CC BY
97
16. Сейбиль В.Б., Малышкина Л.П., Тамазян Г.В., Коноплева Т.Н., Успенская Е.С. Коллективный иммунитет к полиомиелиту у детей в Московской области. Вопросы вирусологии. 2009; 6: 13-8.
17. Джабиров Ш.С. Проблема ликвидации инфекций в условиях социально-экономической и военно-политической нестабильности (на примере Республики Таджикистан): Дисс. ... докт. мед. наук. М.; 2005.
REFERENCES
1. Resolution of the 41st World Health Assembly WHA 41.28. Global Eradication of poliomyelitis by the year 2000. Geneva: WHO; 1988. Available at: http://www.who.int/ihr/polioresolution4128en.pdf
2. Ivanova O.E., Eremeeva T.P., Lipskaya G.Yu., Cherkasova E.A, Gavrilin E.V, Drozdov S.G. Outbreak of paralytic poliomyelitis in the Chechen Republic in 1995. In: Brown F., ed. Progress in polio eradication: vaccine strategies for the end game. Dev. Biol. Basel: Karger; 2001; 105: 231-7.
3. CDC. Certification of poliomyelitis eradication - European Region, June 2002. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2002; 51 (26): 572-4.
4. CDC. Poliomyelitis in Tajikistan: first importation since Europe certified polio-free. Wkly. Epidemiol. Rec. 2010; 85 (18): 157-8.
5. Yakovenko M.L., Gmyl A.P., Ivanova O.E., Eremeeva T.P., Ivanov A.P., Prostova M.A. et al. The 2010 outbreak of poliomyelitis in Tajikistan: epidemiology and lessons learnt. EURO Surveill. 2014; 19 (7). Available at: http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle. aspx?ArticleId=20706.
6. Khetsuriani N., Pallansch M.A., Jabirov S., Saparova N., Oberste M.S., Wannemuehler K. et al. Population immunity to polioviruses in the context of a large-scale wild poliovirus type 1 outbreak in Tajikistan, 2010. Vaccine. 2013; 31 (42): 4911-6.
7. Onishchenko G.G, Ezhlova E.B, Mel'nikova A.A, Lazikova G.F, Demina Yu.V, Frolova N.V. Poliomyelitis in Tajikistan. Protection of Russia from emergen ce and spread of wild poliomyelitis virus. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2011; 2: 12-22. (in Russian)
8. Shishov A.S., Sayfullin M.A., Shakaryan A.K., Ivanova O.E., Sach-kova I.Yu. A case of poliovirus infection caused by a wild strain in the adult patient. Zhurnal nevrologii i psikhiatrii im. S.S. Korsakova. 2011; 111 (10): 77-80. (in Russian)
9. Romanenkova N.I., Bichurina M.A., Rozaeva N.R., Pogrebnaya T.N. The role of epidemiologic surveillance of migrants in the system of
poliomyelitis control. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2012; 6: 27-31. (in Russian)
10. van der Maas N.A., Mollema L., Berbers G.A., Rooijen D.M., van der Avoort H.G., Conyn-Van Spaendonck M.A. et al. Immunity against poliomyelitis in the Netherlands, assessed in 2006 to 2007: the importance of completing a vaccination series. EURO Surveill. 2014; 19 (7). Available at: http://www.eurosurveillance.org/ViewAr-ticle.aspx?ArticleId=20705
11. WHO. Polio Eradication and Endgame Strategic Plan 2013-2018. Available at: http://www.polioeradication.org/Portals/0/Document/ Resources/StrategyWork/PEESP_EN_A4.pdf.
12. World Health Organization (WHO). Manual for the virological investigation of polio. WHO/EPI/GEN/97.1.1. Geneva: WHO; 1997. Available at: http://whqlibdoc.who.int/hq/1997/WHO_EPI_GEN_97.01.pdf
13. Dragunsky E., Ivanov A., Wells V., Ivshina A.V, Rezapkin G.V., Abe S. et al. Evaluation of immunogenicity and protective properties of inactivated poliovirus vaccine: a new surrogate method for predicting vaccine efficacy. J. Infect. Dis. 2004; 190 (8): 1404-12.
14. Ivanov A.P., Tkachenko E.A., Petrov V.I., Pashkov A.J., Dzagurova T.K., Vladimirova T.P. et al. Enzyme immunoassay for the detection of virus specific IgG and IgM antibody in patients with HFRS. Arch. Virol. 1988; 100 (1-2): 1-7.
15. Seybil' V.B., Malyshkina L.P., Khishtonova S.N., Lesnikova M.V., Baryshnikova A.S., Konopleva T.N. et al. State of collective immunity against poliomyelitis in some regions of Russia. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2013; 2: 56-64. (in Russian)
16. Seybil' V.B., Malyshkina L.P., Tamazyan G.V., Konopleva T.N., Us-penskaya E.S. Herd immunity against poliomyelitis in children in the Moscow Region. Voprosy Virusologii. 2009; 6: 13-8. (in Russian)
17. Dzhabirov Sh.S. The Problem of Elimination of Infections Under Conditions of Socio-economic and Military-political Instability (for example, the Republic of Tajikistan) : Diss. Moscow; 2005. (in Russian)
18. Fifteenth meeting of the European Regional Commission for the Certification of Poliomyelitis Eradication. Copenhagen, June 19-21, 2002. Copenhagen: WHO; 2005.
19. CDC. Outbreaks following wild poliovirus importations - Europe, Africa, and Asia, January 2009 - September 2010. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2010; 59 (43): 1393-9.
20. Onishchenko G., Ezhlova E., Gerasimova A., Tsvirkun O., Shulga S., Lipskaya G. et al. Progress toward measles elimination in the Russian Federation, 2003-2009. J. Infect. Dis. 2011; 204 (Suppl. 1): S366-72.
Поступила 30.05.14
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
УДк 615.32.03:616.98:578.825.11].036.8.079.6
АлимбароваЛ.М.1, Лазаренко А.А.1, Баринский И.Ф.1, Дижа В.И.2
Изучение противовирусной активности НРМ-7.0 - экстракта мицелия высшего гриба Fusarium sambucinum на модели экспериментальной герпесвирусной инфекции
'ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, г. Москва; 2 ЗАО «ДижаФарм», 129515, г. Москва
Изучена противовирусная активность HPM-7.0 - экстракта монокультуры высшего гриба Fusarium sambucinum на модели экспериментальной герпесвирусной инфекции (ГИ). Установлено, что при системном применении у животных HPM-7.0 оказывает выраженное терапевтическое воздействие на течение экспериментальной ГИ, способствуя быстрому регрессу элементов и экссудативно-воспалительных явлений, достоверному сокращению средней продолжительности заболевания, предотвращению генерализации процесса. Наиболее значимые результаты получены при использовании HPM-7.0 по профилактической и лечебно-профилактической схемам применения. По эффективности применения HpM-7.0 был сопоставим с таковой препарата контроля Ридостин. Полученные результаты позволяют считать HPM-7.0 перспективной основой для создания противовирусных препаратов и использования в терапии ГИ.
К л ю ч е в ы е с л о в а: Fusarium .sambucinum; вирус простого герпеса; герпесвирусная инфекция; лечение.
Для цитирования: Вопросы вирусологии. 2015; 60 (5): 21-26.
Для корреспонденции: Алимбарова Людмила Михайловна, канд. мед. наук, доцент, вед. науч. сотр.; e-mail: [email protected]
Alimbarova L.M.1, Lazarenko A.A.\Barinsky I.F.\ Dizha V.I.
A study of the antiviral activity of the HPM-7.0, extract of mycelium of the higher fungi Fusarium sambucinum, on the model experimental herpes viral infection
1Federal Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya,
Moscow, Russia; 2DizhaFarm, Ltd., Moscow, Russia
Antiviral activity in the HPM-7.0, extract of a monoculture of the fungus Fusarium sambucinum, was studied on the herpesvirus infection model. it was found that in case of systematic use in animals HPM-7.0 has a strong therapeutic effect on the course of experimental herpesvirus infection, contributing to the rapid regression of elements and exudative inflammation. it also reliably reduces the average duration of the disease and prevents generalization of the process. The most significant results were obtained using the HPM-7.0 in preventive and curative-preventive modes. The efficiency of the HPM-7.0 was comparable to that of the drug Ridostin. The results obtained in this work suggest the HPM-7.0 as a promising agent to be used in antiviral drugs intended for treatment of the herpesvirus infection.
Key words: Fusarium .sambucinum; herpes .simplex virus; herpesvirus infection; treatment.
Received 22.01.15
For correspondence: Ludmila Alimbarova, MD, PhD, associate professor, leading researcher associate; e-mail: [email protected]
Citation: Voprosy virusologii. 2015; 60(5): 21-26. (In Russ.)
Введение
Поиск и использование биологически активных соединений, обладающих лечебными свойствами, из природных источников, в том числе из высших грибов, является одним из актуальных направлений создания современных препаратов в медицине. Преимуществом данных препаратов является то, что входящие в их состав биологически активные вещества (БАВ) (полисахариды, органические кислоты, липиды, стероидные вещества, те-трациклические тритерпены, эргостеролы, нуклеозиды, антибиотики) более естественно включаются в обменные процессы человека, чем синтетические вещества, повышая эффективность терапии [1, 2]. Лекарственные средства, приготовленные из грибов, широко используются в традиционной медицине в лечении ряда соматических, онкологических и инфекционных заболеваний. Установлена противовирусная активность экстракта гриба Trametes versicolor в отношении ВИЧ и цитомегаловиру-са, экстракта гриба Lentinula edodes в отношении вируса везикулярного стоматита, аденовируса 12-го типа, вируса гриппа А, ВИЧ, экстракта гриба Inonotus obliquus в отношении вируса гепатита С и вируса гриппа А [1]. В последние годы внимание ученых привлекли внимание грибы Fusarium sambucinum, являющиеся источниками БАВ, а также белка пищевого и кормового назначения [3-6]. Сбалансированный состав грибов F. sambucinum стал основанием для изучения их терапевтических свойств. Цель настоящего исследования - изучить противовирусную активность HPM-7.0, разработанного на основе мицелия монокультуры гриба F. sambucinum, на модели экспериментальной герпесвирусной инфекции (ГИ).
Материалы и методы
Вирус. В работе использовали вирус простого герпеса (ВПГ) 2-го антигенного типа, штамм ВН, полученный из Государственной коллекции вирусов РФ ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» в виде вируссодержа-щей взвеси с инфекционным титром 5,5±0,2 lg ТЦИД50/мл. Вирус поддерживали в серийных пассажах и титровали на перевиваемой культуре клеток почек зеленых мартышек (VERO) в среде Игла, содержащей 2% сыворотки эмбрионов телят («Gibco», США), глутамин и антибиотики. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча [7].
Животные. Для моделирования экспериментальной формы ГИ использовали самцов морских свинок массой 250-300 г, полученных из питомника «Столбовая» РАМН и содержавшихся в стандартных условиях вивария на стандартном рационе в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных.
Препараты. HPM-7.0 - композиция, разработанная на основе мицелия моно-культуры гриба Fusarium sambucinum Fuckel var. оssicolum (Berk et Curt) bilai ВСБ-917 (ВКПМ F-165), полученного способом глубинного культивирования, позволяющим получить чистое сырье (субстанцию с заданными свойствами) в более короткие сроки. Штамм F. sambucinum ВСБ-917 (ВКПМ F-165) является продуцентом комплекса БАВ профилактического и лечебного назначения в биомассе и культу-ральной жидкости, не патогенен и не токсичен. HPM-7.0 представляет собой концентрат низкомолекулярного пептидного соединения и дефрагментированных ДНК диаметром от 1 до 50 нм и имеет следующий состав: общий белок - 55-57%, минеральные элементы - 24-26%, витамины (группы B, фолиевая и никотиновая кислоты) - 0,8-0,86%, липиды - 4,2-7,6%, полисахариды - 14,6% и т. д. [5]. В состав HPM-7.0 входят 22 аминокислоты, в том числе незаменимые (триптофан, лизин, метионин), ненасыщенные жирные кислоты, 50% которых приходится на долю линоленовой кислоты, коэнзимы Q6, Q9, Q10 углеводы (представленные гликанами, лентинаном, органическими кислотами (яблочной, лимонной, янтарной)). Токсикологические исследования HPM-7.0, проведенные в лаборатории лекарственной токсикологии Института экспериментальной кардиологии РКПНК МЗ РФ, показали, что состав HPM-7.0 является нетоксичным, не влияет на гематологические показатели и функциональное состояние основных органов и систем организма подопытных животных.
Для получения жидкой формы HPM-7.0 грибной мицелий трехкратно замораживали (-40oC) и оттаивали, гомогенизировали, обрабатывали ультразвуком и центрифугировали 15 мин при 8000-12 000 об/мин для освобождения от хитиновой оболочки мицелия. Полученный супернатант отсасывали, фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм ("Millipore"), проверяли на стерильность и использовали в экспериментах.
В качестве препарата сравнения применяли Ридостин (рибонуклеат натрия) - смесь натриевых солей двуспи-ральной и одноцепочечной РНК в виде лиофилизиро-ванного порошка для приготовления инъекционного раствора производства ЗАО "Вектор-Медика", Россия.
Оценку противовирусной эффективности HPM-7.0 осуществляли в соответствии с официальными требованиями к доклиническим испытаниям [8]. Активность HPM-7.0 в отношении ВПГ изучали на самцах морских свинок, которых заражали культуральной, вируссодер-жащей жидкостью (ВПГ-2, ВН) по стандартной методике [8, 9]. Вируссодержащую жидкость (в дозе 100 ТЦД50) наносили с помощью пипетки (с последующим
втиранием) на предварительно скарифицированную кожу пениса. Скарифицирование проводили с помощью хирургического ланцета после анестезирования животных лидокаином. Размер площади скарификации составлял 4-7 мм2. С учетом цели эксперимента все животные были разделены на 5 опытных и 3 контрольные группы по 5 особей в каждой. Группа 1 (контрольная) содержала инфицированных ВПГ-2 животных, получавших интра-перитонеально плацебо (физиологический фосфатный буфер). В группу 2 вошли животные, инфицированные ВПГ-2 и получавшие HPM-7.0 интраперитонеально по профилактической схеме за 3 сут до инфицирования, ежедневно в дозе 10 мг/мл на 1 животное 2 раза в сутки в 1-й день и 3 раза в сутки в последующие дни. Группа 3 содержала инфицированных животных, получавших HPM-7.0 интраперитонеально по лечебной схеме через 3 ч после инфицирования и далее ежедневно в течение 7 сут в дозе 50 мг/мл на 1 животное 3 раза в сутки. В группу 4 вошли инфицированные животные, получавшие HPM-7.0 интраперитонеально по лечебной схеме через 48 ч после инфицирования и далее ежедневно в течение 7 дней в дозе 50 мг/мл на 1 животное 3 раза в сутки. В группу 5 включили животных, инфицированных ВПГ-2 и получавших HPM-7.0 интраперитонеально по лечебно-профилактической схеме за 3 сут до инфицирования и через 3 ч после инфицирования ежедневно в течение 7 дней. Группа 6 содержала животных, инфицированных ВПГ-2 и получавших HPM-7.0 интраперитонеально по лечебно-профилактической схеме за 3 сут до инфицирования и через 48 ч после инфицирования ежедневно в течение 7 дней в дозах, указанных выше. Для изучения побочного действия HPM-7.0 5 свинок были выделены в отдельную группу (отрицательный контроль). Животных этой группы содержали в тех же условиях, что и подопытных животных и инфицированию не подвергали.
Референс-препарат Ридостин вводили в соответствии с инструкцией по его медицинскому применению с учетом равноэквивалетности доз для человека: по профилактической схеме (за 3 сут до инфицирования ежедневно однократно внутримышечно в дозе 200 мкг на 1 животное 1 раз в сутки (группа 7)); по лечебно-профилактической схеме (за 3 сут до инфицирования внутримышечно ежедневно однократно и через 24 и 72 ч после инфицирования в дозе 200 мкг на 1 животное (группа 8)).
Наблюдение за животными осуществляли в течение 21 дня. Тяжесть инфекционного процесса оценивали ежедневно перед проведением лечения и прослеживали в течение всего периода болезни по следующим параметрам: площадь и степень специфических поражений (везикулы, пустулы, изъязвления, корочки), наличию отека, гиперемии, орхита. Максимальная выраженность каждого признака составляла 4 балла. Основными критериями оценки эффективности препаратов in vivo были интенсивность клинических проявлений, средняя продолжительность заболевания (СПЗ), индекс лечебного действия (ИЛД), уровень накопления вируса в смывах в разные сроки после инфицирования (A, lg).
ИЛД (в %) = сумма баллов - сумма баллов в группе животных, в контроле леченных препаратом / сумма баллов в контроле ■ 100.
Вирусологические исследования. Выделение и титрование вируса из биоматериала животных (содержимого везикул, корочек, смывов со слизистой оболочки уроге-нитального тракта), взятого в разные сроки после инфицирования, проводили in vitro на культуре клеток VERO с использованием стандартных вирусологических методов исследования [8]. Клетки, выращенные на 96-луночных панелях на среде Игла, заражали серийными 10-кратными разведениями биоматериала от 10-1 до 10-6, приготовленными на стерильном физиологическом фосфатном буфе-
ре, и инкубировали в термостате в течение 96 ч. По окончании срока инкубации оценивали инфекционную активность биоматериала по стандартной методике (по Риду и Менчу) и выражали в lg ТЦД50/мл [7].
Статистическую обработку результатов проводили с использованием прикладных программ математико-статистического анализа Microsoft Office-Excel 7.0, Statistica 6.0. Полученные результаты после проверки соответствия данных нормальному распределению обрабатывали с использованием параметрических и непараметрических методов вариационной статистики с заданным уровнем значимости а = 0,05 и достоверностью р = 95% [10].
Результаты
Клинические признаки генитального герпеса (ГГ). ГИ, вызываемая ВПГ, является одной из распространенных инфекций человека, заболеваемость которой неуклонно растет во всех странах мира [11]. Одной из приоритетных моделей изучения ГИ является модель ГГ, воспроизводимая на морских свинках [8]. В ходе опыта по определению эффективности применения HPM-7.0 у морских свинок установлено, что клинические признаки были типичными для ГИ гениталий и развивались через 24-48 ч после инфицирования. Вначале на слизистой оболочке полового члена и прилежащих участках кожи появлялись единичные везикулезные высыпания на эритематозном фоне, затем при прогрессировании заболевания число везикул увеличивалось, возникали сливные очаги с геморрагическим содержимым, кровоточащие эрозии, изъязвления, умеренно выраженный орхит. В последующие дни эрозии и язвы эпителизировались либо под коркой, либо без ее образования. Максимальное развитие симптоматики отмечали на 5-е сутки после инфицирования. У 2 инфицированных животных, получавших плацебо (группа 1), с 6-го дня после инфицирования отмечали симптомы генерализации ГИ (повышение температуры тела, вялость, адинамичность, нарушение функции тазовых органов, паралич задних конечностей), подтвержденные вирусологическими методами. На 10-е сутки после инфицирования при нарастающих явлениях менингоэнце-фалита зафиксировали гибель 1 особи. У другой особи к 18-м суткам после инфицирования наблюдали снижение показателей клинических проявлений заболевания, выражающееся в заживлении эрозий, эпителизации слизистой оболочки, восстановлении функции тазовых органов, при частичном сохранении парезов. Суммарный индекс выраженности симптоматики (СИВС) в контрольной группе составил 66 баллов, СПЗ - 1б,4±2,1 сут.
Иная картина заболевания наблюдалась у инфицированных животных на фоне терапии с использованием HPM-7.0. Результаты изучения эффективности HPM-7.0 в отношении экспериментального ГГ с использованием HPM-7.0 представлены в таблице.
Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что использование HPM-7.0 по лечебной, профилактической, лечебно-профилактической схемам оказывало на течение ГГ у самцов морских свинок положительное воздействие разной степени выраженности. Наиболее значимые результаты лечения получены в группе инфицированных животных на фоне использования HPM-7.0 по профилактической схеме - за 3 сут до инфицирования (группа 2) (см. таблицу; рисунок).
Применение HPM-7.0 приводило к статистически достоверному терапевтическому эффекту (ИЛД составил 42,4%), снижению почти в 2 раза выраженности симптоматики, сокращению СПЗ в среднем на 7,1 сут по сравнению с аналогичными показателями у инфицированных животных, получавших плацебо, предотвращало развитие генерализованной инфекции. Инфекционный процесс отличало мягкое течение, отсутствие выраженных
экссудативно-воспалительных явлений, малочисленность высыпаний, сокращение сроков разрешения элементов, отсутствие орхита. Необходимо отметить, что по эффективности применения HPM-7.0 был сопоставим с референс-препаратом Ридостин (ИЛД равен 31,8%). Доказательством противовирусной активности HPM-7.0 являются результаты, полученные в опытах по титрованию образцов биоматериала на 24-часовом монослое линии клеток VERO. Так, титры вируса, изолированного у животных, леченных HPM-7.0, были в 50 раз ниже титров вируса, изолированного у животных контрольной группы, и составили на 5-е сутки после инфицирования 3,5±0,1 и 5,25±0,25 lg ТЦД„/мл, на 7-е
Эффективность HPM-7.0 на модели ГГ у морских свинок
№ группы Группа животных СПЗ, сут, М±т СИВС, баллы, М±т ИЛД, %
1 Контроль(плацебо) 16,4±2,1 66,0±4,5
2 HPM-7.0 -72, -48, -24 ч 9,25±0,6* 38,0±2,0* 42,4*
3 HPM-7.0 +3, +24, +48, +72, +96, +120, +144 ч 11,0±1,8* 44,0±2,0* 33,0*
4 HPM-7.0 +48, +72, +96, +120, +144, +168, +192 ч 12,0±1,4* 51,0±3,0* 22,7*
5 HPM-7.0 -72, -48, -24, +3, +24, +48, +72, +96, +120, +144 ч 10,5±1,5* 43,5±2,5* 34,0*
6 HPM-7.0 -72, -48, -24, +48, +72, +96, +120, +144, +168, +192 ч 11,4±1,2* 42,0±2,0* 36,0*
7 Ридостин -72, -48, -24 ч 10,75±1,7* 45,0±1,5* 31,8*
8 тт — . Ридостин -72, -48, -24, +24, +72 ч 12,66±1,4* 49,0±2,5* 25,7*
(плацебо) (р < 0,05).
статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой
сутки - 1,5±0,1 и 3, ,15 ^ ТЦД50/мл соответственно.
При использовании НРМ-7.0 по лечебной схеме наибольший терапевтический эффект (ИЛД 33,0%) был достигнут в группе инфицированных животных, обработанных препаратом в ранние сроки после инфицирования (группа 3). Следует отметить, что как и при назначении по профилактической схеме, НРМ-7.0 приводил к уменьшению выраженности экссудативно-воспалительных явлений и оказывал достоверное влияние на сроки и стадийность появления элементов. Применение НРМ-7.0 как в ранние сроки после инфицирования (группа 3), так и на фоне выраженных проявлений инфекционного процесса (группа 4) приводило к статистически достоверному сокращению СПЗ в среднем на 4,9 сут по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе. Признаки генерализованной инфекции были отмечены у 1 особи из групп 3 и 4 на 8-е сутки после заражения, однако гибель при нарастающих явлениях менингоэнцефалита была отмечена только в группе 4 на 12-е сутки после заражения (на 2 сут позже, чем в контроле).
У животных, получавших НРМ-7.0 по лечебно-профилактической схеме, в том числе через 3 ч после инфицирования (группа 5) или в более поздние сроки (48 ч после инфицирования в группе 6), были выявлены сходные показатели СИВС, СПЗ, ИЛД. Генерализованной инфекции, как и гибели животных, в данных группах отмечено не было, в то время как в контрольной группе и на фоне применения Ридостина наблюдалась генерализация процесса, приведшая к гибели 1 животного.
Изучение влияния НРМ-7.0 на уровень выделения ВПГ 2-го типа у самцов морских свинок. У инфицированных животных на фоне лечения НРМ-7.0 и препаратом Ридо-стин выделение вируса из очагов поражения отмечалось до 7-го дня после инфицирования, в то время как у животных, получавших плацебо, выделение вируса происходило до 9-го дня включительно. Титры вируса из смывов у животных, получавших плацебо, составили на 5-е сутки после инфицирования 5,25±0,25 ^ ТЦД50/мл, у животных, леченных НРМ-7.0, - 3,5±0,1 ^ ТЦД7мл, у животных, леченных ридостином, - 3,0±0,1 ^ тЦД50/мл (р < 0,05). Титры вируса под влиянием НРМ-7.0 были достоверно ниже в 50 раз по сравнению с титрами вируса у животных в контрольной группе. Достоверная разница в титрах вируса, выделенного у животных на фоне лечения НРМ-7.0 и препаратом Ридостин, отсутствовала (р > 0,05).
При изучении общей переносимости НРМ-7.0 у неин-фицированных животных, получавших препарат интра-
перитонеально, видимых побочных реакций (изменений в массе тела, состоянии их шерстного покрова и слизистых оболочек, поведенческих реакциях) в течение всего периода наблюдения зарегистрировано не было.
Обсуждение
Поиск и изучение новых методов лечения ГИ является актуальной задачей [11]. В настоящее время в качестве потенциальных препаратов с противовирусной активностью рассматриваются средства на основе экстрактов, полученных из различных грибов (высших и низших мицелиальных грибов), что связано с их уникальным составом и способностью синтезировать БАВ [1, 2, 12, 13]. Микромицеты используются в различных отраслях народного хозяйства - в медицине, сельском хозяйстве, биотехнологии (для получения белков, липи-дов, пищевых волокон, антибиотиков, ферментов, витаминов). Среди грибов наибольший интерес вызывают высшие мицелиальные грибы Е sambucinum, особенно их непатогенные штаммы, обладающие выраженными полифункциональными свойствами, в том числе антибактериальной, детоксикационной, антиоксидантной,
4 6 8 10 12 14 Сутки после инфицирования
Группа 1
Группа 2
Группа 7
Динамика течения ГГ у самцов морских свинок на фоне использования НРМ-7.0 - экстракта биомассы мицелия гриба Г sambucinum по профилактической схеме. Группа 1 - плацебо; группа 2 - введение НРМ-7.0 по профилактической схеме (-72, -48, -24 ч); группа 7 - введение референс-препарата Ридостин по профилактической схеме (-72, -48, -24 ч).
адаптогенной, иммуностимулирующей активностью, противовоспалительными и ранозаживляющими свойствами, способностью стимулировать выработку эндогенного гамма- и альфа-интерферона, корригировать местный иммунитет [6]. Указанные свойства обусловлены составом входящих в F. sambucinum БАВ: протеина, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, аминокислот, минеральных элементов, витаминов [18].
В последние годы грибы F. sambucinum благодаря своему составу и выраженным лечебно-профилактическим, биопротекторным и пребиотическим свойствам широко используются в качестве биологически активных препаратов - нутрицевтиков, пребиотиков - в медицине для лечения и профилактики различных заболеваний, в косметике для оздоровления и омоложения кожных покровов [3].
Известно несколько непатогенных штаммов гриба F. sambucinum - продуцентов БАВ, депонированных во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ): штаммы BKM N F 3051 D и MKF 2001-3 (ВКПМ № F-867) - продуценты простагландинов, ВКМ 139 - продуцент убихинона Q10; MKF 2001-3 (ВКПМ № F - 867), BKÜM F 3051 D - продуценты широкого спектра БАВ в биомассе и культуральной жидкости; ВСБ-917 (ВКПМ № F-169) - продуцент белка пищевого и кормового назначения и БАВ, на основе которого получен препарат «Милайф», влияющий на тканевый обмен [4]. Однако данный штамм характеризуется низким уровнем синтеза углеводов, в том числе высокомолекулярных полисахаридов - гликанов, проявляющих биологическую активность. Штамм Fusarium sambucinum var. ossicolum (Berk еt Curt) bilai PS-64 (ВКПМ № F-165) используется в качестве продуцента белка пищевого и кормового назначения и БАВ, характеризуется более высоким уровнем синтеза углеводов до 23%. На основе штамма создана биологически активная добавка (БАД) к пище "Микро-ВИТ". Недостатком штамма PS-64 (ВКПМ № F-165) является низкая скорость роста и ограниченный спектр продуцируемых физиологически активных веществ. Известны препараты Флоравит (водный и масляный растворы) [5], Таис славянская, разработанные на основе F. sambucinum Fuckel var. ossicolum штамм ВСБ-917, которые нашли широкое применение в гастроэнтерологии (для лечения вирусных гепатитов В и С, заболеваний ЖКТ), в гинекологии (для нормализации репродуктивной функции), косметологии (для лечения различных заболеваний кожи и слизистых оболочек), реабилитации больных после инфекционных (в том числе ГИ) и неинфекционных заболеваний (расширяют диапазон адаптации организма к неблагоприятным условиям, стрессовым ситуациям) ветеринарии, сельском хозяйстве (при разработке фунгицидов) [5, 14-17].
Нами проведено исследование препарата HPM-7.0, полученного из мицелия гриба Fusarium sambucinum Fuckel var. оssicolum (Berk et Curt) bilai ВСБ-917 (ВКПМ № F-165). Препарат характеризуется высоким содержанием аминокислот, в том числе незаменимых (триптофан, лизин, метионин), ненасыщенных аминокислот (50% линоленовой кислоты), витаминов группы В (фолиевая и никотиновая кислоты), микро- и макроэлементов (представленных цинком, медью, кобальтом, молибденом, марганцем, фосфором, кальцием, калием, железом), убихинонов, гликанов, органических кислот (яблочная, лимонная, янтарная), низкомолекулярных олигопептидных соединений, щелочных пептидов, необходимых для жизнедеятельности организма [6]. В составе углеводов мицелия представлены активные полисахариды - гликаны (глюканы и галактоманнаны), регулирующие работу иммунной системы [18]. Следует отметить, что штамм ВСБ-917 является не только продуцентом БАВ, но и лишен недостатков, характерных для некоторых мицелиальных грибов (в том числе способ-
ности в определенных условиях культивирования продуцировать микотоксины), что позволяет рассматривать его в качестве основы для получения препаратов с противовирусной активностью.
Ранее была установлена специфическая активность HPM-7.0 в отношении вируса кори (штамм Эдмонстон) in vitro: препарат оказывает прямое вирулицидное действие, при этом наблюдается нарушение синтеза вирусспецифи-ческих структур, в частности нуклеокапсидов, и процесса формирования вирионов, что в свою очередь приводит к продукции дефектной низкоинфекционной вирусной популяции, обеспечивающей развитие иммунитета [19]. Также была установлена активность в отношении вируса гриппа A/Aichi 1/68 (H3N2) (препарат приводит к полному исчезновению пепломеров из оболочки вируса и частичному нарушению структуры рибонуклеопротеидно-го комплекса) и вируса гепатита С in vitro [20]. В результате проведенного нами исследования была установлена противовирусная активность HPM-7.0 в отношении ВПГ 2-го типа. Показано, что HPM-7.0 в широком диапазоне доз и схем применения обладает протективной активностью на модели ГГ, снижая выраженность клинических проявлений заболевания, а также СПЗ по сравнению с таковой в группе плацебо. При этом терапевтический эффект сопровождается достоверным снижением инфекционной активности ВПГ, выделенного у животных, получавших HPM-7.0, по сравнению с таковой у животных, получавших плацебо. Это проявлялось тем, что инфекционный процесс отличало мягкое течение, отсутствие выраженных экссудативно-воспалительных явлений, малочисленность высыпаний, сокращение сроков разрешения элементов, отсутствие орхита. Наиболее значимые результаты получены при использовании HPM-7.0 по профилактической и лечебно-профилактической схемам. Выявленный эффект НРМ-7, возможно, обусловлен синергическим взаимодействием входящих в его состав БАВ (пептидных биорегуляторов, полисахаридов, витаминов, антиоксидантов, ферментов, микроэлементов), полученных в результате глубинного культивирования гриба F. sambucinum, а также их способностью повышать бактерицидную и лизоцимную активность крови, активировать эритропоэз, повышая неспецифическую резистентность организма, что было показано в работах [21, 22], активировать пролиферацию лимфоцитов периферической крови, продукцию интерлейкинов (ИЛ-2), а также оказывать дифференцирующее действие на Т-клетки, приводящее к увеличению общего числа CD3+-клеток, CD4+ и CD8+-лимфоцитов, не вызывающему нарушение баланса CD4+/CD8+ [19, 23].
Представленные в данном исследовании результаты свидетельствуют о возможности применения препаратов на основе F. sambucinum в качестве лекарственных средств в комплексной терапии ГИ (для профилактики и лечения рецидивов инфекции).
Выводы
1. НПМ-7.0 - экстракт монокультуры высшего гриба F. sambucinum при системном использовании на модели экспериментальной ГИ у самцов морских свинок в широком диапазоне доз и схем применения оказывает выраженное терапевтическое воздействие на течение заболевания, способствуя быстрому регрессу элементов и экссудативно-воспалительных явлений, достоверному сокращению СПЗ, снижению инфекционной активности вируса у животных.
2. Наиболее значимые результаты получены при использовании HPM-7.0 по профилактической и лечебно-профилактической схемам.
3. Системное применение HPM-7.0 не сопровождается развитием побочных реакций у морских свинок.
ЛИТЕРАТУРА (п.п. 1, 7, 11, 17 см. REFERENCES)
2. Филиппова И.А., Фунтик Т.В. Фунготерапия - естественная медицина будущего. Успехи медицинской микологии. 2005; 5: 279-81.
3. Неминущая Л.А., Воробьева Г.И., Токарик Э.Ф., Еремец В.И., Самуйленко А.Я. Возможность получения пребиотиков из биомассы дрожжей-сахаромицетов и гриба Fusarium sambucinum шт. MKF-2001-3. В кн.: Материалы международной научно-практической конференции посвященной 35-летию ВНИТИБП «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». Щелково; 2005: 511-6.
4. Морозова Г.Р., Морозов А.Л. Препарат, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма гриба Fusarium .sambucinum Fuckel var. Ossicolum (Berk. et. Curf) Bilai для его получения. Патент РФ № 93057876; 1993.
5. Григораш А.И., Зайкина М.Ю., Погорельская Л.В., Бредихина Н.А., Трифонов А.В. БАД «Флоравит-Э» на основе экстрактов гриба Fusarium sambucinum - эффективный иммуномодулятор и адаптоген. Успехи медицинской микологии. 2006; 7: 346.
6. Дижа Е.Н., Дижа В.И. Средство, обладающее системным действием, его применение, фармкомпозиции, способы лечения и профилактики. Патент РФ № 2366697; 2007.
8. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д., Васильев А.Н., Верстакова О.Л., Журавлева М.В., Лепахин В.К. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. М.: Гриф и К; 2012.
9. Маренникова С.С., Мацевич Г.Р., Чекунова Э.В. и др. Разработка и практическое использование новых экспериментальных моделей разных форм герпетической инфекции. Вопросы вирусологии. 1986; 1: 59-65.
10. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика; 1999.
12. Огарков Б.Н., Огаркова Г.Р., Самусенок Л.В. Пути создания некоторых лекарственных препаратов из микро- и макромицетов. Успехи медицинской микологии. 2005; 5: 206-10.
13. Григораш А.И., Соловьев Б.В., Погорельская Л.В., Кудрявцев А.Е., Михайлова Н.А. Антигены и биорегуляторы - перспективные инструменты борьбы с инфекционными болезнями. Материалы IV Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням. Инфекционные болезни. 2012; 10, прил. 1: 107.
14. Турьянов М.Х, Погорельская Л.В., Бредихина Н.А. и др. Биологически активная добавка «Флоравит Э» в гастроэнтерологии. Методические рекомендации для врачей. М.: Российская медицинская академия последипломного образования; 2005.
15. Брагинцева Л.М., Григораш А.И., Коваленко В.А., Макланов
A.И., Устынюк Т.К. Биологически активная добавка к пище и способ ее получения. Патент РФ № 2177699 Cl; 2002.
16. Лоенко Н.Н., Чернова И.Е., Пучков А.В. Применение экстракта биомассы гриба Fusarium sambucinum в рационах соболей. Кролиководство и звероводство. 2010; 6: 6-8.
18. Кашкина М.А., Елинов Н.П. Иммуномодулирующая активность полисахаридов из грибов. Микология и фитопатология. 1985; 19 (4): 345-56.
19. Тихонова Н.Т., Лоте В.Д., Мамаева Т.А., Наумова М.А., Дижа
B.И. О вирулицидной активности иммунокорригирующего препарата природного происхождения Милайф. Клиническая фармакология и терапия. 1999; 8 (4): 41-5.
20. Дижа В.И. Милайф ^ILIFE) - препарат с выраженным антивирусным и иммуностимулирующим эффектами. Медицинская картотека. 2006; 1: 42-4.
21. Супрун С.М., Донченко Г.В., Пархоменко Ю.М., Харкевич Е.С. и др. Витаминно-протеиновый продукт на основе селекционированных штаммов грибов: характеристика и применение. Факто-ри експериментальног еволюцп органiзмiв. 2013; 13: 258-61.
22. Богданов В.В., Фаткулина Э.Ф., Березин Б.Б., Ильина А.П., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Пептидосодержащая фракция из культуральной среды Fusarium sambucinum: состав и биологическое действие. Прикладная биохимия и микробиология. 2014; 2: 177-83.
23. Свирщевская Е.В., Вискова Н.Ю., Сапожников A.M., Дижа В.И., Кучерова И.В. Изучение иммуномоделирующих свойств экстракта мицелия высшего гриба Fusarium sambucinum. Иммунология. 1995;11-12: 45-51.
REFERENCES
1. Wasser S.P., Weis A.L. Therapeutic effects of substances occurring in Higher Basi-diomycetes mushrooms: a modern perspective. Crit. Rev. Immunol. 1999; 1: 65-96.
2. Filippova I.A., Funtik T.V. Fungoterapiya - natural medicine of the future. Uspekhi meditsinskoy mikologii. 2005; 5: 279-81. (in Russian)
3. Neminushchaya L.A., Vorob'eva G.I., Tokarik E.F., Eremets V.I., Sam-uylenko A.Ya. The possibility of prebiotics from biomass yeast Sac-charomyces and fungus Fusarium sambucinum piece MKF-2001-3. In: Proceedings of the International Scientific-practical Conference Dedicated to the 35th Anniversary of VNITIBP "Scientific Basis for the Production of Veterinary Biologicals Preparations. " [Materialy mezhdunarodnoy nauchno-prakticheskoy konferentsii posvyashchen-noy 35-letiyu VNITIBP "Nauchnye osnovy proizvodstva veterinarnykh biologicheskikhpreparatov"]. Shchelkovo; 2005: 511-6. (in Russian)
4. Morozova G.R., Morozov A.L. Agents Acting on the Tissue Metabolism and the Use of a Strain of the Fungus Fusarium Sambucinum Fuckel var. Ossicolum (Berk. Et. Curf) Bilai to Obtain it. Patent RF N 93057876; 1993. (in Russian)
5. Grigorash A.I., Zaykina M.Y., Pogorelskaya L.V., Bredikhina N.A., Trifonov A.V. BAA "Floravit-E" on the basis of extracts of the fungus Fusarium sambucinum - effective immunomodulator and adap-togen. Uspekhi meditsinskoy mikologii. 2006; 7: 346. (in Russian)
6. Dizha E.N., Dizha V.I. Agent having systemic action, its application, farmkompozitsii, methods of treatment and prevention. Patent RF N 2366697; 2007. (in Russian)
7. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 1938; 27: 493-7.
8. Mironov A.N., Bunatyan N.D., Vasil'ev A.N., Verstakova O.L., Zhurav-leva M.V., Lepakhin V.K. et al. Guidelines for Preclinical Studies of Drugs [Rukovodstvo po provedeniyu doklinicheskikh issledovaniy leka-rstvennykh sredstv]. Moscow: Grif i K; 2012. (in Russian)
9. Marennikova S.S., Matsevich G.R., Chekunova E.V. et al. Development and practical use of new experimental models of different forms of herpes infection. Voprosy virusologii. 1986; 1: 59-65. (in Russian)
10. Glants S. Biomedical Statistics. [Mediko-biologicheskaya statistika]. Moscow: Praktika; 1999. (in Russian)
11. Bradley H., Markowitz L.E., Gibson T., McQuillan G.M. Seropreva-lence of herpes simplex types 1 and 2—United States, 1999-2010. J. Infect. Dis. 2014; 209 (3): 325-33.
12. Ogarkov B.N, Ogarkova G.R, Samusenok L.V. Towards the creation of some drugs of micro- and macromycetes. Uspekhi meditsinskoy mikologii. 2005; 5: 206-10. (in Russian)
13. Grigorash A.I., Solov'ev B.V., Pogorel'skaya L.V., Kudryavtsev A.E., Mikhaylova N.A. Antigens and Regulators - promising tools to fight infectious diseases. Materials IV Annual All-Russian Congress on Infectious Diseases. Infektsionnye bolezni. 2012; 10 Sappl. 1:107. (in Russian)
14. Tur'yanov M.Kh, Pogorel'skaya L.V., Bredikhina N.A. et al. Dietary Supplement "Floravit E" in Gastroenterology. Guidelines for Physicians [Biologicheski aktivnaya dobavka "Floravit E" v gastroenter-ologii. Metodicheskie rekomendatsii dlya vrachey]. Moscow: Rossi-yskaya meditsinskaya akademiya poslediplomnogo obrazovaniya; 2005. (in Russian)
15. Bragintseva L.M., Grigorash A.I., Kovalenko V.A., Maklanov A.I., Ustynyuk T.K. Biologically Active Food Supplement and its Method of Preparation. Patent RF N2177699 C1; 2002. (in Russian)
16. Loenko N.N., Chernova I.E., Puchkov A.V. The use of biomass extract of the fungus Fusarium sambucinum in rations sables. Kroliko-vodstvo i zverovodstvo. 2010; 6: 6-8. (in Russian)
17. Dzhavakhiya V., Shcherbakova L., Semina Y., Zhemchuzhina N., Campbell B. Chemosensitization of plant pathogenic fungi to agricultural fungicides. Front. Microbiol. 2012; 9: 3:87.
18. Kashkina M.A., Elinov N.P. Immunomodulatory activity of polysaccharides from mushrooms. Mikologiya i fitopatologiya. 1985; 19 (4): 345-56. (in Russian)
19. Tikhonov N.T., Lotte C.D., Mamaeva T.A., Naumov, M.A., Dizha V.I. About virucidal activity of immune correcting drug of natural origin Milife. Klinicheskaya farmakologiya i terapiya. 1999; 8 (4): 41-5. (in Russian)
20. Dizha V.I. Milife (MILIFE) - a drug with significant antiviral and immunostimulatory effects. Meditsinskaya kartoteka. 2006; 1: 42-4. (in Russian)
21. Suprun S.M., Donchenko G.V., Parkhomenko Yu.M., Kharkevich E.S. et al. Vitamin and protein-based product selection strains of fungi: characterization and application. Faktori eksperimental'noi evolyutsiiorganizmiv. 2013; 13: 258-61. (in Russian)
22. Bogdanov V.V., Fatkulina E.F., Berezin B.B., Il'ina A.P., Yamskova V.P., Yamskov I.A. Fraction of peptide from the culture medium Fusarium sambucinum: structure and biological activity. Priklad-naya biokhimiya i mikrobiologiya. 2014; 2: 177-83. (in Russian)
23. Svirshchevskaya E.V., Viskova N.Yu., Sapozhnikov A.M., Dizha V.I., Kucherova I.V. Study of immunomodeliruyushih properties of the extract of the mycelium of higher fungus Fusarium sambucinum. Immunologiya. 1995; 11-12: 45-51. (in Russian)
nocTynuna 22.01.15
