CC BY
82
© Васильева И. Г., Главацкий А. Я., Макаренко А. Н., Шуба И. Н.
УДК 616. 831-006. 484-018:615. 38:615. 015
Васильева И. Г., Главацкий А. Я., Макаренко А. Н., Шуба И. Н. ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ ЭКСТРАКТОВ ВЫСШИХ
ГРИБОВ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ГЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ
ГУ «Институт нейрохирургии им. А. П. Ромоданова НАМН Украины»
(г. Киев)
Данное исследование является фрагментом научно-исследовательской работы «Визначити змши рiвня експреси репаративного ензиму алктгуанш-трансферази при глюмах головного мозку рiзного ступеня злоякiсностi з метою оптимiзацiI комбшова-ного лiкування», № гос. регистрации 0113U007712, которая проводится в ГУ «Институт нейрохирургии им. А. П. Ромоданова НАМН Украины».
Вступление. Терапия глиальных опухолей головного мозга остается неразрешимой проблемой. Хирургическое вмешательство в комплексе с химиотерапией и лучевым воздействием в большинстве случаев увеличивают продолжительность жизни только у части пациентов. Недостаточная эффективность обусловлена ограничениями этих подходов: невозможностью радикального хирургического удаления опухоли и низкой чувствительностью или нечувствительностью многих глиом головного мозга к химио- и лучевой терапии.
Высокая частота заболеваемости первичными низкозлокачественными и злокачественными опухолями головного мозга (10. 9-12.8 на 100 тыс. населения), высокий процент глиом от всех первичных мозговых опухолей (50 - 55 %), низкая результативность терапии глиом III и IV степени злокачественности, способность низкозлокачественных глиом к инфильтративному росту и малигнизации определяют социальную значимость дальнейшего поиска эффективных подходов терапии. Актуальным остается поиск способов терапии при первичных и вторичных глиобластомах мультиформных - наиболее злокачественном типе глиом и опухолях III степени злокачественности (анапластическая астроцитома, анапластическая олигодендроглиома). Для этих типов злокачественных глиом, составляющих 60 %, всех глиом головного мозга характерны быстрый инфильтративный рост, рецидивы после хирургии и устойчивость к химио- и лучевой терапии. Продолжительность жизни больных после операции составляет в среднем 5 - 6 месяцев [2]. Не менее важен поиск эффективных методов терапии и при доброкачественных глиомах (фибриллярная, про-топлазматическая, гемистоцитарная), составляющих 40 % всех глиом головного мозга, для которых характерны пролиферация и озлокачествление.
Лекарственные грибы представляют собой важный сегмент фармацевтической индустрии, благодаря большому количеству полезных биологически и фармакологически активных веществ [14]. Одним из важных направлений применения высших грибов является их противоопухолевое действие. Исследования продемонстрировали, что противоопухолевой активностью обладают представители нескольких родов грибов, такие как Pleurotus, Agaricus, Ganoderma, Clitocybe, Cordyceps, Xerocomus, Fomes и другие [7,12,16]. Главными противоопухолевыми компонентами экстракта высших грибов являются липидные компоненты, тритерпеноиды и стеролы. Противоопухолевый эффект реализуется за счет разнообразных механизмов, таких как индукция апоптоза, а также ингибирование пролиферации в результате воздействия на сигнальные пути опухолевой клетки. Показано, что лекарственные препараты экстрактов высших грибов подавляют развитие новообразований различной локализации, в том числе и опухолей головного мозга [8,11].
Наиболее изученными высшими грибами, которые содержат биологические вещества, стимулирующие иммунную систему и подавляющие развитие новообразований, является Ganoderma lucidum (рейши), Lentinus edodes (шейтаке), Grifola frondosa (мейтаке), Hericium erinaceus и Agaricus blazei (хи-мемацутаке) [9]. Некоторые из них уже используются для создания таких препаратов, как Lentinan, LEM (Meloxicam), Chrestin, Ganopoly, Immuno-Assist и др. [4].
Большинство исследований связывают противоопухолевую активность экстрактов из высших грибов с тритерпеноидами и стероидами. Химическая структура тритерпенов базируется на ланостероле. Тритерпены характеризуются структурным разнообразием в результате стереохимических перестроек этого соединения. До настоящего времени описаны физико-химические свойства более чем 130 тритерпеноидов ланостеролового типа [8]. Тритерпены являются специфичными для G. luci-dum, но обнаружены и у других видов: G. colossum, G. applanatum.
Тритерпены считаются потенциально противораковыми агентами, так как обладают неопосредованной цитотоксичностью против опухолевых
клеток. Тритерпиноиды - ганодериновые кислоты T-Z, выделенные из G. lucidum, продемонстрировали цитотоксическую активность in vitro на клетки гепатомы [15].
Также тритерпеноиды из базидиокарпов G. lucidum и G. applanatum ингибируют прогрессирование роста опухоли [5]. Хотя, некоторые эфиры показали токсичность при высоких концентрациях [13]. В то же время комплексный препарат из G. lucidum компании «McASTER» оказался нетоксичным.
Тритерпенойды с G. lucidum влияют на активность ферментов. Исследования показали, что ингибиторы белка фарнезил-трансферазы (FTP) ингибируют Ras-зависимую опухолевую клетку и, таким образом, представляют потенциальную терапевтическую стратегию для лечения рака [10].
Довольно часто G. lucidum применяется совместно с C. sinensis. По данным собственных исследований компании «McASTER» комплексное средство существенно влияет на относительную массу и размер клеток селезенки, причем влияние на последний показатель достоверно интенсивнее, чем L. macrorhizus. Об этом свидетельствует снижение количества В-лимфоцитов, угнетение развития первичного иммунного ответа, а также, усиление клеточного иммунитета на фоне снижения гуморального. Это является положительным свойством данного препарата, поскольку клеточное звено иммунной системы играет важную роль в осуществлении противоопухолевой защиты.
целью данной работы было исследовать влияние препаратов «Кордицепс и Линчжи» в жидкой форме компании McAster (Сертификаты UA. 1.003x001047-10; UA. 1.003.x001046-10) и «Хеюань» компании Merro International, которые содержат экстракты грибов Cordyceps sinensis и Ganoderma lucidum на клеточную культуру глиальных опухолей.
Объект и методы исследования. Для анализа чувствительности глиом к препаратам нами был использован метод краткосрочного культивирования (72 часа) с последующей окраской 0,4 % три-пановым синим для оценки как общего количества клеток в пробе, так и определения процентного содержания жизнеспособных клеток в контрольных и опытных пробах. Материалом исследований были фрагменты опухолей больных, прооперированных по поводу глиом головного мозга в клинике ГУ "Институт нейрохирургии им. А. П. Ромоданова НАМН Украины" (анапластическая астроцитома - 6 наблюдений, глиобластомы - 3 наблюдения, гистологический диагноз установлен, согласно WHO-классификации опухолей центральной нервной системы).
Выделение клеток проводили согласно принятой методики [1,3]. Фрагменты полученных тканей обрабатывали, удаляя из него сосуды и некроти-зированные участки. В стерильных условиях проводили гомогенизацию фрагментированной ткани, отстаивали 10 - 15 мин, после чего отбирали на-досадочную фракцию, центрифугировали при 1000 об/мин 5 мин, осадок переносили в питательную
среду. Концентрацию полученных клеток доводили до 50х106 кл-к/мл. Полученную суспензию клеток (аликвоту, равную 5х106 кл-к/мл) культивировали в среде Игла (модификации Дюльбекко с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", США)) в чашках Петри в СО2-инкубаторе (ES-160 "Nbve", Турция) в стандартных условиях (температура + 37 0С, 5 % СО2).
Концентрацию препаратов рассчитывали с учетом рекомендуемых производителем и добавляли в питательную среду (опыт). Чувствительность клеток к действию препаратов оценивали, сравнивая количество живых клеток в опыте, относительно контроля и выражали в процентах.
результаты исследований и их обсуждение. После 3-х суток культивирования в стандартных условиях проводили подсчет клеток в контрольных и опытных пробах. Результаты исследований представлены в таблице.
Для каждого образца значения в пробах с препаратами выражали в процентах относительно контроля (контроль для каждого образца принят 100 %).
В группе клеточных культур, полученных из фрагментов опухолей с гистологическим диагнозом анапластическая астроцитома в присутствии препарата «Кордицепс и Линчжи» было зафиксировано снижение процента живых клеток относительно контроля. Уровень снижения колебался в образцах культивированных клеток от 13,3 % до 68,9 %. В присутствии препарата «Хеюань» также было зафиксировано
таблица
влияние препаратов «кордицепс и линчжи» и «хеюань» на жизнеспособность клеток в краткосрочной первичной культуре глиом головного мозга
Группы № образца «Кордицепс и Линчжи» ( % от контроля, контроль 100 %) «Хеюань» ( % от контроля, контроль 100 %)
Анапластическая астроцитома 1 24,8 31,0
2 36,3 24,1
3 68,9 41,2
4 35,3 31,1
5 14,5 6,6
6 13,3 6,7
M ± m 32,2 ± 8,4* 23,5 ± 5,8 *
глиобл-астома 1 10,2 16,1
2 11,6 12,1
3 56,0 ■ 39,4 ■
примечание: статистический анализ полученных данных проводили с использованием пакетов прикладных математических программ STATISTICA6. 0** - (p < 0,001, критерий U Mann-Whitney); * - (p < 0,002, критерий U Mann-Whitney); ' - увеличение % живых клеток, относительно контроля.
снижение процента живых клеток от 6,6 % до 41,2 %, относительно значений в контроле.
Из трех первичных краткосрочных клеточных культур, полученных из фрагментов опухолей с гистологическим диагнозом глиобластома, в 2-х образцах в присутствии препаратов «Кордицепс и Линчжи» и «Хеюань» наблюдалось незначительное снижение процента живых клеток в культуре. После культивирования одного из образцов глиобластомы (№ 3) с препаратом «Кордицепс и Линчжи» и препаратом «Хеюань» было зафиксировано увеличение процента живых клеток, относительно контроля.
В результате наших исследований было показано статистически значимое уменьшение процента живых клеток, полученных из фрагментов опухолей анапластических астроцитом после культивирования с препаратом «Кордицепс и Линчжи» (p < 0,001 критерий U Mann-Whitney) и (p < 0,002 критерий U
Mann-Whitney) с препаратом «Хеюань», относительно контроля.
Выводы. Таким образом, полученные данные указывают на цитотоксическое действие препаратов в жидкой форме «Кордицепс и Линчжи» компании McAster (Сертификаты UA. 1.003. x001047-10; UA.1.003.x001046-10) и «Хеюань» компании Merro International, которые содержат экстракты грибов Cordyceps sinensis и Ganoderma lucidum на клетки глиальных опухолей в процессе краткосрочного культивирования в стандартных условиях. Такое действие препаратов позволяет рассматривать их в качестве кандидатов для адъювантной терапии при глиомах головного мозга.
Перспективы дальнейших исследований. Существенные колебания уровня снижения, а также возможное стимулирование пролиферации указывают на необходимость дальнейшего исследования с использованием большего числа образцов.
Литература
1. Божкова В. П. Руководство по культивированию нервной ткани / В. П. Божкова, Л. А. Брежестовский, В. М. Буравлев, И. В. Викторов. - М.: Наука, 1988. - 315 с.
2. Глиомы головного мозга / [Ю. А. Зозуля, И. Г. Васильева, А. Я. Главацкий и др.]: Под. ред. Ю. А. Зозули. - К.: УИПК «ЕксОб», 2007. - 630 с.
3. Фрешни Р. Культура животных клеток. Методы / Р. Фрешни. - М.: Мир, 1989. - 302 с.
4. Bekchanova E. S. Comparative estimation of cytotoxic actions of mycelium water extracts of Hypsisygus ulmaris basidiomy-cete obtained by laboratory and industrial methods / E. S. Bekchanova, I. A. Rodina, T. V. Shevchenko [et al.] // 13 th International Congress «Phytopharm 2009». Bonn, Germany. - 29-31 July 2009. - P. 8-13.
5. Chairul T. T. Applanoxidic acids А, В, С and D, biologically active tetracyclic triterpenes from Ganoderma applanatum / T. T. Chairul, Y Hayasbi, M. Nishizawa // Phytochemistry. - 1991. - Vol. 30. - P. 4105-4109.
6. Chan J. Y Enhancement of in vitro and in vivo anticancer activities of polysaccharide peptide from Grifola frondosa by chemical modifications / J. Y Chan, E. Chan, S. W. Chan [et al.] // Pharm. Biol. - 2011. - Vol. 49 (11). - P. 1114-1120.
7. Jang K. - J. Induction of apoptosis by ethanol extracts of Ganoderma lucidum in human gastric carcinoma cells / K. - J. Jang, M. H. Han, B. H. Lee [et al.] // J. Acupunct. Meridian Stud. - 2010. - Vol. 3. - P. 24-31.
8. Kim Н. W. Biomedicinal triterpenoids of Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P. Karst (aphyllophoromycetidae) / H. W. Kim, В. К. Kim // International J. of Medicinal Mushrooms. - 1999. - Vol. l. - P. 121-138.
9. Lakhanpal T. N. Medicinal and nutraceutical genetic resources of mushrooms / T. N. Lakhanpal, Monika Rana // Plant. Genet. Resour.: Charact. and Util. - 2005. - № 2. - P. 288-303.
10. Lee S. Natural inhibitors for protein prenyl transferase / S. Lee, S. Park, J. W. Oh, С. Н. Yang // Planta medica. - 1998. -Vol. 54. - P. 303-308.
11. Lemieszek M. K. Anticancer effects of fraction isolated from fruiting bodies of Chaga medicinal mushroom, Inonotus obliquus (Pers.:Fr.) Pilat (Aphyllophoromycetideae): in vitro studies / M. K. Lemieszek, E. Langner, J. Kaczor [et al.] // Int. J. Med. Mushrooms. - 2011. - Vol. 13 (2). - P. 131-143.
12. Li Y -G. Antitumor effects of proteoglycan from Phellinus linteus by immunomodulating and inhibiting Reg IV/EGFR/Akt signaling pathway in colorectal carcinoma / Y -G. Li, D. -F. Ji, S. Zhong [et al.] // Int. J. Biol. Macromol. - 2011. - Vol. 48. -P. 511-517.
13. Lin С N. Novel cytotoxic principles of Formosan Ganoderma lucidum / С N. Lin, W. P. Tome, S. J. Won // Journal of Natural Products. - 1991. - Vol. 54. - P. 998-1002.
14. Patel S. Recent developments in mushrooms as anti-cancer therapeutics: a review / S. Patel, A. Goyal // 3 Biotech. - 2012. - Vol. 2. - P. 1-15.
15. Toth J. O. Ganoderic acid T and Z: cytotoxic triterpenes from Ganoderma lucidum (Polyporaceae) / J. O. Toth, B. Luu,
G. Ourisson // Tetrahedron Letters. - 1983. - Vol. 24. - P. 1081-1084.
16. Zhao J. K. Purification and characterization of a novel lectin from the toxic wild mushroom Inocybe umbrinella / J. K. Zhao,
H. X. Wan, T. B. Ng // Toxicon. - 2009. - Vol. 53. - P. 360-366.
УДК 616. 831-006. 484-018:615. 38:615. 015
ВИВЧЕННЯ ПРОТИПУХЛИННО1 ДМ ЕКСТРАКТ1В ВИЩИХ ГРИБ1В У КУЛЬТУР1 КЛ1ТИН ГЛ1АЛЬНИХ ПУХЛИН
Васильева I. Г., Главацький О. Я., Макаренко О. М., Шуба I. М.
Резюме. Новi методи терапи глюм головного мозку традицмно привертають до себе увагу нейрохiрургiв i онколопв, осктьки результати навггь активно! комбшованм терапи залишаються в бтьшост випадюв неза-довтьними. 1снують до^дження, в яких показано, що лкарсью гриби пригычують розвиток новоутворень
рiзноI локалiзацiI, у тому числi i пухлин головного мозку. Метою нашо! роботи було дослщити вплив пре-пара^в екстрактiв вищих грибiв компанií McAster «Кордицепс i Лiнчжi» в рiдкiй формi та «Хеюань» компанií Merro International на життeздатнiсть клiтин в короткостроковм культурi глiальних пухлин. В результат наших дослiджень було показано, що обидва препарати викликали статистично значиме зменшення (p < 0,01, кри-терiй U Mann-Whitney) вщсотка живих клiтин в культурах фрагмен^в пухлин, отриманих пiд час хiрургiчного втручання у 6 пацieнтiв з дiагнозом анапластична астроцитома. В дослщах з глiобластомами у двох зразках ефекта препарата не зафiксовано, а в одному випадку спостерталося збтьшення кiлькостi пухлинних клiтин в культург
Kлючовi слова: глiоми, культура клггин глiальних пухлин, хiмiотерапiя, хiмiорезистентнiсть, екстракти лiкарських грибiв.
УДК 616. 831-006. 484-018:615. 38:615. 015
ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ ЭКСТРАКТОВ ВЫСШИХ ГРИБОВ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ГЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ
Васильева И. Г., Главацкий А. Я., Макаренко А. Н., Шуба И. Н.
Резюме. Новые методы терапии глиом головного мозга традиционно привлекает к себе внимание нейрохирургов и онкологов, поскольку результаты даже активной комбинированной терапии остаются в большинстве случаев неудовлетворительными. Существуют исследования, в которых показано, что лекарственные грибы подавляют развитие новообразований различной локализации, в том числе и опухолей головного мозга. Целью нашей работы было исследовать влияние препаратов экстрактов высших грибов компании «McAster» «Кордицепс и Линчжи» в жидкой форме и «Хеюань» компании Merro International на жизнеспособность клеток в краткосрочной культуре глиальных опухолей. В результате исследований было показано, что оба препарата вызывали статистически значимое уменьшение (p < 0,001, критерий U MannWhitney) процента живых клеток в культурах, полученных из фрагментов опухолей во время хирургического вмешательства у 6 пациентов с диагнозом анапластическая астроцитома. В опыте с глиобластомами в двух случаях эффекта препаратов не зафиксировано, а в одном случае наблюдалось увеличение количества опухолевых клеток в культуре.
Ключевые слова: глиомы, культура клеток глиальных опухолей, химиотерапия, химиорезистентность, экстракты лекарственных грибов.
UDC 616. 831-006. 484-018:615. 38:615. 015
The Study of Antitumor Effect of Higher Fungus Extracts in Cell Culture of Glial Tumors
Vasileva I., Glavatskyi A., Makarenko A., Shuba I.
Abstract. The high incidence of primary benign and malignant brain tumors (10.9-12.8 per 100 000), a low resultant therapy of gliomas grades III and IV malignancy, an ability of low-grade gliomas to the infiltrative growth and malignancy define a social importance of further search for the effective therapy approaches. Medicinal fungi are an important segment of the pharmaceutical industry, due to the large number of useful biologically and pharmacologically active substances. One of the important areas for the use of extracts of the higher fungus is their antitumor activity.
The antitumor activity of the representatives of several kinds of fungi, such as Pleurotus, Agaricus, Ganoderma, Clitocybe, Cordyceps, Xerocomus, Fomes and others was demonstrated by the studies.
The aim of our work was to study the influence of liquid drugs "Cordyceps and Lingzhi" (McAster company; Certificates UA.1.003.x001047-10; UA.1.003.x001046-10) and "Heyuan" (Merro International Company), which contain the extracts of Cordyceps sinensis and Ganoderma lucidum fungi, on the cell culture of glial tumors.
A method of the short-term culture (72 hours), followed by painting with 0.4 % trypan blue to assess both the total number of cells in the sample and determine the percentage of viable cells in control and test samples was used by us for analyzing the sensitivity of gliomas to these drugs. The tumor fragments of patients operated for brain gliomas (anaplastic astrocytomas - 6 cases, glioblastomas - 3 cases, histological diagnosis was established based on the central nervous system tumor classification of the WHO) in the clinic of State Institution "A. P. Romo-danov Institute of Neurosurgery of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine" were the material for the studies.
Results and discussion. The cells were counted in the control and test samples after 3 days of the culture under standard conditions. A decrease in percentage of the living cells compared to the control was fixed in a group of the cell cultures derived from tumor fragments with histological diagnosis anaplastic astrocytoma in the presence of the drug "Cordyceps and Lingzhi". A level of the decrease in the samples of the cultured cells ranged from 13.3 % to 68.9 %. The decrease in the living cells percentage from 6.6 % to 31.3 % regarding the control was also recorded in the presence of the drug "Heyuan".
There was the decrease in the percentage of living cells by 10.2 % and 11.6 % in two samples of three cell cultures derived from fragments of tumors with histological diagnosis of glioblastoma in the presence of the drug "Cordyceps and Lingzhi", as well as the decrease in the percentage of the living cells by 16.1 % and 12.1 % under the influence of drug "Heyuan". After culturing a sample of glioblastoma with the drugs "Cordyceps and Lingzhi" and "Heyuan", the increase in the percentage of living cells by 56.0 % and 39.4 %, regarding control was recorded, respectively.
A statistically significant decrease in the percentage of living cells obtained from the fragments of anaplastic astrocytomas after culture with the drugs "Cordyceps and Lingzhi" (p < 0,01; the Mann-Whitney U-test) and "Heyuan" (p < 0,02; the Mann-Whitney U-test) was demonstrated as a result of our studies. A tendency to decrease in the percentage of the living cells was noted in two samples in the test with glioblastomas, and the increase in the number of tumor cells in the culture was observed in one case.
Conclusions. Data obtained explain the cytotoxic effects of drugs, in the liquid form, "Cordyceps and Lingzhi" (company McAster; Certificates UA. 1.003. x001047-10; UA.1.003.x001046-10) and "Heyuan" (company Merro International), which contain the extracts of fungi Cordyceps sinensis and Ganoderma lucidum, on the cells of glial tumors in the process of short term culture under standard conditions. Such action of these drugs allows us to consider them as the candidates for adjuvant therapy in brain gliomas. The significant fluctuations in the level of decrease, as well as the possibility of stimulating the proliferation indicate a need for further studies using a larger number of the samples.
Keywords: gliomas, cell culture of glial tumors, chemotherapy, chemoresistance, extracts of medicinal fungi.
Рецензент - проф. Баштан В. П.
Стаття надшшла 19. 12. 2014 р.
