CC BY
54
УДК 612.11: 612.014.43
ИЗУЧЕНИЕ ОТСТАВЛЕННОГО ВЛИЯНИЯ ГИПОТЕРМИИ НА ПАРАМЕТРЫ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА У КРЫС
Наталья Александровна ЛЫЧЕВА12, Игорь Ильич ШАХМАТОВ12, Валерий Иванович КИСЕЛЕВ12, Вячеслав Михайлович ВДОВИН12
1 ГБОУ ВПО Алтайский государственный медицинский университет Минздрава России 656038, г. Барнаул, пр. Ленина, 40
2 Алтайский филиал ФГБУ НИИ физиологии и фундаментальной медицины СО РАМН 656031, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 126
Целью работы явилось изучение отставленного влияния гипотермии на параметры системы гемостаза. Исследования выполнены на 20 крысах линии Wistar. Гипотермия моделировалась путем помещения животных в охлаждающую камеру при температуре воздуха -25 °С. Контролем служила кровь 10 животных, находящихся в камере при температуре 22 °С. У всех животных исследовались показатели тромбоцитарного, коагуляционного гемостаза, а также антикоагулянтная и фибринолитическая активность плазмы. Полученные результаты свидетельствуют о развитии состояния тромботической готовности, сопровождающегося развитием гиперкоагуля-ционного сдвига на фоне угнетения активности фибринолитической системы, у экспериментальных животных через 24 ч после прекращения опытного воздействия.
Ключевые слова: гемостаз, гипотермия, крысы.
Проблема действия гипотермии на организм актуальна и важна ввиду повреждающего действия холода на ткани и наличия большого количества осложнений. По данным ряда авторов, гипотермия, как правило, сопровождается локальным повреждением тканей организма (развитие холодовой травмы) [3]. К осложнениям холодовой травмы относятся тромбозы, некроз и ампутация поврежденной конечности. Для этого состояния характерно изменение числа тромбоцитов, снижение их агрегационной способности, а также развитие гиперкоагуляционных сдвигов, которые, по мнению ряда авторов [6-9], обусловлены повреждением эндотелия, сопровождающимся появлением в кровотоке большого количества тканевого фактора, а также повышением уровня эндотелина 1 и нитритов. Развитие тром-ботических осложнений у пострадавших наблюдается в первые 48 ч после гипотермического воздействия (ранний реактивный период холодовой травмы).
В то же время данные о состоянии системы гемостаза при общей гипотермии в литературе разнятся. Так, рядом авторов выявлено смещение гемостатического потенциала крови в сторону гипокоагуляции [11]. Наряду с этим существуют работы [9, 12], в которых показано развитие состояния тромботической готовности [3, 5, 7], переходящего в тромбозы, после выхода из гипотермии. Однако при этом выводы зачастую основываются лишь на базовых методиках исследования системы гемостаза.
В то же время основными маркерами состояния тромботической готовности являются свидетели активации свертывания крови и фибриноли-за (растворимые фибрин-мономерные комплексы и эуглобулиновый фибринолиз), маркеры активации тромбоцитов, интегральные показатели (параметры тромбоэластографии, время полимеризации фибрин-мономерных комплексов) [6].
Таким образом, целью нашей работы явилось изучение влияния гипотермии на вышеперечис-
Лычева Н.А. - преподаватель кафедры нормальной физиологии, младший научный сотрудник, e-mail kuzminan_86@mail.ru
Шахматов И.И. - д.м.н., доцент, проф. кафедры нормальной физиологии, старший научный сотрудник, e-mail: iish59@yandex.ru
Киселев В.И. - д.м.н., проф., член-кор. РАН, зав. кафедрой нормальной физиологии, зав. лабораторией, e-mail: vik@agmu.ru
Вдовин В.М. - к.м.н., доцент, доцент кафедры нормальной физиологии, старший научный сотрудник, e-mail: erytrab@mail.ru
ленные параметры системы гемостаза по истечении 24 ч после окончания холодового воздействия.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследования выполнены на 20 крысах линии Wistar. Гипотермию моделировали путем помещения животных, находящихся в индивидуальных клетках, в охлаждающую камеру при температуре воздуха -25 °С [2]. Критерием прекращения воздействия служило достижение экспериментальными животными ректальной температуры 30 °С. Время экспозиции было индивидуальным и в среднем составляло 6 ± 3 ч.
Контролем служила кровь 10 животных, полученная после того, как их в индивидуальных клетках помещали в камеру при температуре 22 °С. Время экспозиции соответствовало времени нахождения животных опытной группы в хо-лодовой камере, т. е. 6-9 ч.
Забор крови у животных обеих групп осуществлялся по истечении 24 ч после окончания экспериментального воздействия. Кровь для исследования в объеме 5 мл забирали из печеночного синуса в полистироловый шприц, содержащий 0,11 М (3,8 %) раствора цитрата натрия (соотношение крови и цитрата 9:1). До проведения эксперимента на протяжении недельной адаптации к условиям вивария все крысы находились в стандартных условиях содержания. Использование крыс в экспериментах осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по охране позвоночных животных, используемых в эксперименте, и Директивами - 86/609/ЕЕС.
Обезболивание и умерщвление животных проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».
У всех животных исследовали показатели тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза, а также антикоагулянтную и фибринолитиче-скую активность плазмы [3] с помощью наборов фирмы «Технология-Стандарт» (Россия). Индуцированную агрегацию тромбоцитов проводили по G.V.R. Born [10] на агрегометре «Биола», в качестве индуктора использовали раствор АДФ концентрацией 10 мкг/мл. Тромбоэластометрию выполняли на приборе «Rotem» с использованием диплосистем, реагентов и контрольных материалов, предлагаемых производителем оборудования («Pentapharm GmbH», Германия). Для проведения теста применяли реагент Natem, в состав которого входит хлорид кальция [1].
Сравнение полученных результатов осуществляли путем вычисления средних значений и ошибки среднего (М ± m). Статистический анализ выполнен с использованием непараметрических методов для сравнения непарных выборок (U-критерий Манна - Уитни). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При сравнении результатов, полученных в ходе эксперимента, мы проанализировали состояние гемостаза по прошествии суток (табл.). Через 24 ч после окончания холодового воздействия
Таблица
Коагулограмма крыс через 24 ч после гипотермического воздействия
Параметр Контроль (n = 10) Гипотермия (n = 10)
Количество тромбоцитов, 109/л 476 ± 7,7 422,6 ± 15,7*
Агрегация, отн. ед. 37,6 ± 3,8 45,6 ± 5,4
Содержание растворимых фибрин-мономерных комплексов, мг/100 мл 3,0 ± 0,0 26,6 ± 1,4*
Фибриноген, г/л 2,0 ± 0,1 4,2 ± 0,1*
Время полимеризации фибрин-мономера, г 2,0 ± 0,1 1,3 ± 0,04*
Антитромбин III, % 159,8 ± 15,0 92,6 ± 5,0*
Эуглобулиновый фибринолиз, мин 473 ± 31,4 Лизис сгустков не наступил
СТ (время коагуляции), с 275,4 ± 12,3 211,0 ±11,7*
CFT (время формирования сгустка), с 194,8 ± 23,6 57,5 ± 4,6*
а° 69,8 ± 3,5 76,1 ± 2,4*
MCF (максимальная твердость сгустка), мм 69,5 ±1,6 75,6 ± 2,2*
Примечание. * - отличие от величины соответствующего показателя в контроле статистически значимо прир < 0,05.
в сосудистом русле выявлено снижение количества тромбоцитов на 22 % (р < 0,05), агрегаци-онная способность кровяных телец относительно контроля не изменялась. Снижение числа тромбоцитов через 24 ч после окончания гипотерми-ческого воздействия в крови экспериментальных животных свидетельствует о возможном их потреблении сосудистой стенкой в ходе развития репаративных процессов, а также при процессах тромбообразования [8].
Анализ данных показал существенное (в 8,8 раза) увеличение концентрации в плазме крови растворимых фибрин-мономерных комплексов (р < 0,05), повышение в 2 раза концентрации фибриногена (р < 0,05) и уменьшение времени полимеризации фибрин-мономерных комплексов на 45 %, что в совокупности свидетельствует о развитии состояния тромботической готовности в сосудистом русле экспериментальных животных. Риск развития тромбоза существенно возрастал на фоне снижения активности антикоагулянтной системы (на 43 %, р < 0,05) и выраженного угнетения активности фибринолитической системы, что подтверждалось отсутствием по истечении 24 ч лизиса эуглобулиновых сгустков.
Разрушение мембран эндотелиальных клеток в ходе гипотермического воздействия и последующее попадание их в кровоток активирует процессы свертывания, что может приводить к тромбообразованию. Полученные в нашей работе результаты наглядно демонстрируют наличие гиперкоагуляционного сдвига, приводящего к повышению тромбогенности плазмы крови. Существенное увеличение содержания в плазме крови растворимых фибрин-мономерных комплексов и сокращение времени их полимеризации при существенном возрастании уровня фибриногена делает риск развития тромбоза в этот период весьма вероятным.
Наблюдаемый нами гиперкоагуляционный сдвиг согласуется с данными, полученными другими авторами [7, 9]. Так, при исследовании крови людей, получивших холодовые травмы различной степени тяжести, авторы отмечают развитие сосудистых катастроф (активизация процессов тромбообразования, состоявшиеся тромбозы и формирование участков некроза [6]) именно в этот период.
Выявленный нами риск развития тромбоза при оценке системы гемокоагуляции возрастает в еще большей степени в связи с обнаруженным в ходе экспериментов снижением концентрации антитромбина III, а также выраженным угнетением активности фибринолитической системы.
Кроме того, для подтверждения наличия у лабораторных животных признаков внутрисосуди-
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 __
1 1 ^ / I / 1 1 1 1 1
; 1 1 1 1
\ 1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2013-08-21 06:50 2: kkpop vg 4
СТ: 318 s а: 71° CFT: 96 s
MCF: 61 mm ML:*0% A10: 52 mm
Рис. 1. Тромбоэластограмма контрольного животного. Здесь и на рис. 2 СТ - время коагуляции, с; а° - кинетика образования твердого сгустка; С¥Т - время формирования сгустка, с; МСЕ -максимальная твердость сгустка, мм
l l l 1 1 1
l 1 1
/ i / I / i I 1 1 1 1 1 1
/ 1 1 1 1
\ i I 1 1
1 ЖШ 1 1 1 1
1
l 1 1 1 1 1
2013-02-20 07:14 2: 5 cherez cutki
CT: 184 s а: 82° CFT: 44 s
MCF: 76 mm ML: * 1 % A10: 73 mm
Рис. 2. Тромбоэластограмма опытного животного
стого свертывания крови мы использовали метод тромбоэластографии. Данный способ применяется для визуализации процесса образования тромба и имеет большую наглядность. Кроме того, при постановке методики используется цельная кровь, что позволяет оценить вклад всех компонентов системы крови в формирование сгустка. В качестве примера представлены тромбоэласто-граммы, полученные у животных из контрольной (рис. 1) и опытной (рис. 2) групп.
Из приведенных в таблице суммарных показателей тромбоэластографии видно, что время сгущения (СТ), отражающее скорость образования фибрина, было существенно (на 25 %) укорочено в образцах крови, полученных от опытной группы животных (р < 0,05). Уменьшение величины данного параметра говорит о гиперкоагуляцион-ном сдвиге. Также при записи кривых реакций мы наблюдали уменьшение времени формиро-
вания сгустка (СБТ) в 3,3 раза (р < 0,05) и увеличение угла а. Эти показатели характеризуют кинетику образования твердого сгустка, влияние на которую оказывает уровень фибриногена, его производных и скорость их полимеризации. Наблюдаемые изменения также свидетельствовали о развитии гиперкоагуляционного сдвига. Показатель МСБ на тромбоэластограмме характеризует максимальную твердость сгустка и зависит от концентрации фибриногена, а также его производных и активности фибринстабилизирующего фактора. На кривых, зарегистрированных у опытной группы животных, его величина превышала контрольные значения. Таким образом, выраженное угнетение лизиса эуглобулиновых сгустков, описанное у опытной группы животных, может быть обусловлено возросшей активностью фактора XIII, выявленной в ходе тромбоэластогра-фии [1, 12].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные результаты свидетельствуют о развитии состояния тромботической готовности у экспериментальных животных через 24 ч после прекращения гипотермического воздействия. Описанные изменения в очередной раз доказывают определяющую роль системы гемостаза в развитии осложнений гипотермии.
ВЫВОДЫ
Отставленное влияние гипотермии сопровождается выраженными изменениями в состоянии системы гемостаза.
Использованные методики оценки состояния системы гемостаза демонстрируют появление в кровотоке маркеров тромбинемии и развитие ги-перкоагуляционных сдвигов.
Комплекс зарегистрированных показателей подтверждает высокий риск развития тромботи-ческих осложнений в этот временной период, что необходимо учитывать при проведении лечебно-профилактических мероприятий среди лиц, подвергшихся общей гипотермии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Авдушкина Л.А., Вавилова Т.В. Зыбина Н.Н. Метод тромбоэластографии/тромбоэластометрии в оценке системы гемостаза: прошлое и настоящее. Референсные интервалы // Клинико-лабораторный консилиум. 2009. (5). 26-33.
2. Ананьев В.Н. Холодовая адаптация и адрено-рецепторы // Успехи соврем. естествознания. 2010. (6). 8-11.
3. Афанасьева Р.Ф., Бурмистрова О.В. Холодо-вой стресс, критерии оценки, прогнозирование риска охлаждения человека // Безопасность жизнедеятельности. 2006. (2). 16-20.
4. Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. М.: Ньюдиамед-АО, 2008. 292 с.
5. Сизоненко В.А., Михайличенко А.В., Шаповалов К.Г. Классификация и диагностика местной холодовой травмы // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. 2008. (3). 134-135.
6. Момот А.П. Современные методы распознавания состояния тромботической готовности. Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2011. 138 с.
7. Шаповалов К.Г., Томина Е.А., Витковс-кий Ю.А. и др. Повреждения клеток эндотелия и динамика цитокинов у больных в разные периоды местной холодовой травмы // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. 2006. (6). 126-128.
8. Шаповалов К.Г., Михайличенко А.В., Сизоненко В.А., Витковский Ю.А. Функциональное состояние тромбоцитов при местных холодовых поражениях // Казанский медицинский журнал. 2008. (5). 662-665.
9. Шаповалов К.Г., Сизоненко В.А., Томина Е.А., Витковский Ю.А. Эндотелиальная секреция вазо-активных молекул при холодовой травме конечностей // Травматол. ортопедия. 2008. (2). 53-56.
10. Born G.V.R. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal // Nature. 1962. 194. 927-929.
11. De Robertis E., Kozek-Langenecker S., Tufano R. et al. Coagulopathy induced by acidosis, hypothermia and hypocalcaemia in severe bleeding // Minerva Anestesiol. 2014. [Epub Ahead of Print].
12. Zhang J.N., Wood J., Bergeron A.L. et al. Effects of low temperature on shear-induced platelet aggregation and activation // J. Trauma. 2004. 57. (2). 216-23.
INVESTIGATION OF HYPOTHERMIA DELAYED INFLUENCE ON RATS HEMOSTATIC SYSTEM PARAMETERS
Natal'ya Aleksandrovna LYCHEVA12, Igor' Il'ich SHAKHMATOV12, Valeriy Ivanovich KISELEV12, Vyacheslav Mikhaylovich VDOVIN12
1 Altai State Medical University of Minzdrav of Russia 656038, Barnaul, Lenin str., 40
2 Altai Affiliation of Institute of Physiology and Fundamental Medicine of SB RAMS 656031, Barnaul, ul. Papanintsev, 126
The aim was to study the delayed effect of hypothermia on the parameters of hemostasis systems. The investigations were carried out on 20 (laboratory) rats. Hypothermia was simulated by placing the animals in a cooling camera at temperature of -25 °C. The blood of 10 rats placed in the camera at temperature of 22 °C served as a control. The rates of coagulatory and thrombocytic hemostasis as well as anticoagulative and fibrinolytic plasma activity were investigated in all the animals. The obtained results prove the development of activation of coagulation against the background of inhibition of the fibrinolytic system in experimental animals in 24 hours after interrupting of the exposure.
Key words: hemostasis, hypothermia, rats.
Lycheva N.A. - lecturer of department of normal physiology, junior researcher, e-mail kuzminan_86@mail.ru Shakhmatov I.I. - doctor of medical sciences, professor of the department of normal physiology, senior researcher, e-mail: iish59@yandex.ru
Kiselev V.I. - doctor of medical sciences, professor, corresponding member of RAMS, head of the department of normal physiology, chief researcher, e-mail: vik@agmu.ru
Vdovin V.M. - candidate of medical sciences, associate professor, associate professor of the department of normal physiology, senior researcher, e-mail: erytrab@mail.ru
