CC BY
9
ISSN2221-7711 Национальные приоритеты России. 2021. № 3 (42)
УДК 595.42:621.384.8
ГрумовД.А., СмирноваН.С., КостарнойА.В.
ФГБУ «Национальный исследовательский центр микробиологии и эпидемиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Россия
ИЗУЧЕНИЕ ПРИМЕНИМОСТИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ДЛЯ БЫСТРОЙ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПЕРЕНОСЧИКОВ ИНФЕКЦИЙ НА ПРИМЕРЕ ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕЙ
В данной работе провели идентификацию клещей - переносчиков инфекций с помощью классических методов и метода масс-спектрометрического анализа. В результате исследования клещи были идентифицированы до вида как Ixodes nanus всеми используемыми методами - по морфологическим признакам, масс-спектрометрическим анализом, а также методом ПЦР в реальном времени. Таким образом, применение масс-спектрометрического анализа является хорошей альтернативой классическим методам идентификации переносчиков инфекций, а также имеет ряд преимуществ, таких как простота исполнения, широкое распространение масс-спектрометрического оборудования и перспектива использования метода для санитарно-эпидемиологического надзора природно-очаговых инфекций.
Ключевые слова: иксодовые клещи, масс-спектрометрия.
GrumovD.A., SmirnovaN.S., KostarnoyA.V.
The National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya of the Ministry of Health of the Russian Federation
EVALUATION OF APPLICATION MASS SPECTROMETRY ANALYSIS FOR RAPID IDENTIFICATION OF SPECIES ON EXAMPLE OF IXODIDAE TICKS
We have performed an evaluation of application mass spectrometry analysis for the identification of species ticks on example Ixodes ricinus. Results have shown correct identification by mass spectrometry analysis, matching identification by morphological evaluation and "real-time" PCR. Furthermore, the simplicity of the method and widespread use of mass spectrometric equipment show that the application of mass spectrometry for identifying tick species can be a good alternative to classical identification methods of vectors of infections. Also, mass spectrometry identification of ticks is a perspective tool for epidemiological control of the vector-borne disease.
Keyword: Ixodidae ticks, mass spectrometry.
Клещи являются природными резервуарами и переносчиками природно-очаговых инфекций, таких как риккетсиозы, бабезиозы, боррелиоз, анаплазмозы, которые опасны, как для человека, так и для домашних и сельскохозяйственных животных. В настоящее время активно проводят исследования, в которых изучают способность разных видов клещей переносить определенных возбудителей [3, 4]. Наличие клещей определенного вида или рода
© Грумов ДА., Смирнова Н.С., Костарной А.В., 2021
дает возможность прогнозировать вспышки природно-очаговых инфекций и их распространение в изучаемом регионе. Актуальность этих исследований также обусловлена изменениями климата, миграцией населения и активно развивающимся за последние десятилетия туризмом по всему миру, что приводит к завозным случаям заболеваний указанных ранее инфекций. В связи с этим наличие быстрых и эффективных методов идентификации пере-
ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫЕ ИНФЕКЦИИ И ИНВАЗИИ
носчиков инфекций является значимым для контроля природно-очаговых инфекций и дальнейшего санитарно-эпидемиологического надзора. Одним из таких методов является идентификация переносчиков инфекций методами масс-спектрометрии. Широкое распространение по всему миру и Российской Федерации необходимого оборудования для масс-спектрометрической идентификации видов, а также возможность быстрого и простого анализа данным методом позволяет рассматривать его как перспективное направление для контроля природно-очаговых инфекций и выявления переносчиков инфекций.
Идентификация различных организмов методами масс-спектрометрии является активно развивающимся направлением в современных исследованиях. Современные методы «мягкой» ионизации позволяют сохранять ин-тактными такие биомолекулы, как белки, полисахариды и липиды, что позволяет их использовать для различных методов масс-спектрометрического анализа. Масс-спектрометрические методы идентификации видов основаны на использовании спектров протеиновых профилей, получаемых анализом белковых экстрактов из различных организмов с помощью систем MALDI-TOF/MS. Из спектров протеиновых профилей, после генотипи-ческого подтверждения принадлежности организма к виду, создаются специальные базы данных, по которым в дальнейшем можно идентифицировать организм без использования дополнительных инструментов. Использование методов масс-спектрометрии при наличии готовой базы данных позволяет идентифицировать в течение нескольких часов организм вплоть до вида. На данный момент существует ряд работ, в которых описаны методы для идентификации с помощью масс-спектрометрии различных переносчиков инфекции, включая клещей [2].
В данной работе мы провели оценку применимости метода идентификации переносчиков инфекции методами масс-спектро-метрии на примере иксодовых клещей.
Для этого использовались самцы и самки вида Ixodes ricinus, которые были собраны в городском парке «Серебряный бор» (г. Москва) и идентифицированы с помощью морфологических признаков и с помощью метода "real-time" ПЦР. Для идентификации вида методами масс-спектрометрии от каждой осо-
би отделялись 8 ножек и помещались в смесь 20 мкл 70 % муравьиной кислоты (v/v) и 20 мкл 50 % ацетонитрила (v/v). Далее проводилась гомогенизация с использованием автоматизированной системы FastPrep-24 (MP Biomedicals, Illkirch-Graffenstaden, France) в про-пробирках, содержащих стеклянные шарики (с диаметром 106 мкм) (Sigma, Lyon, France). После гомогенизации проводилось центрифугирование при 200 x g в течение 1 минуты для удаления клеточного дебриса и хитина. Су-пернатант от каждого образца в объеме 4 мкл наносился на MALDI-TOF 386-луночную стальную мишень (Bruker Daltonics, Germany). После высушивания образцов на мишени на воздухе при комнатной температуре на каждый образец наносился 1 мкл раствора матрицы, представляющий собой насыщенный раствор а-циано-4-гидроксикоричной кислоты в 50 % растворе ацетонитрила (v/v), 2,5 % три-фторуксусной кислоты (v/v). После этого образцы на мишени высушивались на воздухе при комнатной температуре и после высыхания мишень помещалась для анализа в масс-спектрометр.
Масс-спектрометрический анализ проводился на UltrafleXtreme масс-спектрометре (Bruker Daltonics, Germany) стандартным методом анализа Biotyper, который анализирует в линейном режиме позитивно-заряженные ионы в диапазоне масс от 2000 Да до 20 кДа. Для получения спектров использовалось программное обеспечение Flex Control (v.3.4, build 135, Bruker Daltonics, Germany). Полученные спектры были процессировались программным обеспечением MALDI Biotyper Compass Explorer 4.1 и flexA-nalysis 3.4 (Bruker Daltonics, Germany). Для определения вида использовался суммированный масс-спектр для каждого образца, состоящий из 2000 спектров. Данные суммированные масс-спектры анализировались с помощью базы данных для иксодовых клещей, созданной P.H. Boyer и коллегами [1], которая была им-плементирована в программное обеспечение MALDI Biotyper Compass Explorer 4.1.
В результате идентификации по масс-спектру с помощью базы данных иксодовых клещей, созданной P.H. Boyer и коллегами, мы получили подтверждение видовой принадлежности клещей к Ixodes ricinus, которая соответствовала результатам идентификации с помощью морфологических признаков и с помощью метода "real-time" ПЦР. Однако
ISSN2221-7711 Национальные приоритеты России. 2021. № 3 (42)
внутренняя оценка достоверности, выдаваемая программным обеспечением MALDI Biotyper Compass Explorer 4.1 (Bruker Daltonics, Germany), была ниже оценки, соответствующей достоверной идентификации рода или вида.
Согласно полученным результатам, мы предполагаем, что использование масс-спектрометрических методов анализа для идентификации вида или рода может позволить эффективно идентифицировать клещей и других переносчиков инфекций. В частности, возможно создание методов, которые позволят идентифицировать как переносчика инфекции, так и возбудителей инфекции в нем [5]. Однако, на данный момент базы данных членистоногих-переносчиков для идентификации методами масс-спектрометрии содержат мало
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Boyer P. H. et al. Identification of closely related Ixodes species by protein profiling with MALDI-TOF mass spectrometry // PloS one. 2019. Т. 14. № 10. С. e0223735.
2. Murugaiyan J., Roesler U. MALDI-TOF MS profiling-advances in species identification of pests, parasites, and vectors // Frontiers in cellular and infection microbiology. 2017. Т. 7. С. 184.
3. Shao J. W. et al. Distribution and molecular characterization of rickettsiae in ticks in Harbin area of Northeastern China // PLoS Neglected Tropical Diseases. - 2020. Т. 14. № 6. С. e0008342.
4. Sprong H. [et al.]. Detection of pathogens in Dermacentor reticulatus in northwestern Europe: evaluation of a high-throughput array // Heliyon. 2019. Т. 5. № 2. С. e01270.
5. Yssouf A. [et al.]. Detection of Rickettsia spp in ticks by MALDI-TOF MS //PLoS neglected tropical diseases. 2015. Т. 9. № 2. С. e0003473.
информации по небольшому количеству видов, которые, к тому же не представлены на территории Российской Федерации, что значительно влияет на достоверность идентификации рода или вида. Поэтому является целесообразным пополнение баз данных или создание новых баз данных, содержащих ре-ференсные протеиновые профили членистоногих-переносчиков, для которых предварительно была подтверждена принадлежность к виду или роду генотипическими методами. Таким образом, видовая идентификация членистоногих-переносчиков инфекций с помощью масс-спектрометрии является перспективным направлением для санитарно-эпидемиологического надзора за природно-очаговыми инфекциями.
REFERENCES
1. Boyer P. H. et al. Identification of closely related Ixodes species by protein profiling with MALDI-TOF mass spectrometry // PloS one. 2019. Т. 14. № 10. С. e0223735.
2. Murugaiyan J., Roesler U. MALDI-TOF MS profiling-advances in species identification of pests, parasites, and vectors // Frontiers in cellular and infection microbiology. 2017. Т. 7. С. 184.
3. Shao J. W. et al. Distribution and molecular characterization of rickettsiae in ticks in Harbin area of Northeastern China // PLoS Neglected Tropical Diseases. - 2020. Т. 14. № 6. С. e0008342.
4. Sprong H. [et al.]. Detection of pathogens in Dermacentor reticulatus in northwestern Europe: evaluation of a high-throughput array // Heliyon. 2019. Т. 5. № 2. С. e01270.
5. Yssouf A. [et al.]. Detection of Rickettsia spp in ticks by MALDI-TOF MS //PLoS neglected tropical diseases. 2015. Т. 9. № 2. С. e0003473.
Грумов Даниил Александрович - младший научный сотрудник лаборатории экологии риккетсий; Смирнова Нина Сергеевна - младший научный сотрудник лаборатории экологии риккетсий; Костарной Алексей Викторович - кандидат биологических наук, заведующий лабораторией экологии риккетсий, ведущий научный сотрудник; ФГБУ «НИИЦЭМ им Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ.
