Изучение принадлежности фабомотизола к субстратам гликопротеина-P Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

© Черных И.В., Щулькин А.В., Якушева Е.Н., Гацанога М.В, Попова Н.М., 2017 DOI:10.23888/PAVLOVJ20174538-550

ИЗУЧЕНИЕ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ФАБОМОТИЗОЛА К СУБСТРАТАМ ГЛИКОПРОТЕИНА-Р

И.В. Черных, А.В. Щулькин, Е.Н. Якушева, М.В. Гацанога, Н.М. Попова

Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, ул. Высоковольтная, 9, 390026, г. Рязань, Российская Федерация

Гликопротеин-Р (Pgp) - это мембранный эффлюксный белок-транспортер, к субстратам которого относится большое число лекарственных веществ. Ряд препаратов изменяет активность транспортера, что при полипрагмазии может служить причиной межлекарственных взаимодействий. Фабомотизол (афобазол) - это отечественный анксиолитик с нейропротекторной активностью, применяемый по широкому спектру показаний и, исходя из химической структуры, являющийся потенциальным субстратом Pgp. Цель. Изучить принадлежность фабомотизола к числу субстратов Pgp. Материалы и методы. Работа выполнена на 12 кроликах-самцах породы Шиншилла. Принадлежность фабомотизола к субстратам Pgp оценивали путем сравнения фарма-кокинетических параметров тестируемого вещества на фоне курсового введения известных индуктора и ингибитора белка-транспортера - рифампицина и верапамила соответственно. Животным однократно внутрижелудочно вводили фабомотизол в дозе 3,8 мг/кг и забирали кровь из ушной вены через 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90, 120 и 240 мин с последующим анализом его фармакокинетики методом ВЭЖХ. Параметры фарма-кокинетики фабомотизола рассчитывали модельно-независимым методом вручную. Затем животные были разделены на 2 группы по 6 кроликов в каждой: 1-я группа получала верапамил в дозе 20 мг/кг 3 раза в день, вторая - рифампицин в дозе 20 мг/кг массы 14-дневным курсом. После введения модуляторов Pgp у животных повторно анализировалась фармакокинетика фабомотизола после его однократного применения. Результаты. Было выявлено, что только коэффициент абсорбции фабомотизола на фоне рифампицина достоверно снижался в 1,27 раза по сравнению с параметром интактных животных (90%-й ДИ 0,66-0,94; p=0,04322). Однако это изменение не имело клинической значимости, т.к. 90%-й доверительный интервал значительно перекрывал диапазон 0,80-1,25. Остальные фармакокинетические параметры фабомоти-зола достоверно в обеих сериях не изменялись, таким образом фабомотизол не является субстратом Pgp. Выявленное незначительное участие Pgp в фармакокинетике фа-бомотизола свидетельствует о том, что препарат можно назначать совместно с лекарственными веществами-модуляторами активности транспортера без корректировки его дозы. Выводы. В эксперименте in vivo на кроликах породы Шиншилла установлено, что фабомотизол не является субстратом белка-транспортера гликопротеина-P.

Ключевые слова: гликопротеин-P, фабомотизол, фармакокинетика, рифампицин, верапамил, субстрат.

Гликопротеин-Р (Р§р) - мембранный различных по химической структуре эндо-белок-транспортер, который использует и ксенобиотиков, среди которых большое энергию АТФ для эффлюкса из клеток число современных лекарственных

средств. Активность транспортера изменяется под действием внешних и внутренних факторов, в том числе на фоне приема некоторых лекарственных веществ. Таким образом, транспортеру отводится значительная роль в развитии межлекарственных взаимодействий [1].

Фабомотизол (афобазол) - это оригинальный отечественный селективный анкиолитик с нейропротекторной активностью, широким спектром показаний к применению и безрецептурным отпуском из аптек [2]. По химической структуре фабомотизол является производным бензи-

Ароматическая структура

Атомы аюта

мидазола, содержащим в молекуле третичные атомы азота и водородные связи. Комплекс исследований показал, что субстраты Р§р - преимущественно липофиль-ные ароматические соединения с молекулярной массой в диапазоне 300-500 Да, включающие водородные связи в молекуле, аминогруппу или атом азота, протони-рованный при физиологических значениях рН [3-5]. Подобные свойства характерны для фабомотизола (рис. 1), что позволяет предполагать его принадлежность к числу субстратов данного белка-транспортера.

Атом с высокой элекгроогрниательностьнк возможность образования водородной связи с молекулой Рщз

Мм=ЗШ,41

Возможность образования водородной связи

Рис. 1. Химическая структура фабомотизола с указанием характеристических групп

В научной литературе исследований по оценке принадлежности фабомотизола к числу субстратов, индукторов и ингибиторов Р§р не обнаружено.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилась оценка принадлежности фабомотизола к субстратам Р§р для прогнозирования возможных межлекарственных взаимодействий и осуществления эффективной и безопасной фармакотерапии.

Материалы и методы Работа выполнена на 12 половозрелых кроликах-самцах породы Шиншилла средней массой 3500-4300 г в соответствии с правилами лабораторной практики (Приказ Министерства здравоохранения РФ от 1 апреля 2016 г. №199н. «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики») [6].

Анализ принадлежности фабомоти-зола к субстратам Р§р проводили путем сравнения фармакокинетических параметров тестируемого вещества на фоне курсового введения известных индуктора и ингибитора белка-транспортера - рифампи-цина и верапамила соответственно. В случае участия Р§р в фармакокинетике тестируемого средства можно ожидать возрастания его концентрации в плазме крови после приема верапамила и обратные изменения после введения рифампицина [7].

Животным однократно внутрижелу-дочно вводили фабомотизол (таблетки Афобазол, 10 мг, ОАО «Фармстандарт-Лек-средства», Россия) в дозе 3,8 мг/кг [8,9] в форме суспензии на воде очищенной. Далее забирали образцы крови из ушной вены через 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90, 120 и 240 мин в объеме 5 мл с последующим анализом его фарма-кокинетики методом ВЭЖХ.

Определение концентрации тестируемого вещества в плазме крови выполняли методом абсолютной калибровки по площади пиков. Калибровочные растворы готовили добавлением к интактной плазме крови кроликов рассчитанного объема раствора стандарта фабомотизола, предоставленного разработчиками препарата, с концентрацией 10 мкг/мл. Матричный раствор (1 мг/мл) готовили на метаноле и

о

хранили при температуре 4 С.

Исследование выполнялось в изокра-тическом режиме. В качестве подвижной фазы применялась смесь ацетонитрил-вода-метанол-кислота уксусная ледяная-триэтиламин в соотношении 100-240-1000,3-0,25 с pH 6,10. Время удерживания фабомотизола составило 10,00±0,11 мин. Пределы определения и детектирования -соответственно 3,4 и 7,8 нг/мл.

Калибровочную зависимость площади хроматографического пика от концентрации фабомотизола определяли в диапазоне концентраций 50-1000 нг/мл по 6 точкам, для каждой точки выполняли по 5 измерений. В указанном диапазоне концентраций зависимость «концентрация фабомотизола - площадь пика» носила линейный характер. Коэффициент корреляции Пирсона составил 0,99935. Уравнение регрессии имело вид: y=1,9994*x+10,536, где за x - площадь пика, y - концентрация фабомотизола.

Для экстракции целевого вещества из плазмы крови и приготовления подвижной фазы применяли следующие реактивы: ацетонитрил «для ВЭЖХ» (Merck, Германия), метанол «для ВЭЖХ» (Merck, Германия) кислота уксусная ледяная ХЧ (Экос-1, Россия), триэтиламин «для ВЭЖХ» (Lab-Skan, Польша).

Экстракция фабомотизола из плазмы крови осуществлялась эфиром диэтиловым (1,5 мл плазмы и 6 мл экстрагента) путем встряхивания на приборе Shaker при 400 об./мин в течение 10 мин, центрифугирования при 3500 об./мин в течение 10 мин и упаривания супернатанта при 40°С. Коэффициент экстракции составил 87%.

Для расчета метрологических характеристик и основных валидационных па-

раметров разработанной методики применялись программы «Statist^a 7.0» и «Microsoft Excel», а также руководство «Guidance for Industry. Bioanalytical Method Validation» (2013).

Фармакокинетические параметры фабомотизола рассчитывали модельно-независимым методом вручную.

После анализа фармакокинетики фа-бомотизола в норме животные были разделены на 2 группы по 6 кроликов в каждой: 1-я группа получала ингибитор Pgp - верапамил (таблетки, покрытые оболочкой, 80 мг, Валента Фармацевтика ОАО, Россия) в дозе 20 мг/кг 3 раза в день 14-дневным курсом [10] в форме суспензии на воде очищенной, вторая - индуктор транспортера -рифампицин (капсулы Рифампицин, 150 мг, ОАО «Фармасинтез», Россия) аналогичным курсом в дозе 20 мг/кг массы [11] в форме суспензии на крахмальном клейстере. После применения модуляторов Pgp животным повторно вводили фабомотизол и анализировали его фармакокинетику. Следует отметить, что последнее введение верапамила осуществлялось утром - перед введением фабомотизола, а рифампицина -вечером предыдущего дня.

Полученные результаты обрабатывали с помощью программы «StatSoft Statistica 7.0». Наличие достоверных различий между значениями Tmax фабомоти-зола оценивали с помощью критерия Вил-коксона, а полученные результаты представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей (Med, lq, uq). Статистическую значимость различий между фарма-кокинетическими параметрами, за исключением Tmax, оценивали исходя из представления о лог-нормальном распределении данных. Сравнение изучаемых фарма-кокинетических параметров проводили с применением дисперсионного анализа повторных измерений (ANOVA) после их логарифмирования. Статистически значимыми принимали различия при значении р<0,05. Дополнительно рассчитывали двухсторонний 90%-й доверительный интервал. Согласно рекомендациям U.S. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research значимыми счита-

ются различия между фармакокинетиче-скими параметрами, если двухсторонний 90%-й доверительный интервал их отношения находится вне диапазона 0,8-1,25 (80-125%). Полученные результаты представлены в таблицах в виде среднего геометрического и его 95%-го доверительного интервала.

Результаты и их обсуждение

14-дневное введение кроликам-самцам ингибитора и индуктора Pgp - верапамила и рифампицина соответственно не приводило к изменениям фармакокине-тических параметров фабомотизола, что отражено в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Фармакокинетические параметры фабомотизола до и после курсового введения рифампицина

Изучаемые параметры Исходные значения, n=6 Рифампицин14 дней, n=6 Р

Cmax, НГ/МЛ 381,81 (203,00; 718,11) 235,26 (158,13; 350,01) 0,1738

Tmax, МИН 5,0 (5,0; 10,0) 5,0 (5,0; 5,0) 1,0000

T./„ мин 88,26 (27,49; 283,38) 72,32 (47,35; 110,44) 0,59620

AUC0-t, (нг/мл)*ч 11568,47 (6037,34; 22166,98) 9005,91 (5979,30; 13564,52) 0,3352

AUC0-M, (нг/мл)*ч 15768,75 (10440,89; 23815,35) 10625,97 (7556,48; 14942,30) 0,1064

Cl, л/мин 0,24 (0,16; 0,36) 0,36 (0,25; 0,50) 0,1064

Cmax/AUC0-t, 1/МИН 0,033 (0,027; 0,040) 0,026 (0,019; 0,035)* 0,04322

MRT, мин 127,35 (39,66; 408,92) 104,35 (68,33; 159,36) 0,59620

Kei, 1/МИН 0,008 (0,002; 0,025) 0,010 (0,006; 0,015) 0,59620

Vd, 1/мин 30,69 (8,66; 108,72) 37,32 (18,76; 74,21) 0,6671

Примечание (таблицы 1 и 2): * - достоверные отличия от показателей интактных животных. Данные представлены в виде среднего геометрического и его 95%-го доверительного интервала. Значения Ттах представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей.

Таблица 2

Фармакокинетические параметры фабомотизола до и после курсового введения верапамила

Изучаемые параметры Исходные значения n=6 Верапамил 14 дней, n=6 Р

Cmax, НГ/МЛ 413,02 (345,39; 493,90) 291,10 (168,23; 503,70) 0,11680

Tmax, МИН 5,0 (5,0; 5,0) 10,0 (5,0; 17,5) 0,4795

T/, МИН 62,59 (20,53; 190,85) 82,14 (26,53; 254,34) 0,5951

AUC0-t, (нг/мл)хмин 11067,60 (8638,72; 14179,41) 9741,60 (4929,07; 19252,89) 0,5242

AUCo-M, (нг/мл)хмин 12539,24 (11246,22; 13980,92) 13313,00 (7139,04; 24826,31) 0,7449

Cl, л/мин 0,30 (0,27; 0,34) 0,29 (0,15; 0,53) 0,7449

Cmax/AUCo-t, 1/ч 0,037 (0,026; 0,053) 0,030 (0,020; 0,044) 0,2636

MRT, мин 90,32 (29,62; 275,40) 118,52 (38,28; 367,01) 0,5951

Kel, 1/мин 0,011 (0,004; 0,034) 0,008 (0,003; 0,026) 0,5951

Vd, 1/мин 27,37 (8,31; 90,21) 33,83 (7,80; 146,71) 0,7092

Усредненные фармакокинетические кривые фабомотизола интактных животных и кроликов после курсового введения

ингибитора и индуктора Pgp представлены соответственно на рисунках 2 и 3.

Рис. 3. Усредненные фармакокинетические кривые фабомотизола в условиях нормы и на фоне 14-дневного введения рифампицина

Рис. 2. Усредненные фармакокинетические кривые фабомотизола в условиях нормы и на фоне 14-дневного введения верапамила

0 40 80 120 160 200 240

Время после введения фабомотизола, мин

Из приведенных данных видно, что лишь коэффициент абсорбции фабомоти-зола (Cmax/AUC0-t) в серии применения рифампицина достоверно снижался в 1,27 раза по сравнению с аналогичным параметром интактных животных (90%-й ДИ 0,66-0,94; p=0,04322). Однако это изменение не имело клинической значимости, т. к. 90%-й доверительный интервал значительно перекрывал диапазон 0,80-1,25, отмеченный рекомендациями FDA. Слабо-выраженная тенденция к снижению площади под фармакокинетической кривой (AUC0-œ) и аналогичное возрастание общего клиренса фабомотизола в данной серии,

вероятно, связано с индукцией микросо-мальных ферментов печени под действием рифампицина и интенсификацией метаболизма тестируемого препарата [9].

В нашем исследовании не было обнаружено значимого изменения фармако-кинетических параметров фабомотизола на фоне введения животным модуляторов активности Pgp. Однако на культурах клеток с множественной лекарственной устойчивостью показано, что ряд производных бензимидазола проникают в них в значительно меньшей степени, чем в нормальные клетки, что свидетельствует об их возможной принадлежности к субстратам

Pgp [12]. Таким образом, фабомотизол не относится к числу субстратов Pgp, или роль транспортера в его всасывании, распределении и экскреции не является ключевой, хотя его химическая структура имеет признаки субстратной специфичность в отношении транспортера.

Выявленное нами незначительное участие Pgp в фармакокинетике фабомоти-зола свидетельствует о том, что препарат можно назначать совместно с лекарственными веществами-модуляторами активности транспортера без корректировки его дозы. Кроме того, проникновение фабомо-тизола через гематоэнцефалический барь-

ер, где активно функционирует данный транспортер, будет достаточным для достижения минимальной терапевтической концентрации в ткани мозга, даже несмотря на его индукцию в условиях дефицита кислорода [6,10]. Это подтверждается результатами многочисленных исследований эффективности фабомотиазола в качестве анксиолитика и нейропротектора [13,14].

Вывод

В эксперименте in vivo на кроликах породы Шиншилла установлено, что фа-бомотизол не является субстратом белка-транспортера гликопротеина-P.

Конфликт интересов отсутствует.

Работа поддержана грантом РФФИ 16-44-620292 р_а.

Литература

1. Montanari F., Ecker G.F. Prediction of drug-ABC-transporter interaction - Recent advances and future challenges // Advanced Drug Delivery Reviews. 2015. Vol. 86. P. 17-26.

2. Аведисова А.С. Афобазол - безопасный препарат для лечения тревоги в общей практике // Русский медицинский журнал. 2006. Т. 14, №22. С. 1-3.

3. Ecker G., Huber M., Schmid D., et al. The importance of a nitrogen atom in modulators of multidrug resistance // Molecular Pharmacology. 1999. Vol. 56, №4. P. 791-796.

4. El-Ela A.A., Hartter S., Schmitt U., et al. Identification of P-glycoprotein substrates and inhibitors among psychoactive compounds-implications for pharmacokinet-ics of selected substrates // Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2004. Vol. 56, №8. P. 967-975.

5. Калетина Н.И. Токсикологическая химия метаболизм и анализ токсикантов. М.: ГЭОТАР-МЕДИА; 2008.

6. Гацанога М.В., Черных И.В., Щулькин А.В., и др. Можно ли оценивать принадлежность лекарственных веществ к субстратам гликопротеина-P на самках кроликов породы шиншилла // Наука молодых (Eruditio Juvenium). 2016. Т. 4, №3. С. 5-10.

7. Якушева Е.Н., Щулькин А.В., Черных И. В. Оценка принадлежности мексидола к субстратам, и ингибиторам или индукторам гликопротеина-Р // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2015. Т. 78, №5. С. 19-23.

8. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: ОАО Издательство «Медицина»; 2005.

9. Грибакина О.Г., Колыванов Г.Б., Литвин А. А., и др. Фармакокинетическое взаимодействие афобазола с лозартаном -препаратом-субстратом цитохрома CYP2C9 в эксперименте // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2013. Т. 76, №3. С. 35-37.

10. Якушева Е.Н., Черных И.В., Щулькин А.В., и др. Методика определения принадлежности лекарственных средств к числу субстратов гликопротеина-P // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2015. Т. 23, №3. С. 49-53.

11. Bamberger D.M., Fields M.T., Herndon B.L. Efficacies of various antimicrobial agents in treatment of Staphylococcus aureus abscesses and correlation with in vitro tests of antimicrobial activity and neutrophil killing // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1991. Vol. 35, №11. P. 2335-2339.

12. Nare B., Liu Z., Prichard R.K., et al. Benzimidazoles - potent anti-mitotic drugs: substrates for the P-glycoprotein transporter in multidrug-resistant cells // Biochemical pharmacology. 1994. Vol. 48, №12. P. 2215-2222.

13. Середенин С.Б., Воронин М.В. Фармакология нового анксиолитика афоба-

зола // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2009. Т. 72, №1. С. 3-11.

14. Cuevas J., Behensky A., Deng W., et al. Afobazole Modulates Neuronal Response to Ischemia and Acidosis via Activation of o-1 Receptors // Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 2011. Vol. 339, №1. P. 152-160.

Черных И.В. - к.б.н., ассистент кафедры общей и фармацевтической химии ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань, Российская Федерация. SPIN 5238-6165, ORCID ID 0000-0002-5618-7607, Researcher ID R-1389-2017.

E-mail: [email protected]

Щулькин А.В. - к.м.н., доцент кафедры фармакологии с курсом фармации ФДПО ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань, Российская Федерация. SPIN 2754-1702, ORCID ID 0000-0003-1688-0017, Researcher ID N-9143-2016.

Якушева Е.Н. - д.м.н., профессор, заведующая кафедрой фармакологии с курсом фармации ФДПО ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань, Российская Федерация. SPIN 2865-3080, ORCID ID 00000001-6887-4888, Researcher ID T-6343-2017.

E-mail: [email protected]

Гацанога М.В. - аспирант кафедры фармакологии с курсом фармации ФДПО ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань, Российская Федерация. SPIN 9645-5079, ORCID ID 0000-0002-1116-6271, Researcher T-3803-2017.

Попова Н.М. - к.м.н., старший преподаватель кафедры фармакологии с курсом фармации ФДПО ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань, Российская Федерация. SPIN 7553-9852, ORCID ID 00000002-5166-8372, Researcher ID B-1130-2016.

© Chernykh I.V., Shchulkin A.V., Yakusheva E.N., Gatsanoga M.V., Popova N.M., 2017

STUDY OF FABOMOTIZOLE BELONGING TO P-GLYCOPROTEIN SUBSTRATES

I.V. Chernykh, A.V. Shchulkin, E.N. Yakusheva, M. V. Gatsanoga, N.M. Popova

Ryazan State Medical University, Vysokovoltnaya str., 9, 390026, Ryazan, Russian Federation

P-glycoprotein (Pgp) is a membrane efflux protein transporter with numerous drug-substrates. In addition, a lot of drugs alter the activity of the transporter. It can lead to drug-drug interactions during polypharmacy. Fabomotizole (afobazol) is a Russian anxiolytic drug with neuroprotective activity, applied over a wide range of indications. The drug belongs to a potential substrate of Pgp according to its chemical structure. Aim. The aim of the study was to assess belonging of fabomotizole to Pgp substrates. Materials and Methods. The work was performed on 12 male Chinchilla rabbits. The belonging of fabomotizole to Pgp substrates

was evaluated by comparing pharmacokinetic parameters of the test-substance after course administration of known transporter inducers and inhibitors - rifampicin and verapamil respectively. Fabomotizole was administered orally as a single dose of 3.8 mg/kg b.w. and blood was taken from the ear vein after 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90, 120 and 240 min followed by it's pharmacokinetic analysis by HPLC. Pharmacokinetic parameters of fabomotizole were manually calculated by a model-independent method. The animals were then divided into 2 groups of 6 rabbits each: the 1st group received verapamil at a dose 20 mg/kg b.w. 3 times a day for 14 days, the 2nd - rifampicin in a similar course and dose. After the administration of Pgp modulators the pharmacokinetics of fabomotizole were re-analyzed. Results. It was found that only the absorption coefficient of fabomotizole in the rifampicin series was significantly reduced by 1.27 times as compared to the parameter of intact animals (90% CI 0.66-0.94, p=0.04322). However, this change was not clinically significant, because 90% CI overlapped the range of 0.80-1.25, noted by FDA. The remaining pharmacokinetic parameters of Pgp marker substrate were not significantly changed in any series. This is evidence that fabomotizole is not a Pgp substrate. The insignificant participation of Pgp in fabomotizole pharmacokinetics testifies that the drug can be administered together with drug-modulators of transporter activity without dose correction. Conclusion. In vivo experiment on Chinchilla rabbits showed that fabomotizole is not a substrate of P-glycoprotein.

Keywords: P-glycoprotein, fabomotizole, pharmacokinetics, rifampicin, verapamil, substrate.

P-glycoprotein (Pgp) is a membrane protein-transporter which uses the energy of ATP for efflux of endo- and xenobiotic with different chemical structure (among them a large number of modern drugs) from cells. The activity of the transporter varies under the influence of external and internal factors, including consumption of some medications. Thus, the transporter has a significant role in the development of drug-drug interactions [1].

Fabomotizole (afobazol) is an original Russian selective anxiolytic with neuropro-

tective activity and a wide range of indications for use and OTC release from pharmacies [2]. The research complex has shown that Pgp substrates are predominantly lipo-philic aromatic compounds with a molecular weight in the 300-500 Da range, which include hydrogen bonds in the amino group or a nitrogen atom protonated at physiological pH [3-5]. Similar properties are characteristic for fabomotizole (Fig. 1), which suggests that it belongs to the transporter protein substrates.

Aromatic structure

ÇA'

Atom with high Nytrogen . aiorns electronegativity.

possibility to form hydrogen bonds with Pgp

HCl

Mn=:J07,41 Possibility to form hydrogen bonds

Fig. 1. Chemical structure of fabomotizole with indication of it's characteristic groups

Studies devoted to evaluation of the fabomotizole belonging to substrates, induc-

ers and inhibitors of Pgp have not been found in the scientific literature.

Thus the aim of this work was to assess the belonging of fabomotizole to Pgp substrates in order to predict possible drug-drug interactions and use effective and safe pharmacotherapy.

Materials and Methods

The work was performed on 12 male mature Chinchilla rabbits with an average mass of 3500-4300 g in compliance with the rules of laboratory practice (Order of the Ministry of Health of the Russian Federation №199n (April 1, 2016 «On Approval of the Rules for good laboratory practice») [6]. The belonging of fabomotizole to Pgp substrates was evaluated by analysis of the test-substance pharmacokinetic parameters during course administration of known transporter protein inducers and inhibitors - rifampicin and verapamil respectively.

In case of Pgp's participation in the pharmacokinetics of the test-substrate it's plasma conentration is expected after a course of vera-pamil administration and reverse changes after the introduction of rifampicin [7].

The animals were orally administered fabomotizole (Afobazol tablets, 10 mg, Pharm-standard-Leksredstva, Russia) at a dose 3.8 mg/kg [8,9] in the form of a suspension in purified water. Blood samples were then collected from the ear vein after 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90, 120 and 240 min in a volume of 5 ml, followed by analysis of its pharmacokinetics by HPLC.

The quantitative analysis of the test substance in the blood plasma was carried out by the method of absolute calibration by the area of peaks. Calibration solutions were prepared by addition to the intact blood plasma certain amount of standard solution with concentration of 10 ^g/ml. A matrix solution (1 mg/ml) was prepared on methanol and stored at 4°C. The standard was supplied by developers.

The research was carried out in isocratic mode. As a mobile phase, a mixture of ace-tonitrile-water-methanol-acetic acid ice-triethylamine was used in the ratio 100-240100-0.3-0.25 (pH 6.10). The retention time of fabomotizole was 10.00±0.11 min. The lowest limit of detection and detection limit were 3.4 and 7.8 ng/ml respectively.

The calibration dependence of the peak area on the fabomotizole concentration was determined in a concentration range of 50-

1000 ng/ml at 6 points, 5 measurements were performed for each point. In the indicated concentration range, the correlation «concentration of fabomotizole - peak area» was linear. The Pearson correlation coefficient was 0.99935. The regression equation was: y = 1.9994*x+10.536, where x is peak area, and y is the concentration of fabomotizole.

To extract the target substance from the blood plasma and prepare the mobile phase the following reagents were used: methanol, acetonitrile «HPLC» (Merck, Germany), acetic acid (Ecos-1, Russia), triethylamine «HPLC» (Lab-Skan, Poland).

Extraction of fabomotizole from blood plasma was carried out with diethyl ether (1.5 ml of plasma and 6 ml of extragent) by shaking on a Shaker device at 400 rpm for 10 min, centrifugation at 3500 rpm for 10 min and evaporation of the supernatant at 40°C. The extraction degree was 87%.

«Statistiсa 7.0» and «Microsoft Excel» were used for calculation of the metrological characteristics and the main validation parameters of the developed method, as well as the Manual for Industry «Verification of the bioanalytical method» (2013).

Fabomotizole pharmacokinetic parameters were calculated by a model-independent method by hand.

After analyzing the basal fabomotizole pharmacokinetics the animals were divided into 2 groups of 6 rabbits each: the 1st group received Pgp inhibitor verapamil (coated tablets, 80 mg, Valenza Pharmaceuticals, Russia) at a dose 20 mg/kg 3 times a day for 14 days [10] as suspension on purified water, the second - the inductor of the transporter - rifampicin (capsules Rifampicin, 150 mg, Pharmasintez, Russia) at a dose of 20 mg/kg mass for 14 days [11] as suspension on a starch paste. After the Pgp modulators administration, fabomotizole was administered repeatedly and it's pharmacokinetics were reanalyzed in the animals. It should be noted that the last verapamil administration was carried out in the morning - before the fabomotizole introduction, and rifampicin - in the evening of the previous day.

The results were processed using StatSoft Statistica 7.0 program. The presence

of significant differences between the Tmax values of fabomotizole was assessed using Wilcoxon test, and the results of the studies are presented as median, lower and upper quartiles (Med, lq, uq). The statistical significance of the differences between other phar-macokinetic parameters was estimated from the notion of a log-normal distribution of data. Comparison of the studied pharmacokinetic parameters was implemented using ANOVA test after their logarithm. Differences were considered statistically significant at p<0.05. In addition, a two-sided 90% confidence interval was calculated. According to the recommendations of the US Food and Drug Administration, the Center for Drug Evaluation and

Research, significant differences considered between pharmacokinetic parameters a two-sided 90% confidence interval of their ratios is outside the range of 0.8-1.25 (80-125%). The results are presented in tables as a geometric mean and 95% confidence interval.

Results and Discussion A 14-day administration of Pgp modulators verapamil and rifampicin did not lead to changes in fabomotizole pharmacokinetic parameters (Tab. 1, 2).

The averaged fabomotizole pharmaco-kinetic curves of intact animals and rabbits after the course administration of Pgp inhibitor and inducer are presented respectively in figures 2 and 3.

Table 1

Fabomotizole pharmacokinetic parameters before and after the course

rifampicin administration

Pharmaco-kinetic parameter Basal values, n=6 Rifampicin 14 days, n=6 p

Cmax, ng/ml 381.81 (203.00; 718.11) 235.26 (158.13; 350.01) 0.1738

Tmax, min 5.0 (5.0; 10.0) 5.0 (5.0; 5.0) 1.0000

T>/„ min 88.26 (27.49; 283.38) 72.32 (47.35; 110.44) 0.59620

AUCo-t, (ng/ml)xh 11568.47 (6037.34; 22166.98) 9005.91 (5979.30; 13564.52) 0.3352

AUCo-M, (ng/ml)xh 15768.75 (10440.89; 23815.35) 10625.97 (7556.48;14942.30) 0.1064

Cl, l/min 0.24 (0.16; 0.36) 0.36 (0.25; 0.50) 0.1064

Cmax/AUCo-t, 1/min 0.033 (0.027; 0.040) 0.026 (0.019; 0.035)* 0.04322

MRT, min 127.35 (39.66; 408.92) 104.35 (68.33; 159.36) 0.59620

Kel, 1/min 0.008 (0.002; 0.025) 0.010 (0.006; 0.015) 0.59620

Vd, 1/min 30.69 (8.66; 108.72) 37.32 (18.76; 74.21) 0.6671

Note: * - significant differences compared with intact animals (basal level). The data is presented as the geometric mean and its 95% confidence interval. The values of Tmax are presented in the form of the median and lower and upper quartiles

Table 2

Fabomotizole pharmacokinetic parameters before and after the course

verapamil administration

Pharmaco-kinetic parameter Basal values, n=6 Verapamil 14 days, n=6 p

Cmax, ng/ml 413.02 (345.39; 493.90) 291.10 (168.23; 503.70) 0.11680

Tmax, min 5.0 (5.0; 5.0) 10.0 (5.0; 17.5) 0.4795

T/, min 62.59 (20.53; 190.85) 82.14 (26.53; 254.34) 0.5951

AUCc-t, (ng/ml)xh 11067.60 (8638.72; 14179.41) 9741.60 (4929.07; 19252.89) 0.5242

AUC0-M, (ng/ml)xh 12539.24 (11246.22; 13980.92) 13313.00 (7139.04; 24826.31) 0.7449

Cl, l/min 0.30 (0.27; 0.34) 0.29 (0.15; 0.53) 0.7449

Cmax/AUC0-t, 1/min 0.037 (0.026; 0.053) 0.030 (0.020; 0.044) 0.2636

MRT, min 90.32 (29.62; 275.40) 118.52 (38.28; 367.01) 0.5951

Kel, 1/min 0.011 (0.004; 0.034) 0.008 (0.003; 0.026) 0.5951

Vd, 1/min 27.37 (8.31; 90.21) 33.83 (7.80; 146.71) 0.7092

Fig. 2. Averaged fabomotizole pharmacokinetic curves of intact animals and rabbits after the course verapamil administration

400

о

350

ai 300

VJ

5 г■ 250

oi

?пг.

n

Г !

ISO

(J

E о j.OO

.с

та IX. 50

0

Intact rabbits

Verapamil 14 davs

40 80 120 160 200 240

Timeafterfabomotiiole administration, mtn

Eu tact rabbits

Rifampicin 14 davs

0 40 30 120 160 200 240

Time after fabomotizole administration, min

Fig. 3. Averaged fabomotizole pharmacokinetic curves of intact animals and rabbits after the course rifampicin administration

From the data given, it can be seen that only the fabomotizole absorption coefficient (Cmax/AUC0-t) in the rifampicin series significantly decreased by 1.27 times as compared to the similar parameter of intact animals (90% CI 0.66-0.94, p=0.04322). However, this change was not clinically significant, because the 90% confidence interval significantly overlapped the range of 0.80-1.25, noted by the recommendations of the FDA. A weak tendency to decrease the area under the phar-macokinetic curve (AUC0-®) and a similar increase in the fabomotizole total clearance in this series is probably due to the induction of microsomal liver enzymes under the rifampic-

in action and the intensification of the test drug metabolism [8].

In our study no significant changes in fabomotizole pharmacokinetic parameters during the introduction of Pgp modulators were found. However, in multidrug-resistant cell cultures it has been shown that a number of benzimidazole derivatives penetrate them to a much lesser degree than normal cells, indicating that they may belong to Pgp substrates [12]. We have found that the test drug is not among Pgp substrates, and the role of the transporter in its absorption, distribution and excretion is not key even though it's chemical structure has signs of substrate specificity to the transporter.

The insignificant participation of Pgp in the fabomotizole pharmacokinetics shows that the drug can be administered together with medicaments-modulators of the transporter activity without adjusting its dose. In addition, the penetration of fabomotizole through the blood-brain barrier, where this transporter is active, will be sufficient to achieve a minimum therapeutic concentration

in brain tissue, even despite its induction in conditions of oxygen deficiency [6,10]. This is confirmed by the results of numerous studies of fabomothiazole efficacy as an anxiolytic and neuroprotective agent [13,14].

Conclusion In vivo experiment on Chinchilla rabbits it has shown that fabomotizole is not a substrate of P-glycoprotein transporter protein.

Authors have no conflict of interest to declare.

The work is supported by the grant of Russian Fund for Fundamental Research №16-44-620292 р_а.

References

1. Montanari F, Ecker GF. Prediction of drug-ABC-transporter interaction - recent advances and future challenges. Advanced Drug Delivery Reviews. 2015;86:17-26.

2. Avedisova AS. Afobazol -bezopasnyy preparat dlya lecheniya trevogi v obshchey praktike. Russkiy meditsinskiy zhurnal. 2006;14(22):1-3. (In Russ).

3. Ecker G, Huber M, Schmid D, et al. The importance of a nitrogen atom in modulators of multidrug resistance. Molecular Pharmacology. 1999;56(4):791-6.

4. El-Ela AA, Härtter S, Schmitt U, et al. Identification of P-glycoprotein substrates and inhibitors among psychoactive compounds-implications for pharmacokinetics of selected substrates. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2004;56(8):967-75.

5. Kaletina NI. Toksikologicheskaya khimiya metabolizm i analiz toksikantov. Moscow: GEOTAR-MEDIA; 2008. (in Russ)

6. Gatsanoga MV, Chernykh IV, Shchulkin AV, et al. Mozhno li otsenivat' prinadlezhnost' lekarstvennykh veshchestv k substratam glikoproteina-P na samkakh krolikov porody shinshilla? Nauka molodykh (Eruditio Juvenium). 2016;4(3):5-10. (In Russ).

7. Yakusheva EN, Shchulkin AV, Chernykh IV. Ocenka prinadlezhnosti meksi-dola k substratam, i ingibitoram ili indukto-ram glikoproteina-R. Eksperimental'naya i klinicheskaya farmakologiya. 2015;78(5):19-23. (In Russ).

8. Khubriev RU. Rukovodstvo po eksperimental'nomu (doklinicheskomu) izu-

cheniyu novykh farmakologicheskikh veshchestv. Moscow: Medicina; 2005. (In Russ).

9. Gribakina OG, Kolyvanov GB, Litvin AA, et al. Farmakokineticheskoye vzaimodeystviye afobazola s lozartanom -preparatom-substratom tsitokhroma CYP2C9 v eksperimente. Eksperimental'naya i klinicheskaya farmakologiya. 2013;76(3):35-7. (In Russ).

10. Yakusheva EN, Chernykh IV, Shchulkin AV, et al. Metodika opredeleniya prinadlezhnosti lekarstvennykh sredstv k chislu substratov glikoproteina-P. Rossijskiy mediko-biologicheskiy vestnik imeni akademika I.P. Pavlova. 2015;23(3):49-53. (In Russ).

11. Bamberger DM, Fields MT, Herndon BL. Efficacies of various antimicrobial agents in treatment of Staphylococcus aureus abscesses and correlation with in vitro tests of antimicrobial activity and neutrophil killing. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1991;35(11):2335-9.

12. Nare B, Liu Z, Prichard RK, et al. Benzimidazoles - potent anti-mitotic drugs: substrates for the P-glycoprotein transporter in multidrug-resistant cells. Biochemical pharmacology. 1994;48(12):2215-22.

13. Seredenin SB, Voronin MV. Farmakologiya novogo anksiolitika afoba-zola. Eksperimental'naya i klinicheskaya farmakologiya. 2009;72(1):3-11. (In Russ).

14. Cuevas J, Behensky A, Deng W, et al. Afobazole Modulates Neuronal Response to Ischemia and Acidosis via Activation of g-1 Receptors. Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 2011;339(1): 152-60.

Chernykh I.V. - PhD in Biological sciences, Assistant of General and Pharmaceutical Chemistry Department, Ryazan State Medical University, Ryazan, Russian Federation. SPIN 5238-6165, ORCID ID 0000-0002-5618-7607, Researcher ID R-1389-2017.

E-mail: [email protected]

Shchulkin A.V. - MD, PhD, Assistant of Pharmacology Department with Course of Pharmacy of Continuing Professional Education Faculty, Ryazan State Medical University, Ryazan, Russian Federation. SPIN 2754-1702, ORCID ID 0000-0003-1688-0017, Researcher ID N-9143-2016.

Yakusheva E.N. - MD, Grand PhD, Professor, Head of Pharmacology Department with Course of Pharmacy of Continuing Professional Education Faculty, Ryazan State Medical University, Ryazan, Russian Federation. SPIN 2865-3080, ORCID ID 0000-0001-6887-4888, Researcher ID T-6343-2017.

E-mail: [email protected]

Gatsanoga M.V. - Postgraduate Student of Pharmacology Department with Course of Pharmacy of Continuing Professional Education Faculty, Ryazan State Medical University, Ryazan, Russian Federation. SPIN 9645-5079, ORCID ID 0000-0002-1116-6271, Researcher ID T-3803-2017.

Popova N.M. - MD, PhD, Assistant of Pharmacology Department with Course of Pharmacy of Continuing Professional Education Faculty, Ryazan State Medical University, Ryazan, Russian Federation. SPIN 7553-9852, ORCID ID 0000-0002-5166-8372, Researcher ID B-1130-2016.