CC BY
78
Изучение показателей иммунитета при вакцинации против гепатита В
А.А. Гражданцева1, О.В. Носарева1, А.Е. Нестеров1, Г.Ф. Сиволобова1,
Л.И. Локтева2, Р.П. Алейников2, В.И. Кузубов2, Г.В. Кочнева1
1 ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, пос. Кольцово, Новосибирская область
2 ФГУЗ «МСЧ № 163» Федерального медико-биологического агентства России, пос. Кольцово, Новосибирская область
Введение
В Российской Федерации в последние годы отмечается тенденция к постепенному снижению заболеваемости острым вирусным гепатитом В (ВГВ): с 35,3 случая на 100 тыс. населения в 2001 году до 7,0 в 2006 и 5,26 в 2007 году [3, 9].
Снижение заболеваемости острым ВГВ -результат проводимой в стране организационной и профилактической деятельности, особенно активизации работы по плановой иммунизации населения против гепатита В, которая началась в России в 1996 году.
Наибольшее распространение получили генноинженерные вакцины, созданные на основе продукции рекомбинантного HBsAg в клетках дрожжей: вакцина гепатита В рекомбинантная дрожжевая жидкая (НПК «Комбиотех Лтд.», Москва), Эндже-рикс В («СмитКляйн Бичем», Бельгия; ООО «Смит-Кляйн Бичем-Биомед», Бельгия-Россия), Engerix B (SmithKline Beecham Biologicals), Бубо-М («Комбиотех Лтд.», Москва; НПО «Биомед», г. Пермь), вакцина против ГВ ДНК-рекомбинантная (ФГУП «НПО «Микроген»; филиал НПО «Вирион», г. Томск), Эбер-биовак HB («Эбер Биотек», Куба; НПО «Вирион», Россия), рекомбинантная H-B-Vax II («Мерк Шарп и Доум», США) и Эувакс В (LG Chem LTD, Корея) [6]. В настоящее время в нашей стране применяется также вакцина Шанвак-В («ШантаБиотекникс», Индия), представляющая собой аналог вакцины Энджерикс В.
Наиболее оптимальной схемой иммунизации считается трехкратное введение вакцины по схеме: 0 - 1 - 6 месяцев [25]. Полный курс вакцинации обеспечивает защиту более чем у 95% привитых [5, 8].
Эффективность вакцинации до настоящего времени определяется путем измерения концентрации анти-HBs в сыворотке крови. Принято считать, что иммунокомпетентные лица, у которых концентрация анти-HBs после вакцинации достигает 10 ME/л и более, имеют защиту и против острого заболевания, и против хронической инфекции [13]. Однако в течение 5 - 7 лет после полного курса прививок от 30 до 50% привитых утрачивают антитела и в последующие 9 - 11 лет
их число достигает 60% [1, 25]. Оценить состояние иммунитета и необходимость ревакцинации для таких людей чрезвычайно трудно. При этом рекомендации большинства отечественных авторов и представителей практического здравоохранения основываются на наличии протективного уровня анти-HBs. При индивидуальном подходе поводом для ревакцинации служит снижение анти-HBs до уровня менее 10 МЕ/л. Если говорить о проведении коллективной ревакцинации, то, вероятно, в качестве количественного «порогового» критерия можно принять отсутствие протективного значения титра антител (меньше 10 МЕ/л) у 25 - 30% вакцинированных [1]. Вместе с тем установлено, что вакцинация ведет к индукции эффективной и продолжительной иммунологической памяти, которая обеспечивает защиту от инфекции и после утраты антител. Наличие HBsAg-специфической памяти после вакцинации против гепатита В на популяционном уровне подтверждается рядом эпидемиологических исследований, показывающих отсутствие заболеваний у вакцинированных групп и появление высоких титров анти-HBs после ревакцинации [17, 24, 25]. По заключению некоторых исследователей, иммунологическая память может обеспечивать защиту организма от вируса гепатита В до 10 - 12 и даже 18 лет [24, 25]. Однако это утверждение относится только к тем вакцинированным, у которых эффективность иммунизации, то есть уровень анти-HBs, составила более 100 МЕ/л после основного курса [16]. Если концентрация анти-HBs после первичной вакцинации неизвестна или была < 100 МЕ/л [14], то для решения вопроса о ревакцинации необходим дополнительный критерий оценки защищенности от ВГВ. Им может стать исследование состояния клеточного иммунитета по HBsAg-специфической продукции у-интерферона (ИФН-у) лимфоцитами (мононукле-арами) с помощью реакции Elispot [21].
Известно, что CD4+ Т-лимфоциты при ВГВ-инфекции распознают главным образом HBsAg, который является протективно значимым - антитела к нему обладают вируснейтрализующими свойствами и способствуют элиминации вируса из организма [7].
— 40
epid Б (42).indd 40 Ф 10/17/08 1:55:23 PM
Целью данной работы является оценка напряженности гуморального иммунитета и состояния клеточного иммунитета методом Elispot через пять лет после полного курса вакцинации против гепатита В.
Материалы и методы
Группы вакцинированных. К обследованию были привлечены сотрудники ФГУН «ГНЦ ВБ «Вектор» (Новосибирская область, пос. Кольцово), иммунизированные: вакциной Engerix (полный курс вакцинации - три инъекции) в 2002 году -58 человек; вакциной Шанвак-В (две инъекции) в 2007 году - 7 человек; вакциной Engerix (полный курс) в 2002 году и вакциной Шанвак-В (одна инъекция) в 2007 году - 4 человека. Также были обследованы медицинские работники (21 человек) из онкологического отделения городской больницы и муниципального роддома (г. Новосибирск), иммунизированные полным курсом вакцины Engerix в 2002 году. Контрольную группу составили пять человек, не получавшие вакцины против гепатита В и не имеющие серологических маркеров этой инфекции.
Проведение данной работы было одобрено этическим комитетом ФГУН «ГНЦ ВБ «Вектор». Исследование проводили с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан (Указ Президента РФ от 24.12.1993 г. № 2288, федеральные законы от 2.03.1998 г. № 30-ФЗ и от 20.12.1999 г. № 214-ФЗ). Опрос и взятие образцов крови проводили только после получения письменного информированного согласия [10].
Сбор образцов и получение мононуклеа-ров периферической крови. Образцы цельной крови собирали в пробирки Vacutainer, содержащие К3-ЭДТА (BD Biosciences, Сан-Диего, США). Из крови методом градиентного центрифугирования с применением Histopaque-1077 (Sigma diagnostics, США) выделяли мононуклеарные клетки для использования в реакции Elispot с целью определения HBsAg-специфической продукции ИФН-у моно-нуклеарами. Полученные мононуклеары дважды отмывали, ресуспендировали в среде культивирования (среда RPMI 1640, 2 мМ L-глютамина, ген-тамицин 80 мг/л, 10% эмбриональной сыворотки), их концентрацию доводили до 5 х 105 клеток/мл и использовали в реакции. Определение серологических маркеров ВГВ в плазме крови проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА).
Иммуноферментный анализ. Серологические маркеры ВГВ (HBsAg, анти-HBcor) определяли методом ИФА с использованием коммерческих тест-систем ЗАО «Вектор-Бест»: «Вектогеп В-HBs-антиген», «ВектоHBcorAg-антитела». Концентрацию анти-HBs определяли с помощью тест-системы «ВектоHBsAg-антитела» того же производителя.
Протективным считали уровень анти-HBs > 10 МЕ/л [16, 19]. Этот критерий определен Приказом Мин-здравмедпрома и Госкомэпиднадзора России от 3.06.1996/21.05.1996 г. № 226/79 «О введении профилактических прививок против гепатита B».
Elispot. Elispot-анализ проводили с использованием набора IFN-y BD™ Elispot Set (BD Biosciences, San Diego, США) в соответствии с инструкцией производителя. При постановке реакции Elispot на первом этапе осуществляли сорбцию анти-ИФН-Y-моноклональных антител с концентрацией 5 мкг/мл в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (pH 7,2) на лунку 96-луночного планшета BD™ Elispot. После инкубации в течение 12 часов при 4 °С каждую лунку дважды промывали блокирующим раствором (фосфатносолевой буфер pH 7,2, содержащий 10%-ную фетальную бычью сыворотку) и инкубировали с этим раствором в течение 2-х часов при 25 °С.
В качестве клеток-эффекторов использовали мононуклеарные лимфоциты периферической крови в концентрации 5 х 105 клеток/мл. В качестве специфического антигена использовали природный HBsAg («Внутрилабораторный контроль HBsAg» ЗАО «Вектор-Бест», пос. Кольцово), в качестве неспецифического индуктора пролиферации - фитогемагглютинин (ФГА, Sigma, США) в концентрации 5 мкг/мл 100 мкл на лунку. Мононуклеарные лимфоциты в количестве 100 мкл на лунку вносили в подготовленный планшет и культивировали в присутствии 5% СО2 при 37 °С в течение 18 часов. ИФН^-секретирующие клетки визуализировали, используя инкубацию в течение 2-х часов при 25 °С с биотинилированными анти-ИФН^-антителами (2 мкг/мл) в 100 мкл блокирующего раствора, с последующей инкубацией в течение часа при 25 °С с 0,25 мкг/мл конъюгата Avidin-HRP в 100 мкл блокирующего раствора. Внесение каждого компонента проводили с последующей трех- и пятикратной отмывкой фосфатно-солевым буфером с 0,05% Tween-20. Окрашивание производили, используя субстрат для пероксидазы из набора BD™ AEC Substrate Reagent Set (BD Biosciences, Сан-Диего, США). Реакцию останавливали удалением реагентов и трехкратным промыванием лунок дистиллированной водой.
Регистрацию и обработку результатов реакции Elispot проводили на AxioCam, Stemi 2000C с помощью программы AxioVision Rel. 4.5 «Carl Zeiss» (Германия). Определяли отношение спотов (ИФН^-продуцирующих клеток) в экспериментальной (стимулированной специфическим антигеном) лунке к количеству спотов в контрольной (нести-мулированной) лунке. Кратность превышения была обозначена как индекс специфической стимуляции мононуклеаров. Реакцию считали положительной, если наблюдался ответ на митоген, индекс специфической стимуляции был больше 2-х и регистрировалось более 20-ти спот-формирующих единиц на 106 мононуклеаров. Такое превышение расце-
41
epid 5 (42).indd 41 Ф 10/17/08 1:55:23 PM
со
о
о
нивается многими исследователями как значимый ответ на специфическую стимуляцию [18, 22].
Статистическая обработка. Индекс специфической стимуляции мононуклеаров и частота встречаемости определенного показателя в группе обследованных лиц были представлены в процентах с усредненными отклонениями. Статистическую обработку результатов проводили по таблицам Генеса, различия считали достоверными при p < 0,05 [2].
Результаты и обсуждение
Результаты анализа образцов крови вакцинированных сотрудников ГНЦ ВБ «Вектор», прошедших в 2002 году полный курс вакцинации Engerix, приведены в таблице 1. Из таблицы следует, что 13 человек из 58 имеют антитела к HBcorAg вируса гепатита В - 22 ± 5%. Определить, существовали ли эти антитела до вакцинации или были индуцированы после, не представляется возможным, так как обследование на маркеры ВГВ до вакцинации не проводилось. Если предположить, что анти-HBcor регистрировались и до вакцинации, то при наличии достаточного уровня анти-HBs (> 10 МЕ/л) и отсутствии HBsAg 22 ± 5% данной выборки могли бы не подвергаться вакцинации как имеющие естественный иммунитет вследствие бессимптомной инфекции ВГВ (в анкете эти сотрудники указали, что ранее вирусным гепатитом не болели). Антитела к HBcorAg ВГВ могли появиться вследствие контакта с вирусом гепатита В и после вакцинации. В данном случае о результатах реализации защитных поствакцинальных механизмов можно судить только после исключения факта развития хронического гепатита В. По данным A.D. Jack с соавт., при эффективной вакцинации появление анти-HBcor вследствие контакта с вирусом ВГВ является временным без сохранения источника HBcorAg в печени [16]. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости проведения обследования на наличие маркеров ВГВ перед вакцинацией. После иммунизации вакцинированного также необходимо обследовать - с целью определения эффек-
тивности вакцинации (уровень анти-HBs). Данные такого обследования позволят не только правильно провести текущую вакцинацию (при отсутствии ответа назначить дополнительную иммунизацию), но и в последующем решать вопрос о необходимости ревакцинации.
Для определения состояния поствакцинально-го иммунитета мы учитывали уровень анти-HBs и индекс специфической стимуляции мононуклеаров только у людей, не имеющих анти-НВсог (45 человек). В этой группе вакцинированных анти-HBs в концентрации > 10 МЕ/л были выявлены у 27 человек, то есть эффективность иммунизации вакциной Engerix (наличие протективного уровня анти-HBs) в уазанной группе через пять лет составила 60 ± 8%, что является достаточно низким показателем по сравнению с данными других авторов [5, 23]. Близкий к выявленному нами показатель был получен сотрудниками ЦГСЭН г. Липецка в группе воспитанников закрытых учреждений со сроком постиммунизации 3 - 5 лет - 59,2% [11]. Нужно отметить, что 16 человек из 45 имели уровень анти-НВв > 100 МЕ/л - 35 ±7% вакцинированных имели достаточно высокий уровень защиты.
При анализе данных по уровню анти-НВв и индексу специфической стимуляции мононуклеа-ров было установлено, что только у 13 человек (48 ± 10%) (см. рис. 1, сектор Б) из 27 вакцинированных (см. рис. 1, секторы Б и Г), имеющих протек-тивный уровень анти-HBs (> 10 МЕ/л), присутствует клеточная составляющая иммунитета (индекс стимуляции - 2 и более).
В группе, где концентрация защитных антител была ниже протективного уровня (см. рис. 1, секторы А и В), положительный индекс стимуляции мононуклеаров определялся в 72 ± 11% случаев (см. рис. 1, сектор А), что достоверно выше (р < 0,05), чем в группе с протективным уровнем анти-HBs (см. рис.
1, сектор Б). Это согласуется с данными о том, что иммунологическая память формируется независимо от уровня сывороточных анти-HBs, так как обусловлена в основном Т-клеточным звеном иммунитета [7, 17]. К тому же оказалось, что в группе с уровнем анти-HBs более 100 МЕ/л положитель-
Таблица 1.
Выявление показателей гуморального и клеточного иммунитета у сотрудников ФГУН «ГНЦ ВБ «Вектор» через пять лет после полного курса иммунизации вакциной Engerix (2002 г.)
Наличие анти- HBcor (+/-) Всего обследовано (n) Доля вакцинированных лиц с разным уровнем анти-HBs Доля вакцинированных лиц, имеющих положительный индекс стимуляции, П (%)
конц. анти-HBs n (%)
+ 1З > 10 МЕ/л 10 (77 ± 12) 6 (60±16)
< 10 МЕ/л З (23 ± 12) 3 (100 ± 33)
_ 45 > 10 МЕ/л 27 (60 ± 8) 13 (48 ± 10)
< 10 МЕ/л 18 (40 ± 8) 13 (72± 11)
> 100 МЕ/л 16 (35±7) 7 (43 ± 13)
42
epid Б (42).indd 42 Ф 10/17/08 1:55:23 PM
Рисунок 1.
Соотношение показателей клеточного (индекс специфической стимуляции мононуклеаров) и гуморального (уровень анти-HBs) иммунного ответа у вакцинированных сотрудников ФГУН «ГНЦ ВБ «Вектор»
(Сектор А: концентрация анти-HBs < 10 МЕ/л, индекс стимуляции мононуклеаров - 2 и более; сектор Б: концентрация анти-HBs > 10 МЕ/л, индекс стимуляции мононуклеаров - 2 и более; сектор В: концентрация анти-HBs < 10 МЕ/л, индекс стимуляции мононуклеаров - 2 и менее; сектор Г: концентрация анти-HBs > 10 МЕ/л, индекс стимуляции мононуклеаров -2 и менее)
0,1
А СР і ° } О о° 4 Б • . !>0О б5 ° Со °
В сУ о О Г У ^ <5 ооо о о о о о о
0,1
1000 10000 100000
ный индекс стимуляции мононуклеаров имеют меньше половины вакцинированных: 7 человек из 16 (43 ± 13%), а в группе с уровнем анти-HBs 10 - 100 МЕ/л - больше половины вакцинированных: 6 человек из 11 (55 ± 16%). В данном случае прослеживается также некоторая тенденция выявления положительного индекса стимуляции мононуклеаров у людей с более низким содержанием анти-НВв. Возможным объяснением полученных данных является сбалансированность иммунного ответа на уровне каждого конкретного организма: в случае доминирования цитокинсе-креторной активности Т-хелперов 1-го типа происходит снижение активности Т-хелперов 2-го типа, которые регулируют стимуляцию гуморального иммунитета [12].
Таким образом, оказалось, что через пять лет из группы вакцинированных, не имеющих HBsAg и анти-НВсог, 27 (60 ± 8%) человек сохраняют протективный уровень анти-HBs, 26 (58 ± 8%) человек - положительный индекс стимуляции мононуклеаров (2 и более) и оба положительных ответа имеют 13 (29 ± 7%) человек. В целом из 45-ти вакцинированных пять лет назад 40 человек имеют хотя бы один положительный показатель протективности, что составляет 89 ± 5% и существенно превышает уровень оценки, сделанной только на основе количества анти-HBs (60 ± 8%).
Полученные результаты позволяют заключить, что определение Т-клеточного ответа на специфическую стимуляцию HBsAg с помощью метода Elispot вносит определенный вклад в оценку состояния поствакцинального иммунитета в отдаленные сроки после вакцинации, но в то же время представляется недостаточно чувствительным (58 ± 8%) при самостоятельном использовании. Последнее можно объяснить применением для специфической стимуляции цельного HBsAg, в котором содержание В-клеточных эпитопов выше и они конфор-мационно экранируют Т-клеточные эпитопы [20]. Использование в качестве специфического антигена в реакции Elispot пептидов, соответствующих расчетным Т-клеточным эпитопам, может привести к увеличению чувствительности метода.
При анализе образцов, содержащих анти-НВсог (см. табл. 1), выявлена тенденция к увеличению количества образцов с протективным уровнем анти-HBs (77 ± 12%), что может быть обусловлено не только вакцинацией против ВГВ, но и перенесенной инфекцией. У трех человек, имеющих анти-НВсог, антитела к HBsAg регистрировались ниже протективного уровня - эти лица требуют усиленного наблюдения с целью исключения развития хронического гепатита В. Увеличение частоты установления положительного индекса стимуляции мононуклеаров в этой группе (шесть человек из десяти и три человека из трех) нельзя
Ф
43
еріи 5 (42).і^ 43 Ф 10/17/08 1:55:24 РМ
со
о
о
считать достоверным вследствие малой выборки образцов.
Анализ семи образцов крови сотрудников ФГУН «ГНЦ ВБ «Вектор», получивших неполный курс иммунизации (две инъекции) в 2007 году вакциной Шанвак-В («ШантаБиотекникс», Индия), представляющей собой аналог вакцины Энджерикс В, выявил протективный уровень анти-HBs у пяти человек (71%), причем у трех человек он превышал 300 МЕ/л. Это несколько ниже данных С.П. Лоба-стова с соавт.: эффективность применения вакцины Шанвак-В в его исследовании составила 96,1%, то есть была близка к показателям эффективности вакцины Engeгix [4, 5, 14]. Более низкая эффективность вакцинации объясняется, вероятнее всего, проведением двукратной иммунизации. Только у двух вакцинированных из этой группы протективный уровень анти-HBs сопровождался положительным индексом специфической стимуляции моно-нуклеаров. Привитые, у которых уровень анти-НВв был меньше 10 МЕ/л, имели количество отреагировавших клеток в реакции Elispot меньше 20 на 106 мононуклеаров, то есть индекс стимуляции в данном случае не определялся.
Обследование пациента, получившего полный курс иммунизации (три инъекции) вакциной Шанвак-В в 2007 году, показало уровень анти-HBs 330 МЕ/л и высокий индекс специфической стимуляции мононуклеаров - 8,5. Несмотря на незначительную выборку образцов крови людей, получивших недавно инъекции вакцины против ВГВ, данные этого исследования стали еще одним подтверждением того, что для адекватного ответа на иммунизацию против гепатита В генноинженерными вакцинами необходим полный курс вакцинации (три инъекции) [5, 8, 25].
Среди обследуемых лиц было четыре человека, получивших полный курс вакцинации препаратом Engeгix в 2002 году и одну инъекцию вакцины Шанвак-В в 2007 году. Во всех четырех образцах регистрировался высокий уровень анти-НВв (от 240 до 25 400 МЕ/л), однако положительный индекс стимуляции мононуклеаров был отмечен только у двух человек, причем у лиц, которые имеют наименьший титр анти-HBs. Эти результаты согласуются с вышеприведенной гипотезой о сба-
лансированности иммунного ответа и подтверждают имеющиеся в литературе данные, что введение бустерной инъекции вакцины вызывает существенное повышение уровня анти-HBs, но в то же время количество HBsAg-специфических лимфоцитов уменьшается [21].
Особое место в нашем исследовании занимает группа активно практикующих медицинских работников, имеющих ежедневный контакт с биологическими жидкостями больных. Были обследованы две группы медицинских работников: персонал онкологического отделения городской клинической больницы № 1 (ГКБ) и муниципального роддома № 2 (МРД) г. Новосибирска (табл. 2), получивших полный курс (три инъекции) вакцины Engeгix в 2002 году.
Всего обследован 21 человек, при этом у восьми (38 ± 11%) выявлены анти-НВсог. В данной группе привитых ситуация аналогична таковой в группе сотрудников ФГУН «ГНЦ ВБ «Вектор» -наличие маркеров ВГВ не определялось ни до, ни после вакцинации. Поэтому при обсуждении нами учитываются данные только лиц, не имеющих HBsAg и анти-НВсог (13 человек). Из них у 11 был протективный уровень анти-HBs (> 10 МЕ/л), что составило 85 ± 10%. При этом во всех 13 образцах определялся низкий индекс специфической стимуляции мононуклеаров (< 1).
Среди имеющих анти-НВсог только у трех из восьми (38 ± 18%) индекс специфической стимуляции был больше 2-х.
Интересные данные получены при анализе результатов реакции Elispot в виде числа спот-формирующих единиц (ИФН-у-продуцирующих клеток) в стимулированных специфическим антигеном лунках после вычета числа спот-формирующих единиц в нестимулированных лунках на 1 млн клеток для всех групп обследованных (рис. 2). На примере вакцинированных из ФГУН «ГНЦ ВБ «Вектор» (см. рис. 2, группа 1) показано, что при протективном уровне анти-НВв количество образцов с положительным числом спот-формирующих единиц в два раза больше количества образцов с отрицательным числом данных единиц, а при уровне анти-HBs ниже протективного количество образцов с поло-
Таблица 2.
Выявление показателей гуморального и клеточного иммунитета у сотрудников ГКБ и МРД, иммунизированных вакциной Engerix (полный курс, 2002 г.)
Наличие анти-НВсог (+/-) Всего обследовано (п) Доля вакцинированных лиц с разным уровнем анти-HBs Доля вакцинированных лиц, имеющих положительный индекс стимуляции, п (%)
конц. анти-HBs п (%)
+ 8 > 10 МЕ/л 7 (88 ± 12) 2 (28 ± 18)
< 10 МЕ/л 1 (12 ± 12) 1 (100)
- 13 > 10 МЕ/л 11 (85 ± 10) 0
< 10 МЕ/л 2 (15 ± 10) 0
— 44
ер1и 5 (42).1^ 44 Ф 10/17/08 1:55:24 РМ
Рисунок 2. Оценка специфического клеточного иммунного ответа у вакцинированных против гепатита В спустя пять лет (с использованием метода Elispot)
(1 - вакцинированные сотрудники «Вектора»; 2 - вакцинированные сотрудники ГКБ и МРД; 3 - невакцинированные лица. ◊ - лица с уровнем анти-HBs < 10 МЕ/л, □ - лица с уровнем анти-HBs от 10 до 100 МЕ/л,
Д - лица с уровнем анти-HBs > 100 МЕ/л, О - невакцинированные лица)
Ч -
Ф =°
^ я
Е? “
0 о
> £
1
2 ^ фот
0)
X
X
_0
I
I
л
со
о
а
§ I
Ё5 * * 0 § I
о
0
1
со
я
о.
8000
6000
4000
2000
0
-2000 -4000 -6000 -8000 -10000
&
А
_о—о—о—о—о—
Группы обследуемых лиц
жительным числом спот-формирующих единиц в восемь раз больше количества образцов с их отрицательным числом. При этом среднее количество спот-формирующих единиц в данной группе составило 915 на 1 млн мононуклеаров (при ранге 260 - 7890), что указывает на формирование коллективной защиты против гепатита В, как за счет Т-клеточного, так и за счет гуморального звена иммунной системы.
Однако при обследовании медицинских работников (см. рис. 2, группа 2) были получены неоднозначные данные: лишь у двух человек выявлен положительный ответ на специфическую стимуляцию, у 11 из 13 (85 ± 10%) наблюдалось высокое содержание клеток, спонтанно продуцирующих ИФН-у, превышающее количество клеток в лунках, стимулированных специфическим антигеном. При этом в ответ на стимуляцию митогеном супрессивного эффекта не наблюдалось. Ни у одного человека из этой группы индекс специфической стимуляции не превышал 2, а среднее количество спот-формирующих единиц в данной группе составило 2910 на 1 млн мононуклеаров (при ранге от -9510 до +1120). Данный феномен можно объяснить спецификой работы этих групп обследованных -массивная антигенная стимуляция при постоянном и длительном контакте врачей с кровью инфицированных пациентов. При этом персистирую-щие на клетках ретикулоэндотелиальной системы комплексы «антиген-антитело» стимулируют про-
лонгированную пролиферацию В-лимфоцитов и, следовательно, постоянную продукцию антител. Но постоянная и длительная наработка антител может приводить к истощению и ослаблению иммунной системы, что и сказывается на результатах исследования напряженности поствакцинального иммунитета. Кроме того, синтез иммуноглобулинов является саморегулирующимся процессом и их избыточная наработка приводит к ингибированию процессов иммунопоэза [15].
Полученные данные о высоком содержании клеток, спонтанно продуцирующих ИФН-у в культуре мононуклеаров периферической крови ранее иммунизированных лиц должны привлечь внимание к проблеме безопасности работы и контроля за состоянием здоровья медицинских работников из групп повышенного риска. Необходимость ревакцинации лиц, имеющих контакт с антигеном или инфекцией, остается под вопросом, и необходимо искать другие подходы для исследования и решения возникшей проблемы.
Результаты исследования напряженности гуморального и состояния клеточного иммунитета через пять лет после полного курса вакцинации против гепатита В показали, что кроме общепринятого критерия оценки эффективности вакцинации против гепатита В - уровня анти-HBs - при решении вопроса о ревакцинации необходимо учитывать и Т-клеточную составляющую иммунитета - определение HBsAg-специфической продукции ИФН-у
45
ер1и 5 (42).1^ 45 Ф 10/17/08 1:55:25 РМ
мононуклеарами методом Elispot. Совокупность этих данных позволит более адекватно оценить эффективность вакцинации и принять решение о ревакцинации. Из представленных данных следует, что положительный индекс специфической стимуляции мононуклеаров встречается чаще при низком уровне анти-HBs, это позволяет определить состояние иммунитета у вакцинированных со слабым гуморальным ответом и в отдаленный период, когда содержание анти-HBs становится ниже 10 МЕ/л.
Основываясь на полученных результатах и данных литературы, можно сформулировать следующий алгоритм вакцинации и ревакцинации против гепатита В:
1. Определение наличия маркеров гепатита В (Н^А^ анти-НВсог, анти-HBsAg) перед вакцинацией.
2. Определение уровня анти-HBs после полной вакцинации с целью выяснения ее эффективности, и если:
• уровень анти-HBs < 10 МЕ/л - провести оценку клеточного иммунитета (Elispot): при индексе стимуляции < 2 рекомендовать проведение дополнительной вакцинации;
• уровень анти-HBs > 10 МЕ/л - рекомендо-
вать скрининг на анти-HBs через пять лет и при снижении данного показателя ниже про-тективного (10 МЕ/л) определять состояние клеточного иммунитета для оценки необходимости ревакцинации. ш
Summary
Analysis of humoral immune response (ELISA for protective anti-HBs level) and cellular immune response (Elispot assay for HBsAg-specific stimulation of mononuclear cells) characteristics has been carried out among anti-HBV vaccinated individuals after 5 years of vaccination. Only 60% of vaccinated persons revealed anti-HBs protective level in ELISA. Efficiency of immunization of the group by used detection of level anti-HBs and method of detection of HBsAg-specific production IFN-y was 89%, i.e. higher, than efficiency of detected anti-HBs only. In the present investigated, positive index of specific stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) occurrence more often among adults, who had the level anti-HBs < 10 IU/L, therefore INF-y Elispot Assay can allow to determine the condition of long-term immune response of vaccinated individuals against HBV, when the level of anti-HBs become < 10 IU/L.
Литература
1. Акимкин В.Г. Серологический мониторинг и эпидемиологическая эффективность специфической иммунопрофилактики гепатита В медицинского персонала отечественной вакциной Комбиотех // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2004. № 2. С. 8 - 12.
2. Генес В.С. Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. - М.: Наука, 1976. - 208 с.
3. Здоровье населения и среда обитания. Информационный бюллетень. 2008. № 1 (178). С. 44.
4. Лобастов С.П., Шестов В.А., Варданян Н.В. и др. Оценка эффективности иммунизации вакциной против гепатита В «Шанвак-В» подростков до 19 лет // Биопрепараты. 2004. № 3. С. 22 - 24.
5. Патлусова В.В. Характеристика напряженности и стойкости поствак-цинального иммунитета и оценка эффективности массовой вакцинации против гепатита В в разных группах населения: Автореф. дис. ... к.м.н. - М., 2008. - 29 с.
6. Письмо министра здравоохранения Ю.Л. Шевченко председателю Комитета по охране здоровья и спорту ГД РФ Н.Ф. Герасименко от 28.12.2000 г. http://www.pгivivka.гu/info/bulletin/article.php.id=254).
7. Селиашвили Р.И., Балмасова И.П., Кабанова Е.Б. и др. Вирус гепатита В: биология, иммунопатогенез, система ЕК/ЕКТ при вирусной пер-систенции // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2006. № 6. С. 76 - 83.
8. Таточенко В.К., Ильина Н.И., Романенко В.В. и др. Результаты Российского многоцентрового исследования иммуногенности, реактоген-ности и безопасности новой рекомбинантной вакцины против гепатитов А и В (Твинрикс) // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2006. № 6. С. 30 - 35.
9. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика). - М.: ГОУ «ВУНМЦ МЗ РФ», 2003. С. 384.
10. Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф. и др. Частота встречаемости маркеров гепатита С и факторы риска у персонала больниц в Новосибирской области // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2002. № 2. С. 26 - 32.
11. Щукина И.А., Ходякова И.А., Хитрова Р.А. и др. Иммунологическая эффективность вакцинации медицинского персонала и детей закрытого учреждения против гепатита В вакциной «Энджерикс В» // Информационный бюллетень «Мир вирусных гепатитов». 2004. № 5. С. 11, 12.
12. Bertoletti A., D’Elios M.M., Boni C. et al. Different cytokine profiles of intraphepatic T cells in chronic hepatitis B and hepatitis C virus infections // Gastroenterology. 1997. № 112. P. 193 - 199.
13. CDC. A Comprehensive Immunization Strategy to Eliminate Transmission of Hepatitis B Virus Infection in the United States // MMWR 2006. № 55. N RR16:11.
14. Gellin B.G., Greenberg R.N., Hart R.H. et al. Immunogenicity of two doses of yeast recombinant hepatitis B vaccine in healthy older adults // J. Infect. Dis. 1997 Jun. № 175 (6). P. 1494 - 1497.
15. Igietseme J.U., Eko F.O., He Q. et al. Antibody regulation of T-cell immunity: implications for vaccine strategies against intracellular pathogens // Expert Review of Vaccines. 2004. V. 3. № 1. P. 23, 34 (12).
16. Jack A.D., Hall A.J., Maine N. et al. What level of hepatitis B antibody is protective? // The Journal of Infectious Diseases. 1999. № 179. P. 489 - 492.
17. Banatvala J., Van Damme P., Oehen S. Lifelong protection against hepatitis B: the role of vaccine immunogenicity in immune memory // Vaccine. 2000. V. 19. Issues 7 - 8. P. 877 - 885.
18. Currier J.R., Kuta E.G., Turk E. et al. A panel of MHC class I restricted
viral peptides for use as a quality control for vaccine trial ELISPOT assays // Journal of Immunological Methods. 2002. V. 260. Issues 1 - 2. P. 157 -172.
19. Hall A.J. Hepatitis B vaccination: protection for how long and against
what? // BMJ. 1993. № 307. P. 276, 277.
20. Honorati M.C., Facchini A. Immune response against HBsAg vaccine ISSN 1007-9327 CN 14-1219/R WJG. 1998. № 4 (6). P 464 - 466.
21. Bauer T., Jilg W. Hepatitis B surface antigen-specific T and B cell memory
in individuals who had lost protective antibodies after hepatitis B
vaccination // Vaccine. 2006. № 24. P. 572 - 577.
22. Mantegani P., Piana F., Codecasa L. et al. Comparison of an in-house and a commercial RD1-based ELISPOT-IFN-y assay for the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis // Infection Clinical Medicine & Research. 2006. V. 4. № 4. P. 266 - 272.
23. Van der Sande M.A., Waight P., Mendy M. et al. Long-term protection against carriage of hepatitis B virus after infant vaccination // J. Infect. Dis. 2006. № 1. 193 (11). P 1528 - 1535.
24. Viviani S., Jack A., Hall A.J. et al. Hepatitis B vaccination in infancy in The Gambia: protection against carriage at 9 years of age // Vaccine. 1999. № 6. 17 (23 - 24). P. 2946 - 2950.
25. Yuen M.F., Lim W.L., Chan A.O. et al. 18-year follow-up study of a prospective randomized trial of hepatitis B vaccination without booster doses in children // Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2004. № 2 (10). P. 941 - 945.
— 46
epid 5 (42).indd 46 10/17/08 1:55:25 PM
