CC BY
85
УДК 577.1:616.127-008.9
ИЗУЧЕНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В ТКАНИ СЕРДЦА КРЫС ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ДЕФИЦИТА ОКСИДА АЗОТА
Д.В. Медведев, В.И. Звягина
ГБОУ ВПО "Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова" Минздрава России
E-mail: meddmit@mail.ru
STUDY OF THE OXIDATIVE PROCESSES IN RAT HEART TISSUE IN NITRIC OXIDE DEFICIT MODELING
D.V. Medvedev, V.I. Zvyagina
Ryazan State Medical University
Цель исследования: изучение влияния снижения содержания метаболитов оксида азота под действием L-NG-нит-роаргинина метилового эфира (L-NAME) - неселективного ингибитора NO-синтазы - на активность сукцинатде-гидрогеназы и супероксиддисмутазы и скорость протекания процессов спонтанного окисления белков в сердце крыс. Показано, что L-NAME дозозависимо и с разной интенсивностью снижает уровень метаболитов оксида азота в сыворотке крови и сердце крыс (в сыворотке сильнее, чем в сердце). Ингибирование синтеза оксида азота под действием L-NAME приводит к дозозависимому уменьшению спонтанного окисления белков в сердце крыс, одной из причин которого, возможно, является изменение активности митохондриальных ферментов. Ключевые слова: оксид азота, L-NG-нитроаргинина метиловый эфир (L-NAME), окислительная модификация белков, супероксиддисмутаза, сукцинатдегидрогеназа, митохондрии.
The purpose of this study was to investigate the effects of decrease in the nitric oxide metabolite content, induced by a non-selective inhibitor of NO-synthase, L-NG-nitroarginine methyl ester (L-NAME), on the activity of succinate dehydrogenase and superoxide dismutase and on the rate of spontaneous protein oxidation in the rat heart. Data showed that the treatment with L-NAME dose-dependently decreased the level of nitric oxide metabolites in blood serum and, to a lesser degree, in the rat heart. Inhibition of nitric oxide synthesis by L-NAME caused a dose-dependent decrease in spontaneous protein oxidation in the rat heart due to, perhaps, the changes in the activity of mitochondrial enzymes. Key words: nitric oxide, L-NG-nitroarginine methyl ester (L-NAME), oxidative modification of proteins, superoxide dismutase, succinate dehydrogenase, mitochondria.
Введение
Оксид азота (NO) является вторичным мессенджером, аутокринным и паракринным регулятором. В настоящее время механизм действия и биологические эффекты оксида азота активно изучаются. Известно, что NO активирует гемсодержащий фермент - растворимую гуанилат-циклазу (ГЦ). В частности, в сердечной мышце крыс оксид азота может вызывать увеличение синтеза циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) гуанилатциклазой более чем в 23 раза [13]. Помимо этого он способен взаимодействовать с гемами других протеинов, тиолами, белками, углеводами, ионами металлов и т.д., локализованными в разных тканях и органах [3]. Столь высокая реакционная способность создает предпосылки для проявления оксидом азота разнообразных биологических эффектов.
Оксид азота синтезируется из аргинина NO-синтазой (NOS). Существуют 3 изоформы этого фермента: NO-син-таза 1-го типа (нейрональная, nNOS), NO-синтаза 2-го типа (индуцибельная, iNOS), NO-синтаза 3-го типа (эндотелиальная, eNOS). Нейрональная и эндотелиальная NOS - конститутивные формы NO-синтазы, т.е. их экспрессия постоянна. Их активация осуществляется ионами Са2+. В то же время NO-синтаза 2-го типа индуцируется
под влиянием воспалительных цитокинов, ее активация не зависит от ионов Са2+ [7]. Изоформы N08 в значительной степени гомологичны, причем для С-концевого домена гомология характерна не только для самих изоферментов, но и для цитохрома Р-450 [3].
Ряд патологических состояний, например, сердечнососудистые, инфекционные, воспалительные заболевания, тромбозы, злокачественные опухоли, заболевания мочеполовой системы, мозговые повреждения при инсультах и др. могут быть связаны с недостатком или гиперпродукцией оксида азота в организме [3]. Недостаток N0 играет важную роль в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний. Однако в большинстве случаев исследования ограничиваются изучением участия оксида азота в регуляции сосудистого тонуса. В то же время влияние снижения синтеза N0 на сердце, наблюдаемое при ряде патологических состояний, остается недостаточно изученным. Особенно это касается биохимических показателей самих клеток сердца.
Немаловажно изучение участия N0 в процессах пе-рекисного окисления липидов и белков. Одной из объективных методик оценки окислительной модификации белков (ОМБ) является спектрофотометрическое определение количества карбонильных групп и иминогрупп в белках по реакции образования динитрофенилгидра-
зонов. На сегодняшний день ОМБ признана одним из наиболее ранних и стабильных показателей поражения различных тканей организма при свободно-радикальной патологии [1].
Дыхательная цепь митохондрий является одним из главных источников активных форм кислорода (АФК) в клетках [6]. Особую роль генерация АФК этими органел-лами играет для клеток сердца, т.к. в кардиомиоцитах много митохондрий, и в них активно протекают процессы аэробного окисления, ведь окислительное фосфорили-рование - главный источник энергии для сердечной мышцы. Поэтому процессы свободно-радикального окисления в клетках сердца можно объяснять с позиций изменения активности митохондриальных оксидоредуктаз. С этой целью в данной статье рассматривается изменение активности супероксиддисмутазы (СОД) как одного из главных ферментов антиоксидантной защиты и сук-цинатдегидрогеназы (СДГ) как важного связующего звена в процессах аэробного окисления, а именно между циклом трикарбоновых кислот и дыхательной цепью митохондрий.
Цель: изучить влияние снижения содержания метаболитов оксида азота в сыворотке крови и митохондриях клеток сердца под действием Ь-№-нитроаргинина метилового эфира (L-NAME) - неселективного ингибитора NO-синтазы - на активность митохондриальных окси-доредуктаз (СОД и СДГ) и скорость протекания процессов спонтанного окисления белков в сердце.
Материал и методы
Исследование проводилось на 24 крысах-самцах линии Wistar, которые были разделены на три равные группы. Крысам первой (контрольной) группы (n=8) внутри-брюшинно вводился 0,9 %-й раствор хлорида натрия (NaCl) 1 раз в сутки в течение 7 дней, второй (n=8) -внутрибрюшинно вводился препарат L-NAME ^-№-нит-роаргинина метиловый эфир) - неселективный ингибитор NO-синтазы в виде 0,5%-го раствора 1 раз в сутки в течение 7 дней из расчета 25 мг препарата на 1 кг массы тела крысы, а третьей (n=8) - внутрибрюшинно вводился L-NAME в дозе 200 мг на 1 кг также 1 раз в сутки в течение 7 дней. Дозы L-NAME были выбраны в соответствии с литературными данными [11, 14]. Немедленно после забоя животных (на 8-й день эксперимента) брали кровь и сердце. Сыворотку крови использовали для определения содержания в ней метаболитов NO. Из ткани сердца получали гомогенат и выделяли из него митохондрии методом дифференциального центрифугирования [10]. Для оценки окислительной модификации белков использовали надосадочную жидкость, а осадок, содержащий митохондрии, ресуспендировали в 0,25 М растворе сахарозы с добавлением детергента Тритона Х-100 (для разрушения митохондриальных мембран) и далее использовали для определения активности митохондриальных ферментов: сДг и митохондриальной Mn-зависимой СОД, а также для измерения концентрации метаболитов NO в митохондриях.
Общее содержание белка в пробах определяли по методу Лоури с помощью стандартизированного набора
DiaSyS Diagnostic Systems. Окислительную модификацию белков оценивали по методу R.L. Levine [12] в модификации Е.Е. Дубининой [5], который основан на реакции взаимодействия карбонильных групп и иминогрупп окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенил-гидразином (2,4-ДНФГ) с образованием 2,4-динитрофе-нилгидразонов, обладающих специфическим спектром поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. При этом образуются альдегид-динитрофенил-гидразоны (А-ДНФГ) и кетон-динитрофенилгидразоны (К-ДНФГ). А-ДНФГ являются ранним маркером окислительной деструкции белков, а КДНФГ - поздним [4]. Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгид-разонов регистрировали на спектрофотометре СФ-2000 при длинах волн 254, 270, 280, 356, 363, 370, 430 и 530 нм.
Активность СДГ исследовали с помощью метода, основанного на определении восстановленного гексациа-ноферрата [10]. Активность СОД определяли при помощи метода В.А. Костюка [8].
Определение метаболитов NO (нитритов и нитратов) проводили в митохондриальной фракции гомогената сердечной мышцы и в сыворотке крови с помощью метода в модификации В.А. Метельской [9] на иммунофер-ментном анализаторе StatFax 3200.
Полученные в ходе исследования результаты обрабатывались с помощью программы Microsoft Excel, 2003. Для определения различий между независимыми группами (контрольной и получавшими L-NAME) использовали U-критерий Манна-Уитни. Уровень отличий рассматривался как статистически значимый при вероятности ошибки (p<0,05).
Результаты и обсуждение
Введение L-NAME статистически достоверно (p<0,01) приводит к дозозависимому снижению содержания метаболитов оксида азота как в сыворотке крови, так и в митохондриальной фракции гомогената сердца крыс (табл. 1).
Однако это снижение более выражено в сыворотке, чем в митохондриях. Это может быть обусловлено как особенностями распределения L-NAME в организме, так и некоторой селективностью его действия в отношении ингибирования разных изоферментов NOS. Так, L-NAME несколько сильнее ингибирует конститутивные формы NOS (nNOS, eNOS), чем индуцибельную [3]. Основным поставщиком NO для крови является eNOS эндотелия сосудов. В сердце присутствуют все 3 изоформы NО-син-таз: nNOS локализуется в саркоплазматическом ретику-луме и митохондриях клеток сердца, eNOS - в инвагинациях плазматической мембраны кардиомиоцитов (каве-олах), iNOS - в кардиомиоцитах вдоль сократительных волокон, в их плазматических мембранах, включая T-ту-булы, ядерную оболочку, митохондрии и комплекс Голь-джи, а также в макрофагах, фибробластах, эндотелиоци-тах коронарных сосудов и эндокарда, гладкомышечных клетках коронарных сосудов [2]. Причем iNOS экспрессируется в клетках сердца как при патологии, так и в норме. Учитывая, что активность iNOS в сотни раз выше, чем
Таблица 1
Концентрация метаболитов NO в сыворотке крови и митохондриях сердца, мкмоль/л (результаты представлены в форме: среднее значение±стандартное отклонение, M±s)
Крысы, получавшие Крысы, получавшие Крысы, получавшие
в/б 0,9%-й раствор NaCI в/б L-NAME в дозе 25 мг/кг в/б L-NAME в дозе 200 мг/кг
в течение 7 дней в течение 7 дней в течение 7 дней
Концентрация метаболитов
N0 в сыворотке крови, мкмоль/л 111,8+9,09 74,6+8,56** (133,28%) 31,7+12,88** (171,63%)
Концентрация метаболитов
N0 в митохондриях сердца, мкмоль/л 96,6+19,33 78,0+13,24** (119,2%) 52,8+13,81** (145,33%)
Примечание: ** - p<0,01 - по сравнению с контрольной группой.
Рис. 1. Изменение активности СДГ (нмоль сукцината/мин на г белка) в сердце под действием L-NAME в дозах 25 мг/кг и 200 мг/кг (р<0,05 - по сравнению с контрольной группой)
Рис. 2. Изменение активности СОД (оптическая плотность, у.е./ мг белка) в сердце под действием L-NAME в дозах 25 мг/кг и 200 мг/кг (р<0,05 - по сравнению с контрольной группой)
у конститутивных форм NO-синтазы, она, по-видимому, является главным продуцентом NO в кардиомиоцитах. Поэтому не столь значительное снижение содержания метаболитов NO в митохондриях клеток сердца по сравнению с сывороткой крови можно объяснить менее выраженным ингибированием iNOS под действием L-NAME.
Следует также отметить, что сам факт ингибирования синтеза NO в митохондриях сердца указывает на наличие в этом органе эстераз, обеспечивающих гидролиз L-NAME как сложного эфира до его активного метаболита L-NG-нитpoapгининa (L-NNA).
L-NAME вызывает значительное изменение активности митохондриальных ферментов, которые отражены на рисунках 1 и 2.
L-NAME повышает активность митохондриальной Mn-зависимой СОД, причем при введении ингибитора в дозе 25 мг/кг активность фермента повышается более чем в 4 раза, а в дозе 200 мг/кг - в 3,2 раза. Активность СДГ изменяется разнонаправленно: доза 25 мг/кг приводит к увеличению активности фермента на 80,39%, а доза 200 мг/кг - к ее снижению на 54,28%.
Повышение активности СДГ можно объяснить с позиций ингибирования оксидом азота ферментов цикла Кребса (аконитатгидратазы) и дыхательной цепи митохондрий (цитохром-с-оксидазы) [3]. Снижение синтеза NO под действием L-NAME в дозе 25 мг/кг, по-видимому, приводит к повышению скорости реакций цикла трикар-
боновых кислот и дыхательной цепи митохондрий из-за снижения ингибирующего действия оксида азота. Понижение активности СДГ в результате более выраженного ингибирования синтеза N0 после введения Ь^АМЕ в дозе 200 мг/кг может быть связано с нарушением коронарного кровотока и доставки к миокарду кислорода и, как следствие, с замедлением окислительных процессов в карди-омиоцитах. Повышение активности митохондриальной СОД под действием Ь-ММЕ в обеих дозах, возможно, также является следствием нарушения коронарного кровотока с последующей реперфузией. Ь-ММЕ является обратимым ингибитором N08, и вполне возможно, что при введении этого препарата 1 раз в сутки синтез N0 успевает частично восстановиться, а это, в свою очередь, приводит к временному восстановлению коронарного кровотока. Таким образом, можно предположить, что повышение активности митохондриальной СОД является механизмом адаптации к стрессу, и в данном случае это не следует рассматривать как однозначно положительное влияние Ь-ММЕ на состояние антиоксидантной системы. Кроме того, необходимо учитывать, что под действием СОД из супероксидного анион-радикала образуется перекись водорода [6], также являющаяся токсическим соединением, способным вызывать дисбаланс системы ан-тиоксидантной защиты.
Введение Ь-ММЕ в дозе 25 мг/кг не приводит к статистически значимому изменению содержания белка в
Таблица 2
Концентрация белка в гомогенате ткани сердца, лишенном митохондрий, мг/мл (М±s)
Крысы, получавшие Крысы, получавшие Крысы, получавшие
в/б 0,9%-й раствор №С1 в/б L-NAME 25 мг/кг в/б L-NAME 200 мг/кг
в течение 7 дней в течение 7 дней в течение 7 дней
Общий белок, мг/мл гомогената ткани сердца 4,5+1,12 3,9+1,71 (115%) 6,3+1,02* (Т39%)
Примечание: * - р<0,05 - по сравнению с контрольной группой.
120
100
80
ю
60
^ 40
а
=г
ш
20
■
■
■ ■ ■ /*-• ‘ "*г - * —■— Контроль
.-*=■ і ч ч »- \ нщЛ ■ ЬЫАМЕ 200
В "т / \ ч
V- - -»
254 270 280 356 363 370 430 530 нм нм нм нм нм нм нм нм
Длина волны, нм
Рис. 3. Показатели спонтанной ОМБ
сердце, а доза 200 мг/кг достоверно его увеличивает на 39% (табл. 2).
При этом речь, конечно, идет только о белках, растворимых в 0,25 М растворе сахарозы, т.е. о саркоплазмати-ческих белках. Как известно, повышение содержания в сердце этих белков обычно наблюдается при патологии этого органа.
Изучение окислительной модификации белков в без-митохондриальной фракции гомогената сердца крыс после ингибирования синтеза оксида азота под действием L-NAME в дозах 25 и 200 мг/кг дало результаты, представленные на рисунке 3.
Введение L-NAME в дозе 25 мг/кг достоверно (р<0,05
- по сравнению с контрольной группой) снижает показатели спонтанной ОМБ при длине волны 430 нм (соответствует основным альдегид-динитрофенилгидразонам (АДНФГ) и кетон-динитрофенилгидразонамов (КДНФГ)) в 49,5 раз. L-NAME же в дозе 200 мг/кг достоверно снижает значения спонтанной ОМБ при ^=356 нм (что соответствует нейтральным АДНФГ) на 38,2% (р<0,01 - по сравнению с контрольной группой), а при 363 нм (что соответствует нейтральным КДНФГ) - на 31,3% (р<0,05
- по сравнению с контрольной группой).
Исходя из полученных при изучении ОМБ данных, можно заключить, что влияние L-NAME на процессы окисления белков в клетках сердца сильно зависит от дозы. Введение препарата в количествах 25 и 200 мг/кг в течение 7 дней дозозависимо замедляет процессы спонтанного окисления белков, практически не влияя на соотношение альдегидных и кетоновых производных протеинов (т.к. почти не изменяется спектр поглощения).
Снижение спонтанного окисления белков в сердце
можно объяснить с разных позиций. Во-первых, такое изменение может быть связано со снижением концентрации метаболитов оксида азота; ведь N0 сам по сути является свободным радикалом (содержит неспаренный электрон), а при взаимодействии с супероксидным анион-радикалом (02'-) образует сильнейший окислитель -пероксинитрит ^N00") [6]. Во-вторых, снижение окисления белков в сердечной мышце можно объяснить, исходя из изменения активности митохондриальных ферментов. Так, L-NAME в обеих дозах (25 и 200 мг/кг) вызывает выраженное увеличение активности митохондриальной СОД, что неизбежно должно снижать в клетке концентрацию 02'-, а следовательно, и 0N00-. Более выраже2нное уменьшение скорости процессов спонтанного окисления белков при введении L-NAME в дозе 200 мг/кг, чем в дозе 25 мг/кг логично вытекает из изменения активности СДГ. Как уже отмечалось, дыхательная цепь митохондрий является важным источником генерации АФК в кардиомиоцитах. Ее активность непосредственно связана с активностью ферментов цикла трикарбоновых кислот, поставляющего доноры водорода для дыхательной цепи. Снижение активности СДГ под действием L-NAME в дозе 200 мг/кг должно приводить как к уменьшению скорости ферментативных реакций цикла Кребса, так и к ингибированию митохондриальной цепи переноса электронов. Результатом вышеперечисленного является замедление процессов свободнорадикального окисления в клетках сердца.
Выводы
L-NAME дозозависимо и с разной интенсивностью снижает уровень метаболитов оксида азота в сыворотке крови и сердце крыс (в сыворотке сильнее, чем в ткани сердца).
Ингибирование синтеза оксида азота под действием L-NAME приводит к дозозависимому уменьшению спонтанного окисления белков в сердце крыс, одной из причин которого, возможно, является изменение активности митохондриальных ферментов.
Литература
1. Абаленихина Ю.В. Фомина М.А., Чурилов Г.И. и др. Окислительная модификация белков тимуса крыс под влиянием меди в ультрадисперсной форме // Фундаментальные исследования. - 2012. - № 11. - С. 1315-1319.
2. Гарматина О.Ю., Ткаченко М.Н., Мойбенко А.А. Индуцибель-ная синтаза оксида азота при патологии сердца (обзор литературы и собственных исследований) // Теоретична медицина. - 2005. - Т. 11, N0. 4. - С. 645-660.
3. Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (N0). Новый путь к поиску лекарств: монография. - М. : Вузовская книга, 2004.
- 360 с.
4. Губский Ю.И., Беленичев И.Ф., Левицкий Е.Л. и др. Токсикологические последствия окислительной модификации белков при различных патологических состояниях (обзор литературы) // Современные проблемы токсикологии. -2005. - Т. 8, № 3. - С. 20-27.
5. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А. и др. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения // Вопросы мед. химии. - 1995. -Т. 41, № 1. - С. 24-26.
6. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клинико-биохимические аспекты. - СПб. : Медицинская пресса, 2006. - С. 276282.
7. Козловский В.И. Механизмы регуляции коронарного кровотока, опосредованной эндотелиальными сосудорасширяющими факторами: монография. - Гродно : ГрГМУ, 2011.
- 216 с.
8. Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева Ж.В. Простой и чувствительный метод определения активности супероксид-дисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина // Вопросы мед. химии. - 1990. - № 2. - С. 88-91.
9. Метельская В.А., Гуманова Н.Г. Скрининг-метод определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - № 6. - С. 1518.
10. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / под ред. М.И. Прохоровой. - Л. : Изд-во Ленинградского университета, 1982. - 327 с.
11. Покровский М.В., Покровская Т.Г., Корчаков В.И. и др. Эндо-телиопротекторные эффекты L-аргинина при моделировании дефицита окиси азота // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2008. - Т. 71, № 2. - С. 29-31.
12. Levine R.L., Garland D., Oliver C.N. et al. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins // Methods in enzymology. - 1990. - Vol. 186. - P. 464-478.
13. Murad F. Discovery of some of the biological effects of nitric oxide and its role in cell signaling // Bioscience reports. - 1999.
- Vol. 19, No. 3. - P 133-154.
14. Zun-Yi Wang, Hakanson Rolf. Role of nitric oxide (NO) in ocular inflammation // British J. of Pharmacology - 1995. - Vol. 116.
- P. 244-245.
Поступила 16.04.2013
Сведения об авторах
Медведев Дмитрий Валериевич, ассистент кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики факультета дополнительного последипломного образования ГБОУ ВПО “Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова” Минздрава России.
Адрес: 390026, г. Рязань, ул. Высоковольтная, 9.
E-mail: meddmit@mail.ru.
Звягина Валентина Ивановна, канд. биол. наук, доцент кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики факультета дополнительного последипломного образования ГБОУ ВПО “Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова” Минздрава России.
Адрес: 390026, г. Рязань, ул. Высоковольтная, 9.
E-mail: vizvyagina@yandex.ru.
