CC BY
31
ЁР
ГЛАВНАЯ ТЕМА / Переработка свинины: практика и перспективы
Изучение природы действующего вещества
препарата «Колимак»
И. М. Чернуха, доктор техн. наук, Л. А. Люблинская, канд. хим. наук, Л. В. Федулова, канд. техн. наук,
ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии,
А. Н. Макаренко, доктор мед. наук,
Киевский национальный университет им. Т. Шевченко, Киев,
Е. А. Тимохина, канд. хим. наук,
ГНУ ВНИИ генетики и селекции пром. микроорганизмов
В настоящее время проблема лечения и профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта свиней актуальна ввиду увеличения числа патологий, большой потери веса и продуктивности свиней, что ведет к уменьшению рентабельности отрасли в целом. Отмечено, что около 90% новорожденных животных переболевают желудочно-кишечными болезнями, при этом основным диагнозом являются диспепсия и гастроэнтерит [1].
^ Глобальность затронутой проблемы подчеркивается статистическими данными: так заболеваемость молодняка в России составляет около 60% от всего поголовья, смертность — до 30%; в Германии и Франции - 75% случаев от всех заболеваний новорожденных, падеж достигает 75%; в США диагностируют примерно 65-85% поголовья; в Югославии заболеваемость поросят-сосунов в первые дни жизни доходит до 50%.
Для лечения таких заболеваний применяют различные ветеринарные препараты, в основном антимикробной направленности, но при длительном и нерациональном их использовании ослабляется иммунитет к грибковой и стафилококковой инфекциям, что приводит к тяжелым осложнениям и возникновению дисбактериоза, в организме нарушаются процессы пищеварения и обмена веществ, снижается прирост живой массы и, как следствие, ухудшается качество мяса [2, 3].
В связи с этим большое количество исследований проводится в области профилактики и лечения данных заболеваний тканевыми препаратами [2, 4]. Такие препараты обладают высокой эффективностью, позволяют осуществить индивидуальный подход, к препа-
ратам этой группы отсутствуют привыкание и эффект отмены. Технология переработки сырья предусматривает не только сохранение активности действующих начал, как при сборе и первичной обработке, но и извлечение их из сырья методами, позволяющими получить препарат в более или менее очищенном от примесей виде. Это позволяет исключить потенциальное токсическое и сенсибилизирующее действие [5].
По технологии получения органопрепараты можно классифицировать на следующие виды: высушенные и измельченные органы
УДК 636.4:619
Ключевые слова: «Колимак», поросята, болезни желудочно-кишечного тракта, аминокислота, электрофорез.
животных; клеточные и экстракционные препараты; индивидуальные лекарственные вещества, получаемые глубокой очисткой препараты для парентерального введения. Значительную долю органопрепаратов составляют экстракционные препараты, полученные путем экстракции — настойки, экстракты животного сырья, препараты гормонов, ферментов и пр.
В нашей стране данный метод был широко распространён в 6080 годы, однако в настоящее время метод экстракции практически не применяется, что, видимо, связано с высокой стоимостью этой техно-
Рисунок 1. Содержание свободных аминокислот в образцах
14
ВСЁ О МЯСЕ № 4 август 2013
Переработка свинины: практика и перспективы / ГЛАВНАЯ ТЕМА
ЕР
Рисунок 2. Содержание аминокислот в образцах №№ 1-3 и препарате «Колимак» после кислотного гидролиза
логии. Производство препаратов животного происхождения из органов, полученных от убойных животных, на наш взгляд, — весьма перспективное и актуальное направление, как в научной, так и в практической, деятельности. Это связано с тем, что большинство препаратов, используемых при лечении различных патологий пищеварения, производятся из внутренних органов желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных. Эти продукты убоя являются малоценным сырьем и в процессе переработки мало используются.
В ГНУ ВНИИМП имени
■Да Ст- 1 ; 2
Ш &F
72 р-
н i
♦ #
1?
13
ЙН§
Ст. - стандарт молекулярных масс
1. Экстракт желудка
2. Экстракт двенадцатиперстной кишки
3. Экстракт поджелудочной железы
4. Комплексный препарат «Колимак»
Рисунок 3. SDS-электрофорез в 12,5 % полиакриламидном геле
В.М. Горбатова Россельхозакаде-мии ведется разработка и изучение тканевого препарата «Колимак», представляющего собой специально приготовленные экстракты органов желудочно-кишечного тракта свиней: желудка, двенадцатиперстной кишки и поджелудочной железы. Полученные ранее результаты исследований на лабораторных животных показали, что препарат «Колимак» обладает выраженными протекторными и лечебными свойствами при развитии желудочно-кишечных расстройств, в частности антибиотик-ассоциированной диареи и гастроэнтерита [5].
Данная статья посвящена исследованию природы тканевого препарата «Колимак» различными физико-химическими методами.
Ранее было показано, что при использовании водных экстраген-тов в составе экстрактов обнаруживаются в основном вещества белково-пептидной природы. В связи с этим можно предположить, что при использовании в качестве экстрагента физиологического раствора из гомогената тканей желудочно-кишечного тракта будут экстрагированы компоненты указанной природы. Для подтверждения этого предположения был исследован аминокислотный состав экстрактов. Проведено определение уровня свободных и связанных аминокислот, а также исследование белкового состава электрофоретическим методом.
Материалы и методы
Объектами исследования являлись:
— экстракты пилорического и фундального отделов желудка (образец №1);
— экстракт двенадцатиперстной кишки (образец №2);
— экстракт поджелудочной железы (образец №3);
— комплексный препарат «Колимак» (образец №4).
Определение аминокислотного состава образцов выполнено на аминокислотном анализаторе Biotronik-IC-2000 (Германия) в режиме трехбуферного элюирова-ния. Для предварительного удаления высокомолекулярной белковой фракции образцы растворяли в 0,2 М растворе натрий-цитрат-ного буфера рН 2,2 и центрифугировали при 20000 об/мин при 5 °С в течение 40 минут. Для осаждения высокомолекулярных белков, крупных и средних пептидов к надосадочной жидкости (образцов 1-4) прибавляли 70% раствор три-хлоруксусной кислоты в воде, выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут и центрифугировали при 20000 об/мин при 5 °С в течение 40 минут, надо-садочную жидкость хранили при температуре не выше 8 °С.
Перед проведением анализа на содержание свободных аминокислот отделение средних и более мелких пептидов надосадочную-жидкость пропускали через кювету с пористой мембраной YM-2 («Amicon») с пределом отсечения 2 кДа под давлением 5 атм. Полный аминокислотный состав препарата «Колимак» и индивидуальных экстрактов определяли после кислотного гидролиза, который проводили в вакуумированных запаянных ампулах в растворе 6 М хлористоводородной кислоты в течение 24 часов при (105 ± 1) °C. Аликвоту 200 мкл каждого образца наносили на колонку аминокислотного анализатора. Разделение аминокислот на аналитической колонке проходило автоматически в трехбуферной системе натрий-цитратных буферов: буфер A -0,18 М, pH 3,25; буфер B - 0,3 М, pH 3,9 и буфер C - 1,6 М, pH 4,75. Ионообменная смола - DC-6A (США). Высота смолы в ко-
№ 4 август 2013 ВСЁ О МЯСЕ
15
ГЛАВНАЯ ТЕМА / Переработка свинины: практика и перспективы
лонке 22 см. Скорость потока буферного раствора 32 мл/ч. Для регистрации аминокислот использовали постколоночную модификацию с применением нингидри-нового реагента. Скорость подачи нингидринового реагента -20 мл/ч.
Анализ компонентного состава экстрактов выполняли методом электрофореза в полиакриламид-ном геле разной плотности (12,5% и 15%) в присутствии 0,1% лаурил-сульфата натрия на предварительно подготовленных образцах с концентрацией 0,1 мг/мл в буфере для разведения. В качестве свидетелей использовали маркер, состоящий из девяти стандартов с молекулярной массой 130, 95, 72, 55, 43, 34, 26, 17 и 10 кДа (фирмы Fermentas, Литва).
Результаты исследования
При исследовании спектра свободных аминокислот (рис. 1) в комплексном препарате «Коли-мак» (образец №4) выявлено высокое содержание глутаминовой кислоты, глицина и аспарагиновой кислоты (Glu - 26,2; Gly - 17,9; Asp - 6,7 мольных процента, соответственно), можно предположить, что это во многом обуслов-ленно их высоким содержанием в экстракте желудка (образец № 1) - Glu - 18,6; Gly - 18,4; Asp - 6,7 мольных процента, соответственно. Стоит отметить примерно равное содержание аланина и лизина как в отдельных экстрактах, так и в препарате «Колимак» (Ala - 9,8-10,2; Lys - 6,4-8,5, соответственно).
Отличительной особенностью аминокислотного состава кислотных гидролизатов препарата «Колимак» и образцов №№ 1-3 является высокое содержание кислых аминокислот, аспарагино-вой и глутаминовой (рис. 2).
Содержание Asp в образцах №№ 1-4 составляет: 9,5, 8,6, 10,1 и 9,3 мольных процента, соответственно. Следует отметить, что эти цифры фактически отражают суммарное содержание свободной Asp и Asp, входящей в структуру белков, экстрагированных из органов свиней. Кроме того, сюда же включается суммарное содержание свободного и свя-
2 = Mtt
А
1- стандарт молекулярной массы для пептидов (16,95- 8,160 кДа);
2- стандарт молекулярной массы (130 -10кДа);
3- экстракт пилорического и фундального отделов желудка;
4- экстракт двенадцатиперстной кишки;
5- экстрак поджелудочной железы;
6- комплексный препарат «Колимак»
Рисунок 4. SDS-электрофорез в 15 % полиакриламидном геле
Б
1- стандарт молекулярной массы (13010 кДа);
2- стандарт молекулярной массы для пептидов (16,95- 8,160 кДа);
3- комплексный препарат «Колимак»
занного аспарагина (Asn) превращающегося в Asp в ходе кислотного гидролиза.
Содержание глутаминовой кислоты (Glu) в образцах №№ 14 составляет 12,3, 12,0, 9,6 и 13,8 мольных процента, соответственно. Как и в случае Asp, эти данные отражают суммарное содержание свободной Glu и Glu, входящей в структуру белков. Одновременно они включают суммарное содержание глутамина (Gln) свободного и входящего в структуру экстрагированных белков и превращающегося в Glu в процессе кислотного гидролиза.
Таким образом, содержание в кислотных гидролизатах кислых аминокислот, аспарагиновой и глутаминовой, отражает суммарное содержание четырех аминокислотных остатков: аспарагиновой кислоты, аспарагина, глутаминовой кислоты и глутамина в исследуемых образцах, как в свободном, так и в связанном состоянии.
Среди нейтральных гидрофильных аминокислот, глицина, аланина, треонина, серина и про-лина, в кислотных гидролизатах образцов с 1 по 4 несколько выше содержание глицина и аланина, причем их содержание очень незначительно различается как
между отдельными образцами, так и между собой.
При проведении электрофоре-тических исследований в 12,5% геле (рис. 3), показано, что в комплексном препарате «Колимак» (образец №4), превалируют соединения с молекулярными массами 60 кДа и 40 - 41 кДа, а также и низкомолекулярные соединения примерно в области 15 кДа и 13 кДа.
В образцах №1 и 2 на элек-трофореграмме также обнаружены высокомолекулярные соединения с молекулярными массами примерно 60 и 43 кДа (образец №1); 60 кДа и 46 - 47 кДа (образец №2), помимо этого в образце №1 выявлены низкомолекулярные соединения с молекулярными массами около 15 и 13 кДа. Стоит отметить, что в этих образцах четко определяются зоны минорных полос в области от 34 до 28 кДа для образца №1, в области от 34 до 28 кДа и 15 кДа для образца №2 (рис. 3).
В образце № 3 - экстракте поджелудочной железы, обнаружены не менее 4 окрашенных зон. Трек содержит интенсивную размытую полосу низкомолекулярных соединений в области молекулярных масс около 10 кДа, возможно и более низкомолекулярные соединения.
16
ВСЁ 0 МЯСЕ № 4 август 2013
Переработка свинины: практика и перспективы / ГЛАВНАЯ ТЕМА
Для более детального анализа этой фракции нами был проведен электрофорез в концентрированном 15% ПААГ, позволяющем разделять вещества с невысокой молекулярной массой.
Так, в комплексном препарате «Колимак» (трек № 6 (Рис. 1 А, Б)) четко прослеживаются не менее десяти окрашенных зон по всей длине дорожки от 70 до 10 кДа. При электрофоретиче-ском исследовании экстракта пи-лорического и фундального отделов желудка (трек №3), в области от 70 до 60 кДа обнаруживаются две хорошо различимые белковые зоны; четкая белковая зона в области 43 кДа, минорные зоны обнаруживаются в области от 34 до 28 кДа, также выявлено не менее двух белковых зон в области от 17 до 15 кДа (Рис. 4, А). В треке № 4 - экстракт двенадцатиперстной кишки, в области от 70 до 60 кДа обнаруживаются две хорошо различимые белковые зоны; хорошо видимая белковая зона в области 28 кДа. В области 15 кДа обнаруживается не очень четкая полоса и несколько минорных полос в области более низких молекулярных масс (Рис. 4, А). В треке № 5 - экстракт поджелудочной железы, обнаруживаются две белковые зоны в районе от 50 до 45 кДа; хорошо видимая белковая зона в области 35 кДа. В районе от 17 до 8 кДа обнаруживаются несколько белковых зон.
Электрофоретическое разделение исследованных образцов в по-лиакриламидном геле различной концентрации, 12,5% и 15%, показало, что все они являются многокомпонентными смесями, содержащими белки в широком диапазоне молекулярных масс. При этом экстракты органов, входящих в желудочно-кишечный тракт, достаточно индивидуальны. Экстракт
фундального и пилорического отделов желудка содержит белки в диапазоне от 60 до 13 кДа. В экстракте двенадцатиперстной кишки обнаружены две белковых зоны в области 60 кДа и 46 - 47 кДа. В экстракте поджелудочной железы преобладают более низкомолекулярные белки. В комплексном препарате «Колимак» обнаружены белки в области молекулярных масс от 60 до 10 кДа.
Обсуждение результатов
При анализе результатов исследования спектра общих и свободных аминокислот образцов выявлено, что в комплексном препарате «Колимак» в большей или меньшей степени обнаружены все аминокислоты, содержащиеся в экстрактах, входящих в его состав. Стоит отметить, что наиболее близким к препарату по содержанию аминокислот является экстракт пилорического и фундаль-ного отделов желудка. Можно сделать предварительное предположение о том, что высокое содержание в комплексном препарате глутаминовой кислоты, глицина, аспарагиновой кислоты, лизина и аланина способствует стимуляции белкового и водно-солевого обмена, восстановлению поврежденных тканей и синтезу ферментов желудочно-кишечного тракта. Однако, на данном этапе сложно сделать однозначные выводы о функциональном значении свободных аминокислот и о закономерностях их содержания в рассмотренных образцах. Можно предположить, что свободные аминокислоты являются достаточно вариабельным компонентом исследуемых препаратов, и их количественное содержание будет изменяться в зависимости от структуры питания и возраста животных, от которых отбирались
образцы органов и тканей. Трудно предположить, что они вносят существенный вклад в физиологическое действие изучаемого препарата, помимо источника аминокислот, необходимых в структуре питания поросят.
Данные, полученные методом электрофореза, подтверждают высокую гетерогенность практически всех экстрактов, присутствие веществ в широком диапазоне молекулярных масс. В комплексном препарате отмечены высокомолекулярные белковые зоны, выявленные в экстрактах желудка и двенадцатиперстной кишки (от 70 до 60 кДа) и низкомолекулярные белковые зоны, характерные для двенадцатиперстной кишки и поджелудочной железы (от 17 до 10 кДа).
Для комплексного описания функционального назначения выделенных белковых фракций необходимо проведение более детальных исследований протеомного профиля образцов, в том числе методы 2D-фореза, хроматографии с последующей идентификацией.
В результате проведенного исследования можно сделать вывод о том, что препарат «Колимак» за счет уникальной технологии приготовления сохраняет активные вещества белковой природы, содержащиеся в экстрактах внутренних органов желудочно-кишечного тракта, входящих в его состав.
Контакты:
Ирина Михайловна Чернуха
+7 (495) 676-7211
Людмила Ароновна Люблинская
+7 (495) 676-6451
Лилия Вячеславовна Федулова
+7 (495) 676-9211
Александр Николаевич Макаренко 8-103 (809) 620-9611 Елена Александровна Тимохина +7 (495) 315-0347
Литература
1. Прудников С.И. Факторные инфекционные болезни свиней и их профилактика // Роль диагностики в контроле эпизоотических процессов на свиноводческих предприятиях в современных условиях:Научно-практическая конференция, май 2012 г. Новосибирск.
2. Артемьев В.И. Антимикробные и терапевтические свойства олететрина и его сочетаний с ферродексом при диспепсии поросят-сосунов: Автореферат диссертации на соискание уч. степени канд. вет. наук. Л., 1968. 23 с.
3. Rutter J. Vaccinating against coli scours in piglets // Pig Farm., 1993. 21. 10. P. 57-59.
4. Панин А.Н., Серых Н.И., Малик Е.В. Повышение эффективности пробиотикотерапии у поросят // Ветеринария. 1996. №3. С. 17-22.
5. Бобылев Р.В., Грядунова Г.П., Иванова Л.А.и др., Технология лекарственных форм / Под ред. Ивановой Л.А.Том 2 // М.: Медицина, 1991. 544 с: ил.
6. Чернуха И.М., Уша Б.В., Макаренко А.Н., Федулова Л.В., Елизарова Т.С., Арашанова Э.Б. Разработка ферментно-тканевого препарата для лечения желудочно-кишечных расстройств на основе экстрактов тканей желудка, двенадцатиперстной кишки и поджелудочной железы свиней // Журнал ветеринария и кормление. 2012. №4. С.12-14.
№ 4 август 2013 ВСЁ 0 МЯСЕ
17
