CC BY
674
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
УДК 579.017.8
03.00.00 Биологические науки
ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ПОДБОР ОПТИМАЛЬНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ
ДЛЯ LACTOBACILLUS SP.
Анискина Мария Владимировна Аспирант
РИНЦ SPIN-код 1255-4837
Волобуева Елена Сергеевна Аспирант
РИНЦ SPIN-код 7617-5411
Петенко Александр Иванович
д.с.-х.н.,профессор
РИНЦ SPIN-код 7870-5435
Волкова Светлана Андреевна канд. Биол. Наук, доцент РИНЦ SPIN-код 4482-3199 Кубанский государственный аграрный университет, Краснодар, Россия
Представлены материалы по изучению особенностей культивирования Lactobacillus sp. на различных средах. Проведено сравнение стандартных сред для культивирования Lactobacillus sp. и выявлена наиболее оптимальная среда
Ключевые слова: LACTOBACILLUS SP., ПРОБИОТИК, ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ, ТОМАТНЫЙ СОК
UDC 579.017.8 Biology
STUDYING THE FEATURES OF CULTIVATION AND OPTIMIZATION OF COMPOSITION CULTURE MEDIA FOR
LACTOBACILLUS SP.
Aniskina Mariya Vladimirovna Postgraduate student RSCI SPIN-code1255-4837
Volobueva Elena Sergeevna Postgraduate student RSCI SPIN-code 7617-5411
Petenko Alexander Ivanovich Dr.Sci.Agr., professor RSCI SPIN-code 7870-5435
Volkova Svetlana Andreevna Cand. Biol. Sci., assistant professor RSCI SPIN-code 4482-3199
Kuban State Agrarian University, Krasnodar, Russia
The article presents the materials of the study of the features of cultivation of Lactobacillus sp. on different culture medium. We have made a comparison of standard culture medium for cultivation Lactobacillus sp. and determined the most optimal culture medium
Keywords: LACTOBACILLUS SP., PROBIOTIC, CULTURE MEDIUM, CULTIVATION, TOMATO JUICE
Популярность антибиотиков и их бесконтрольное применение привело к появлению большого количества мутагенных форм микроорганизмов с неблагоприятными функциями и высокой лекарственной устойчивостью [2].
Вследствие этого появилась проблема поиска новых препаратов для поддержания здоровья людей и животных. Возникла необходимость в препаратах, не вызывающих лекарственной устойчивости, обладающих выраженным антимикробным действием в том числе и в отношении к резистентным к антибиотикам штаммам микроорганизмов. Принципиальное решение проблемы известно давно. Оно заключается в
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/87.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
2
создании пробиотиков - препаратов на основе микроорганизмов, которые оказывают антагонистический эффект на патогенную микрофлору [1].
Впервые термин «пробиотики» (от греческого pro bios - для жизни) был употреблен в области животноводства, им обозначались микробиологические препараты, которые состояли из живых микроорганизмов и перорально применялись для воздействия на животных. В первую очередь в состав пробиотических продуктов входили именно лактобактерии (например, L acidophilus, L. casei), а также бифидобактерии (В. bifidum, В. longum), которые считаются
высокоэффективными пробиотическими микроорганизмами и являются составной частью нормальной микрофлоры кишечника.
Основным свойством молочнокислых бактерий, по которому их объединяют в отдельную обширную группу микроорганизмов, является способность образовывать в качестве главного продукта брожения молочную кислоту. Молочнокислые бактерии неподвижны, не образуют спор, положительно окрашиваются по Граму, не восстанавливают нитраты в нитриты. По форме клеток молочнокислые бактерии — палочки и кокки. Размеры их варьируют у отдельных видов [3].
Молочнокислые бактерии - это факультативные анаэробы. Также это - единственная группа микроорганизмов, которые лишены каталазы, но способны расти при этом в присутствии кислорода воздуха. Функцию каталазы выполняет фермент пероксидаза. Молочнокислые
микроорганизмы получают энергию только в процессе молочнокислого брожения, поскольку у них отсутствуют гемсодержащие ферменты. Молочнокислое брожение подразделяется на гомоферментативное и гетероферментативное. При гомоферментативном брожении основным метаболитом является молочная кислота; при гетероферментативном брожении кроме молочной кислоты образуются также диоксид углерода, этанол и уксусная кислота.
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/87.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
3
Температурный диапазон жизнедеятельности лактобактерий довольно широк: мезофильные виды растут при оптимальной температуре 25-32°С; минимальной температурой для них является 10°С. Для термофильных видов оптимальная температура роста колеблется в пределах 38-45°С, а минимальная - 20-22°С. Имеются сведения, что некоторые молочнокислые бактерии способны расти при температуре 3-5°С [4].
Молочнокислые бактерии относятся к наиболее сложным организмам, с точки зрения потребности в питательных веществах. Для своей жизнедеятельности они требуют наличия субстратов, являющихся источником энергии и веществ, необходимых им для построения бактериальной клетки (нуклеиновых кислот, полисахаридов, аминосахаров и т.п.) [4].
Наиболее важным источником энергии для молочнокислых бактерий являются моно- и дисахариды - глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза. Для нормального роста и развития молочнокислых бактерий, как правило, необходимы субстраты со сложными органическими формами азота - подобранными смесями аминокислот, ферментативными или кислотными гидролизатами белков - мяса, казеина, различных сортов муки.
Независимо от вида и штамма молочнокислых бактерий, большинству из них также необходимы аргинин, цистеин, глутаминовая кислота, лейцин, фенилаланин, триптофан, тирозин, валин.
Большинство видов молочнокислых бактерий (особенно
палочковидных) остро нуждаются для своего развития в витаминах, чем и объясняется в значительной мере влияние на их рост добавок к средам различных растительных экстрактов (картофеля, моркови, кукурузы и т.
д.), дрожжевого автолизата и других соединений.
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/87.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
4
Для обеспечения роста и развития молочнокислые бактерии нуждаются в ряде неорганических соединений - меди, железе, натрии, калии, фосфоре, йоде, сере, магнии и, особенно, марганце [3].
Таким образом для культивирования молочнокислых
микроорганизмов применяют следующие среды:
Обезжиренное молоко, которое получают сепарированием цельного молока или растворением сухого обезжиренного молока в теплой воде (100 г на 1 л).
Гидролизованное молоко. Обезжиренное молоко разводят
водопроводной водой (1 часть молока и 2 части воды), затем к 1 л разведенного молока, подогретого до 45°С, добавляют 1 г сухого порошка панкреатина или 5 г поджелудочной железы, измельченной на мясорубке. Через несколько минут после внесения панкреатина к разведенному молоку добавляют 5 мл хлороформа.
Агар с мелом. Среду используют для выявления молочнокислых бактерий. К питательному агару добавляют мел, в количестве 2-3%, затем среду стерилизуют.
Среда Сабуро. Основой этой среды является дрожжевая вода. На 1 л водопроводной воды берут 20 г сухих дрожжей, кипятят 15 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют. К 100 мл стерильной дрожжевой воды добавляют 1% пептона, 4% глюкозы, 2% агара и стерилизуют.
Среда МРС. Представляет собой среду желтого вида, в плотном или жидком состоянии. Среды классифицируются по содержанию агара (от 0,075% до 10%). Используется для выделения ацидофильных и молочнокислых бактерий.
Молочный агар. Используется для определения протеолитической способности микробов. В пробирку с расплавленным стерильным
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/87.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
5
питательным агаром добавляют 1 - 2 мл стерильного обезжиренного молока, смешивают и разливают в чашки Петри.
Среда Эллингера. Используется для общего культивирования стрептококков и лактобацилл. Может быть как плотной, так и жидкой.
Trupticase yeast extract glucose medium. Многокомпонентная среда, в которую входят неорганические соединения, дрожжевой экстракт и гидролизат казеина.
Tomato juice agar. Жидкая среда для культивирования молочнокислых микроорганизмов. В состав входит томатный сок, дрожжевой экстракт и гидролизат казеина.
Исходя из вышесказанного следует, что изучение особенностей культивирования Lactobacillus sp. в качестве основы для создания пробиотических продуктов является актуальным.
Материал и методика. Исследования проводились на кафедре биотехнологии, биохимии и биофизики, факультета перерабатывающих технологий Кубанского Государственного Аграрного Университета.
В качестве объекта исследования выбран концентрат бактериальный лиофилизированный для ферментированных молочных продуктов Пх(л), предоставленный ФГУП «Экспериментальная биофабрика Россельхозакадемии», расположенная по адресу: Россия, город Углич, ул. Старостина, 18. Штамм хранился в музее чистых культур кафедры биотехнологии, биофизики и биохимии.
В таблице 1 представлена характеристика бактериального концентрата Пх(л).
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/87.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
6
Таблица 1 - Органолептические показатели сухого бактериального
концентрата
Показатель Характеристика
Цвет Серый, равномерный по всей массе.
Консистенция Порошкообразная.
Запах Чистый, кисломолочный.
Сгусток Плотный, без отслоения жидкости
Массовая доля влаги, % 4
Количество молочнокислых бактерий в 1 г. О ( -л О чс
Количество посторонних микроорганизмов в 1 г 1-2
Бактерии группы кишечной палочки в 1 г Отсутствуют
Титр определяли методом последовательных десятикратных разведений в физрастворе методом Коха и последующим посевом с инкубацией при оптимальных условиях. После проводился подсчет выросших колоний на Чашках Петри согласно ГОСТ 9225-84 (пункт 4.5.3).
Определение БГКП проводилось согласно методу определения бактерий группы кишечных палочек (ГОСТ 9225-84 (пункт 4.6.)).
Идентификация культивируемых микроорганизмов проводилась методом окраски по Граму, согласно ГОСТ 18963-73 (пункт 3.3.14.)
о
Общее количество микроорганизмов, которые содержатся в 1 см среды, определялось по формуле:
X = uX^ Dm
(1)
где n-количество колоний, визуально подсчитанных на чашке Петри m-число десятикратных разведений.
Обсуждение результатов. Для получения маточной (засевной) культуры Lactobacillus sp. сухой бактериальный концентрат Пх(л) вносился в свежее пастеризованное молоко с помощью прокаленной бактериальной петли. Культуру выращивали в термостате 24 часа при
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/87.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
7
температуре 30° С для проверки выживаемости микроорганизмов с помощью образования сгустка.
В стерильных условиях был сделан пересев в следующие среды:, Trupticase yeast extract glucose medium, Tomato juice agar и среду Эллингера, в количестве 2,5 мл закваски на 50 мл среды. Все среды стандартные и используются для культивирования молочнокислых микроорганизмов. Колбы с питательной средой и закваской ставились в термостат при 30 °С на 24 часа. Для подсчета количества колоний после инкубации использовали среду Lactobacillus Hetrofern Screen Agar, с температурой 40 °С, которой заливались разведения, приготовленные по методу Коха. Для посева использовались следующие разведения: 10-4, 10-7, 10-10. Культивирование микроорганизмов осуществлялось при 30°С.
Эксперимент проводился в 4-х кратной повторности. На рисунке 2 представлен вид колоний молочнокислых микроорганизмов на чашках Петри.
Рисунок 1 - Чашки Петри с выросшими колониями.
В таблице 2 представлены численные результаты эксперимента.
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/87.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
8
Таблица 2 - Количество колоний на плотной среде.
Название среды Разведение Количество колоний Результаты
Tomato Juice Agar 10-3 257 8,5x108
10-7 124
Ю10 85
Tripticase yeast extract glucose medium 10-3 195 6,5x108
10-7 69
Ю10 46
среда Эллингера 10-3 237 7,9x108
10-7 125
10-10 63
На рисунке 2 представлен график роста колоний молочнокислых
микроорганизмов на плотных средах.
Рисунок 2 - График роста колоний на плотных средах.
Из рисунка следует, что Tomato Juice Agar имеет более высокий титр
8 8 (8,5x10 ), по-сравнению с Tripticase yeast extract glucose medium (6,5x10 ) и
о
средой Эллингера (7,9x10 ).
Анализ на присутствие бактерий группы кишечных палочек проводился высевом 0,5 мл закваски в пробирку с поплавком, в которой уже находилась среда. Эксперимент проводился в двух повторностях. В
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/87.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
9
первой повторности образец засеивался в предварительно простерилизованную среду Кода, а во второй повторности образец засеивался в среду Кесслера. Обе эти среды используются для идентификации БГКП и являются стандартными средами. Пробирки с высеянными образцами ставились в термостат при температуре 37 °С на 18 часов. На рисунке 3 представлены пробирки со средой Кода (фиолетовая среда) и средой Кесслера (желтая среда).
Рисунок 3 - Пробирки со средой Кода и средой Кесслера По истечению срока анализировалось изменение среды и возможное образование пузырька углекислого газа, которое привело бы к всплытию поплавка. Поскольку ни в первой, ни во второй повторности не наблюдалось помутнение среды и образования пузырька углекислого газа, то был сделан вывод об отсутствии в закваске БГКП.
Анализ на контроль чистоты культуры проводился окраской по Граму и микроскопированием. Результаты микроскопирования представлены на рисунке 4.
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/87.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
10
Рисунок 4 - микроскопическая картина Lactobacillus sp..
Микроскопирование посторонних морфологических форм не выявило, что позволило судить о чистоте закваски.
Вывод. Наилучшей стандартной средой для культивирования Lactobacillus sp. является Tomato Juice Agar, поскольку на этой среде было отмечено максимальное количество выросших колоний. Было сделано предположение о стимулирующем влиянии томатного сока, как компонента питательной среды, вследствие большого количества содержащихся в нем микроэлементов и питательных веществ.
Литература
1. Бондаренко В. М. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией / В.М. Бондаренко, А. А. Воробьев // Микробиология. - 2004. - № 1. -С. 84-92.
2. Егоров Н. С. Что такое антибиотики / Н.С. Егоров - Основы учения об антибиотиках. - М.:МГУ - 2004. - с. 528
3. Квасников В. И. Молочнокислые бактерии и пути их использования. / В.И. Квасников, О.А. Нестеренко - М.: «Наука», 1975. - С. 57.
4. Красникова Л.В. Микробиология молока и молочных продуктов: Лабораторный
практикум: Учеб.-метод. пособие./Л.В. Красникова. П.И. Гунькова,
В.В. Маркелова - СПб.: НИУ ИТМО; ИХиБТ, 2013. - 130 с.
References
1. Bondarenko V. M. Disbiozi i preparati s probioticheskoi funkciei / V.M. Bondarenko, A.A Vorobev. // Mikrobiologiya. - 2004. - № 1. -S. 84-92.
2. Egorov N. S. Chto takoe antibiotiki / N.S. Egorov - Osnovi ucheniya ob antibiotikah. -M.: MGU - 2004. - S. 4.
3. Kvasnikov V. I. Molochnokislie bakterii i puti ih ispolzovaniya. / V.I. Kvasnikov,
O.A. Nesterenko -M.:-«Nauka»-1975.-S. 57.
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/87.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
11
4. Krasnikova L.V. Mikrobiologiya moloka i molochnih produktov: Laboratornii
praktikum - Ucheb. metod. posobie./L.V. Krasnikova., P.I. Gunkova, V.V. Markelova - NIU ITMO; IHiBT - 2013. - 130 s.
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/87.pdf
