CC BY
20
УДК 541(64 + 183.12): 547.54
Вестник СПбГУ. Сер. 4, 2007, вып. 1
М. А. Сибилева, Ю. Г. Могучева, А. И. Сибилев*\ П. Н. Москалев
ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ СВОЙСТВ КОМПЛЕКСОВ ДНК С СУЛЬФИРОВАННЫМИ ДИФТАЛОЦИАНИНАМИ СКАНДИЯ И ЛЮТЕЦИЯ В СОЛЕВЫХ РАСТВОРАХ ОБЫЧНОЙ И ТЯЖЕЛОЙ ВОДЫ
Введение. Водорастворимые сульфированные дифталоцианины (СДФЦ) ряда элементов, синтезированные П. Н. Москалевым и соавторами в 1960-х годах [1, 2], обладают уникальными качествами и применениями. В частности, было обнаружено и запатентовано [3] чрезвычайно важное их свойство - противовирусная активность в отношении вируса гриппа, осповакцины и саркомы Рауса. При этом токсичность этих соединений для человека ниже, чем у ремантадина. Наиболее высокие значения коэффициента защиты получены при испытании соединений скандия и лютеция [3-5]. Установление противовирусной активности СДФЦ потребовало изучения ее механизма и возможного взаимодействия данных красителей с клеточными мембранами и/или биомакромолекулами, в частности с ДНК, чем и обусловлен их выбор в настоящей работе. Для СДФЦ редкоземельных элементов ранее на опыте были обнаружены факты, говорящие об адсорбции красителей на некоторых отрицательно заряженных поверхностях: модельных бислойных липидных мембранах, монослоях искусственного липида глицеролмоноолеата [6] и нестабилизированных полистирольных латексах [7]. Таким образом, СДФЦ способны взаимодействовать с разными объектами -как биологическими, так и синтетическими, обладающими полимерной природой (полисти-рольные латексы). Общим в этих случаях является именно отрицательный заряд поверхности названных систем. Подобные исследования продолжены в работе [8], в которой использовали ДНК и гголи-Ы-винилкапролактам (ПВКЛ). В ней был сделан вывод об образовании комплексов этих полимеров с СДФЦ скандия и лютеция (СДФЦЗс, СДФЦЬи) и изучены .некоторые свойства их растворов. Однако механизм взаимодействия, превращающего нейтральную (ПВКЛ) или полиэлектролитную (ДНК) макромолекулы в новый полиэлектролит, оставался не ясным.
Задача настоящей работы - выяснить, как изменяются свойства молекулы ДНК под влиянием взаимодействующих с ней красителей СДФЦЗс или СДФЦЬи. Для этого были изучены зависимости различных свойств растворов комплексов от ионной силы среды ц (или концентрации С4. соли ]МН4С1).
Материалы и методика эксперимента. Использовали два образца ДНК: из селезенки крупного рогатого скота (I) и тимуса теленка (II) с молекулярными массами М= 11 и 15 МДа, определенными по величинам характеристической вязкости [7]0 в 0,15 М ЫаС1 при 20 °С согласно формуле Эйгнера и Доти [//]о= 6,9- Ю-4 М0,7 [9]. Концентрацию ДНК в исходных растворах определяли методом Спирина [10]. О нативности молекулы ДНК судили по величине молярного коэффициента экстинкции £2бо(Р) на X = 260 нм, которая для всех исследованных растворов была в пределах 6500-6900 М"' • см-'. Молекулы красителей являются солями, анионы которых («сэндвичи» с ионом Яс или Ьи между двумя макроциклами) имеют заряд 4— за счет ковалентно присоединенных (БОзУ'-групп, а катионами - четыре КН4+ -группы. Брутто-формула красителей
[С32Н16Ы8(803)2]2 • 41МН4 • М, где М - 8с или Ьи.
Петербургский институт ядерной физики им. Б. Л. Константинова РАН, г. Гатчина Ленинградской обл. © М. А. Сибилева, Ю. Г. Могучева, А. И. Сибилев, П. Н. Москалев, 2007
Поддерживающим электролитом была соль NH^CI квалификации «ос. ч.» с концентрациями С„ = 0,0005, 0,001 и 0,005 М. Долю связанного красителя г в комплексах изменяли в пределах 0-Ю,2.
В основном применяли методы спектрофотометрии в УФ- и видимой областях спектра (Я = 250-И 100 нм) и низкоградиентной вискозиметрии [11] в области градиентов скорости потока g = 0,05-4),7 с"1. Ряд систем был изучен методом двойного лучепреломления в потоке (ДЛП), который позволяет судить об оптических свойствах макромолекул.
При измерении характеристической вязкости [rj]0 при g = 0 сначала для нескольких концентраций ДНК измеряли зависимости относительных вязкостей rjr = r\!r\§{r\ и т/0- вязкости раствора и растворителя соответственно) от g. Экстраполяцией rjr на g = 0 находили величины rjrо, которые использовали для нахождения [rj]о в соответствии с определением [rj\0 по Хаггинсу
Mo = lim (^-l)/С
с—>0
и по Кремеру
[rj]0= lim Inг]^! С.
с—О
Результаты и их обсуждение. Работа состоит из двух частей.
В первой было изучено влияние тяжелой воды D?0 на размеры молекулы свободной ДНК (величину [>7]0) при разных ионных условиях. Установлено, что: 1) для растворов ДНК в Н20 относительная вязкость t]r не зависит от g, в то время как в D20 зависит и при этом не только при малой (0,001 М), но и при умеренной (0,005 М NH4C1) ионной силе (рис.1); 2) при всех использованных ионных силах (С, = 0,0005, 0,001 и 0,005 М NH4C1)
Рис. 1. Зависимость относительных вязкостей ^растворов ДНК-II в 0,005 М NH^Cl в D20 от градиента скорости потока g для различных концентраций ДНК.
Концентрации ДНК Сл„к (г/дл): 7-0,0021, 2 - 0,0034, 3 - 0,00458, 4-0,0066, 5 -0,0081.
молекула ДНК в растворах В20 более компактна (имеет меньшие значения [ц]о), чем в Н20 (рис. 2, линии 7 и 2). В результате зависимость 1/2) для ДНК в Э20 располагается
ниже, чем для Н20. Этот факт связан с большей энергией водородных связей в Б20 (по сравнению с Н20) и, следовательно, более значительной ролью гидрофобных эффектов в молекуле [12]. Общий характер зависимости [г{]о=/(а 1/2) согласуется с приведенными в [13] данными для ДНК в растворах ЫаС1, где тангенс угла наклона ее линейного участка равен 4,0 (дл-1УГ|/2)/г. В нашем случае упомянутый наклон меньше (рис. 2) и равен 3,9 (дл-М~1/2)/г. Это соответствует результатам работы [14], в которой ДНК изучена в растворах хлоридов разных катионов (не только щелочных металлов, но и аммония, и его тет-раалкилзамещенных). Для молекулы ДНК в тех же ионных условиях, но в 020, прямая 2 на рис. 2 имеет наклон, равный 1,6. Как будет показано ниже, аналогичное влияние оказывает Б20 и на комплексы ДНК с СДФЦБс.
I_._1_I__I_I_!___'•»■'■'•'■'
0,005 0,001 0,0005
ЦЛСХ),М
Рис. 2. Зависимость характеристической вязкости = / (// Ь2) для растворов ДНК в Н20 (I) и Э20 (2) и для двух комплексов с СДФЦБс в разных условиях (3, 4).
3- г = 0,02, Н20 ; 4 - г = 0,06, 020.
Во второй части работы изучали свойства комплексов ДНК с СДФЦБс и СДФЦЬи. Образование их в Н20 было установлено в работе [8] на основании изменений (хотя и не очень больших) в спектрах растворов чистых красителей при добавлении к ним растворов ДНК (СФ-титрование). В настоящей работе была проведена проверка равновесности (или неравновесности) связывания СДФЦБс с ДНК в комплексах. При первом типе связывания в растворе имеется равновесие между связанными с ДНК и свободными молекулами красителя. При неравновесном (сильном) связывании в растворе нет свободного красителя, т. е. он весь «сел» на макромолекулу. Судить о типе связывания можно, пользуясь двумя способами разбавления исходного раствора комплекса при концентрационных измерениях, необхо-18
димых для нахождения характеристической вязкости. В первом случае при разбавлении надо сохранять постоянной концентрацию свободного красителя: Ссвоб = const. Для этого необходимо иметь кривую связывания (т. е. зависимость доли связанного красителя г от Ссвоб)> которую обычно получают из данных СФ-титрования. В случае сильного (неравновесного) связывания при разбавлении надо сохранять неизменной величину г, равную отношению мольных концентраций красителя и ДНК.
Результаты проведенных опытов свидетельствуют о том, что величина [rj]0 практически не зависит от способа разбавления, а это говорит о прочном (неравновесном) типе связывания компонентов комплекса. Однако при приготовлении комплексов с различными значениями г для изучения полиэлектролитных свойств были учтены данные СФ-титрования и в растворитель добавлены свободные красители СДФЦБс и СДФЦЬи. Как оказалось, их концентрации были невелики - не превышали 1,25-Ю-5 М, что примерно в 5-6 раз меньше, чем Ссаяз- Это согласуется с фактом преобладания сильного типа связывания, вытекающего из зискозиметрического исследования.
Результаты, полученные для комплексов с различным содержанием красителей в HjO, таковы. В 0,001 М NH4C1 в присутствии СДФЦБс величина [rf\lh пропорциональная удельному объему молекулы ДНК, падает примерно в 1,7 раза уже при г - 0,01 и далее не изменяется (линия 1 рис. 3). В то же время с ростом содержания СДФЦЬи происходит постепенное уменьшение которая достигает того же значения лишь при г ~ 0,15 (см. рис. 6 работы [8]). В 0,005 М NH4C1 различий в ходе зависимости [rj]o=f (г) между двумя красителями нет, и величина ДНК падает примерно в 1,4 раза (рис. 4). Иначе говоря, оба красителя при малых значениях ¡.i по-разному компактизуют ДНК [8], но эти различия исчезают при повышении ц до 0,005 М NH4CI. Таким образом, при образовании комплексов при у. = 0,001 М NH4CI имеют место кулоновское взаимодействие и участие ионов Lu3+ и Sc3+. При повышении ц до 0,005 М фосфаты ДНК экранируются облаком противоионов, в результате чего эффект компактизации ДНК уменьшается и исчезает различие во влиянии на нее элементов Lu и Sc.
Измерения ДЛГ1 показали, что при всех ионных условиях значения удельной анизотропии растворов ДНК и ее комплексов с каждым из двух красителей совпадают между собой. В предположении неизменности оптической анизотропии мономерного звена (пары нуклео-тидов ДНК) это означает, что красители компактизуют молекулу ДНК изотропно, без изменения равновесной жесткости молекулярной цепи.
При изучении влияния D20 на комплексы ДНК с СДФЦЗс установлено, что при ju = 0,001 М NH4CI замена обычной воды (Н20) на тяжелую (D20) преобразует кооперативный характер связывания с ДНК этого красителя в обычный, некооперативный.
Характер зависимости [rf\0= f(r) при малой ионной силе (0,001 М NH4CI) в D20 и Н20 имеет сходства и различия, о чем говорит сравнение кривых 7 и 2 на рис. 3. В D20 размеры молекулы ДНК сначала остаются постоянными до г < 0,02, после чего начинается постепенная компактизация молекулы под влиянием СДФЦБс, в результате завершения которой при г > 0,07 удельный объем макромолекулы комплекса оказывается приблизительно в 1,7 раза меньше, чем свободной ДНК. Последнее наблюдалось и в растворах в Н20 при 0,001 М NH4CI [8]. Из рис. 3 видно также, что в D20 зависимость [г{]о=/{г) при малой ионной силе (0,001 М NH4CI) очень близка к наблюдаемой при умеренной (0,005 М NH4C1), в отличие от описанного выше поведения этих систем в Н20. То есть в D20 ионная сила в пределах 0,00 КО,005 М мало влияет на изменение размеров комплексов. Это хорошо видно также из рис. 2 (прямые 3 и 4), где представлены данные для полностью сформировавшихся комплексов, т. е. для тех значений г, когда кривые зависимостей = Дг) достигают
[ пъ. дл/г
130
120 по 100
90 80
70 0,00
[??]о,Дл/г 90
0,05
0,10
0,15
0,20
70
60
50
- □ □ 2
) О 3
- Ги"^ 1_д]..'
- -3-в—
I 1 1 <1,1,
0,00
0,05
0,10
0,15
Рис. 3. Зависимость характеристической вязкости [>?]0 комплексов ДНК-П с СДФЦБс от доли г связанного с ДНК красителя при различных условиях
Л Н20, 0,001 М МН4С1 (данные работы [8]); 2-ВгО, 0,001 М МН4С1; 3- 020, 0,005 МЫН4С1.
насыщения. Здесь, по-видимому, имеется еще один повод допустить, что двукратное уменьшение удельного объема молекулы ДНК является предельно возможным, достигаемым ею в модельных системах (в растворе) под влиянием различных взаимодействующих с ней биологически активных соединений, как, например, основных белков хроматина -гистонов [15, 16].
[ ??]и. дя/г
90 г
85 80
75
70 65 60
О /
О *
I" Л?
В
О-
0.00
0,05
0,10
0,15
0.20
Рис. 4. Зависимость характеристической вязкости [^]о комплексов ДНК-II с СДФЦЬи (/) и СДФЦБс (2) в 0,005 М NH4C1 от доли г связанных с ДНК красителей.
Заключение. Прежде всего для сравнения отметим, что при взаимодействии СДФЦЬи и СДФЦБс с незаряженной молекулой ПВКЛ с увеличением г происходит возрастание (а не уменьшение, как в случае ДНК) характеристической вязкости [/¡>]0, пропорциональной удельному объему макромолекулы в растворе. Причина - отталкивание одноименных зарядов, возникших при образовании комплексов на ранее незаряженной, но полярной полимерной цепи ПВКЛ [8]. Механизмом взаимодействия между компонентами комплексов в этом случае является, скорее всего, ион-дипольный. В случае же ДНК ситуация сложнее. Учитывая стерические условия и особенности взаимодействующих компонентов, можно считать более вероятным внешнее связывание красителей с ДНК (не интеркаляцию). При этом наряду с электростатическими и ион-дипольными взаимодействиями существенную роль играют гидрофобные. О последнем свидетельствует более высокая компактность ДНК в растворах 020 по сравнению с Н20. В том же смысле может быть интерпретирована разница в воздействии ионов Ьи3+ и 8с3+ на размеры макромолекул комплексов. Действительно, меньший ионный радиус скандия может привести к большей гидрофобности аниона СДФЦБс в целом.
Мы надеемся получить более детальную и определенную информацию о механизмах комплексообразования при изучении спектров кругового дихроизма растворов и спектров колебаний (50з)'~-групп красителей методами ИК-спектроскопии и комбинационного рассеяния света.
Summary
Sibileva M. A., Mogucheva Yu. G., Sibilev A. /., Moskalev P. N. The study of polyelccirolitic properties of DNA complexes with Sulfonated Scandium and Lutecium Diphthalocyanines in salt solutions in ordinary and hard water.
The influence of the ionic strength environment on the in the sizes (intrinsic viscosity [>/]„) of DNA and its complexes, consisting of DNA and Sulfonated Lutecium or Scandium Diphthalocyanincs arc investigated. The sizes of DNA molecule is smaller in D20, than in H20. The sizes of complexes decreases (with an increase in the fraction r of bound dye moleculcs) as compared to the size of a free DNA molecule.
Литература
1. Кирин И. С, Москалев П. H„ Макашев Ю. A. //Журн. неорг. химии. 1955. Т. 10. С. 1951-1957. 2. А. с. № 196216 (СССР) / Москалев П. И. Способ получения молекулярных комплексов дифталоцианинов редкоземельных элементов с иодом или бромом // Бюл. ГК СССР по делам изобретений и открытий. 1967. Т. 11. С. 10. 3. А. с. № 1153536 (СССР) / Москалев П. //., Комаров Е. В., Шнейдер М. А. и др. Сульфированный дифталопиапнн скандия, обладающий противовирусной активностью // Бюл. ГК СССР по делам изобретений и открытий. 1985. Т. 37. С. 257. 4. А. с. № 298579 (СССР) I Кирин И. С., Москалев П. Н. Способ получения сульфированных дифталоцианинов металлов// Бюл. ГК СССР по делам изобретений и открытий. 1971. Т. 11. С. 84. 5. Москалев П. Н. II Коорд. химия. 1990. Т. 16, вып. 2. С. 147- 150. 6.Драбкин Г. М., Забиякин В. С, Иоффе А. И. и др. Установка для исследования физико-химических и структурных свойств мономолекулярных пленок на границе раздела жидкость-газ: Препринт Лснингр. ин-та ядерной физики им. Б. ГТ. Константинова АН СССР, № 1052. Гатчина, 1985. 7. Клюоин В. В., КругловаЛ. А., Сибилев А. И. // Коллоидн. журн. 1991. Т. 53, № 1. С. 39-45. 8. Sibileva М. A., Kul'velis Yu. V., Sibilev А. /., Moskalev P. N. // Russian J. Phys. Chemistry. 2005. Vol. 79. Suppl. 1. P. S60-S65. 9. Eigner Y., Doty P. U J. Mol. Biology. 1965. Vol. 12. P. 549-580. 10. Спирин А. С. II Биохимия. 1958. Т. 23, вып. 5. С. 656-662. 11. Фрис-ман Э. В., ЩагинаЛ. В., Воробьев В. И. /' Коллоидн. журн. ¡965. Т. 27, № I. С. 130-133. 12.Лобышев В. И., Кагы-ниченко Л. П. Изотопные эффекты D20 в биологических системах. М., 1978. 13. Фрисман Э. В. // [V Междунар. биофизич. конгресс: Докл. симпозиумов. Пущино, 1973. Т. 1. С. 301-318. 14. Sibileva М. A., Moiseenko A. F., Fris-тап Е. V. //Studia biophysica. 1989. Vol. 129, N LP. 37-54. 15. Фрисман Э. В., Сибилева М. А., Пинаев Г. П. и др. // Молекулярная биология. 1969. Т. 3, вып. 2. С. 182-189. 16. Сибилева М. А., Осипова Т. Н., Заленский А. О. и др. // Молекулярная биология. 1976. Т. 10, вып. 3. С. 514-520.
Статья принята к печати 19 сентября 2006 г.
