578.832.1].015.46
А. Н. Найхин, Т. В. Чиркова, Г. Д. Петухова, Д. А. Кореньков, С. А. Донина, Л. Г. Руденко
Стимуляция гомо- и гетерологичной Т-клеточной иммунологической памяти у волонтеров, привитых живой реассортантной гриппозной вакциной типа A(H5N2)
НИИ экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, Санкт-Петербург
Работа посвящена изучению способности живой реассортантной гриппозной вакцины (ЖГВ) типа A(H5N2) стимулировать у людей Т-клеточный иммунный ответ, опосредованный вирусспецифическими CD4+- и С08+-клетками иммунологической памяти. Эти данные сопоставлены с количественными характеристиками гуморального иммунного ответа. Показано, что двукратная интраназальная иммунизация жгВ A(H5N2) «наивных» в отношении контактов с возбудителем птичьего гриппа людей индуцирует у них продукцию циркулирующих вирусспецифических CD8+^ CD4+-клеток памяти, специфических как к вакцинному штамму, так и к актуальному вирусу гриппа A(H1N1). Получены данные, свидетельствующие о том, что часть взрослых людей не являются абсолютно неиммунными в отношении птичьего вируса гриппа A(H5N2), поскольку в довакцинальном периоде у них обнаруживают перекрестно реагирующие Т-клетки иммунологической памяти, специфические к этому возбудителю. Количество (в %) этих клеток значительно варьирует внутри группы. Количественные показатели поствакцинального накопления CD4+- и CD8+-клеток памяти находились в обратной зависимости от их предвакцинального уровня.
Ключевые слова: живая гриппозная вакцина, птичий грипп, иммунологическая память
Stimulation of homo- and heterologic T-cell immunological memory in volunteers inoculated with live influenza A (H5N2) reassortant vaccine
A. N. Naikhin, T. V. Chirkova, G. D. Petukhova, D. A. Korenkov, S. A. Donina, L. G. Rudenko
Research Institute of Experimental Medicine, North-Western Branch, Russian Academy of Medical Sciences,
Saint Petersburg
The study deals with the ability of live attenuated reassortant influenza vaccine (LAiV) A (H5N2) to stimulate a CD4+ and CD8+ immunological memory T cell-mediated immune response in volunteers. These data were compared with the quantitative characteristics of a humoral immune response. A two-dose regimen of intranasal vaccination of avian influenza naive people with A (H5N2) LAiV induced the production of circulating CD4+ and CD8+ memory cells specific to both A (H5N2) and seasonal A (H1N1) influenza strains. Some of the volunteers were not absolutely A (H5N2) influenza virus naive since they had been found to have this virus-specific cross-reactive immunological memory T-cells in the prevaccination period. The content (%) of these cells varied significantly within the group. The quantitative values of postvaccination CD4+ and CD8+ memory cell accumulation were inversely related to their prevaccination level.
Key words: live influenza vaccine, avian influenza, immunological memory
Потенциальным источником появления пандемических вирусов гриппа А в человеческой популяции являются циркулирующие среди диких и домашних птиц вирусы этого подтипа. В 1997—2005 гг. во время многочисленных вспышек гриппа A(H5N1) среди птиц зарегистрировано несколько сотен людей, инфицированных этим возбудителем [20]. У большей части из них наблюдались тяжелые клинические проявления с частыми летальными исходами. Хотя прямых доказа-
тельств передачи птичьих вирусов гриппа от человека к человеку не получено, по рекомендации ВОЗ разработаны разные типы вакцин для защиты людей от этих вирусов [7]. Проведены клинические испытания нескольких вариантов инактивированных (ИГВ) [7] и живых (ЖГВ) [6, 14] гриппозных вакцин типа A(H5N1). Все они индуцировали у волонтеров накопление циркулирующих и/или локальных антител.
Разработана ЖГВ типа A(H5N2) на основе реас-
Контактная информация:
Петухова Галина Дмитриевна, канд. биол. наук, науч. сотр.; e-mail: [email protected]
38
