CC BY
40
Изучение нейропсихотропных свойств соединения с нейропротекторной активностью димерного дипептидного миметика 4-ой петли фактора роста нервов человека, l^^h
Котельникова С.О., Гарибова Т.Л., Гудашева Т.А., Крайнева В.А., Воронина Т.А.
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», г. Москва
Резюме. Димерный дипептидный миметик фактора роста нервов человека ГК-2И в дозах 0,1, 0,5, 1,0, 1,5 мг/кг, в/б обладает антиамнестическими свойствами на моделях амнезии условной реакции пассивного избегания, вызванной скополамином, максимальным электрошоком или кетамином, увеличивая у крыс латентное время при воспроизведении рефлекса. ГК-2И в дозах 1,0-1,5 мг/кг при различных режимах введения обладает противогипоксическим эффектом в условиях гипоксии с гиперкапнией в гермообъёме и слабым противосудорожным действием на модели судорог, вызванных максимальным электрошоком и не влияет на ориентировочно-исследовательское поведение животных в открытом поле.
Ключевые слова: димерный дипептидный миметик фактора роста нервов человека, антиамнестический и противогипоксиче-ский эффекты
Study of neuropsychotropic properties of substance with neuroprotective activity dimeric dipeptide mimethic
of human NGF, GK-2h
Kotelnikova S.O., Garibova T.L., Gudasheva T.A., Kraineva V.A., Voronina T.A.
FSBI «Zakusov Institute of Pharmacology», Moscow
Abstract. Dimeric dipeptide mimethic human nerve growth factor, bis-(N-monosuccinil-glycyl-lysine), GK-2h at doses 0,1, 0,5, 1,0, 1,5 mg/kg, i.p. has an antiamnesic effect on the models of scopolamine, maximal electroshock or ketamin induced passive avoidance response amnesia. GK-2h at doses 1,0-1,5 mg/ kg possess weak antihypoxic und anticonvulsive properties, it does not affect the exploratory behavior of animals in the test of open field.
Keywords: mimetic human NGF bis-(N-monosuccinil-glycyl-lysine), GK-2h, antiamnestic, antihypoxic effects
Автор, ответственный за переписку:
Гарибова Таисия Леоновна - ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», 125315, Москва, ул. Балтийская, д. 8; тел.: +79039616126; е-таИ: T_Garibova@mail.ru
Введение
Один из актуальных подходов к созданию препаратов с нейропсихотропной активностью базируется на современных представлениях о механизмах эндогенного регулирования функций нейронов и их регенерации. Среди известных эндогенных регуляторных белков особое внимание уделяется факторам роста нервной ткани, в частности, нейротрофинам и среди них фактору роста нервов (ФРН, nerve growth factor, NGF). ФРН участвует в росте, созревании и поддержании жизнедеятельности нейронов в центральной и периферической нервной системе как в норме, так и при патологии [1]. Известно вовлечение ФРН в патогенез болезней с нейродегенерацией, в частности, болезни Альцгеймера (БА), болезни Паркинсона (БП), инсультов и др. [2]. Показана эффективность ФРН в клинике у больных [3] и в экспериментальных исследованиях [4, 5]. Вместе с тем, терапевтическое использование самого ФРН ограничивается его нестабильностью
в биологических жидкостях, плохой способностью проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), возможностью иммунной реакции, наличием побочных эффектов за счёт его плейотропности. Актуальным подходом к регуляции системы факторов роста нервной ткани в ЦНС является создание (конструирование и синтез) низкомолекулярных миметиков факторов роста, взаимодействующих с соответствующими ти-розинкиназными рецепторами [6].
В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» в течение нескольких десятилетий проводятся исследования по созданию и изучению механизмов действия нейропсихотропных лекарственных препаратов, в частности, с нейропротекторной активностью. Была сформулирована оригинальная гипотеза о возможности конструирования фармакологически активных дипептидов на основе петлеобразных структур белков, определяющих рецепторное взаимодействие [7]. Определено, что фармакофорными участками нейротрофина являются их бета-изгибы
ЖШЩМШМ (»УШЩКШМИШ
(последовательность из четырёх аминокислотных остатков с бета-поворотной конформацией) и созданы дипептидные миметики факторов роста [8]. В опытах на животных выявлены нейропротекторные свойства дипептидного миметика 4-й петли фактора роста нервов крысы [9]. Другой низкомолекулярный димер-ный дипептидный миметик 4-й петли фактора роста нервов человека гексаметилендиамид бис-^-моно-сукцинил-глицил-лизина), TK-2h, в исследованиях проявил нейропротективные свойства как in vitro [10], так и на экспериментальных моделях БА и инсультов в опытах на крысах [11].
Целью исследования явилось изучение общего спектра фармакологической активности димерно-го дипептидного миметика фактора роста нервов человека гексаметилендиамида бис-^-моносукци-нил-глицил-лизина), ГК-2И, в опытах на животных. В задачи исследования входило изучение эффектов соединения, характерных для нейропсихотропных препаратов, а именно выявление антиамнестических свойств, противогипоксической, противосудорож-ной, антидепрессивной активности, оценка влияние соединения на двигательную активность и ориентировочно-исследовательское поведение животных.
Материалы и методы исследования
Исследование фармакологической активности соединений проводилось в опытах с использованием стандартных методов, применяемых для скрининга и изучения механизмов действия нейропсихотропных препаратов, согласно международным стандартам [12, 13]
Соединения. В исследовании были использованы: оригинальный димерный дипептидный миметик 4-ой петли ФРН человека — гексаметилендиамид бис-(М-моносукцинил-глицил-лизина) — ГК-2И, синтезированный в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»; блокатор мускаринового типа холинергических рецепторов — скополамин (Sigma); антагонист NMDA-рецепторов — кетамин (Sigma).
Животные. Эксперименты проводились на беспородных мышах-самцах, мышах инбредной линии C57BL/6 массой 20—23 г, беспородных крысах самцах, массой 180—200 г. Экспериментальные животные получены из питомника лабораторных животных «Столбовая», Московская область. Животные содержались в соответствии с правилами лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 351.000.3-96 и Р 51000.4-2011), приказу МЗ РФ № 708н от 23.08.2010 г.
Методы
Антиамнестическое действие соединения оценивали на модели амнезии УРПИ в установке Passive avoidance фирмы Lafayette Instrument Co (США). Регистрировали
латентное время захода животного в тёмную камеру при воспроизведении рефлекса через 24 ч после обучения (неизбегаемый удар током в тёмной камере установки в течение 10 с). Амнезию УРПИ у крыс вызывали максимальным электрошоком (МЭШ), проводимым после обучения через корниальные электроды (I = 43 мА, частота 50 Гц, продолжительность 0,3 с), скополамином (1,5 мг/кг) или кетамином (10,0 мг/кг), каждый из которых вводили внутрибрюш-инно (в/б) за 15 мин до обучения. TK-2h использовали в/б однократно или повторно за 40 мин до тестирования. Животные контрольных групп получали дистиллированную воду в эквивалентном объёме.
Противогипоксическое действие соединения оценивали в опытах на мышах на моделях гипоксии с гиперкапнией в гермообъёме, помещая животных в герметически закрываемые банки объёмом 200 см3. Регистрировали время гибели животных.
Для моделирования судорожньх состояний использовался тест МЭШ для мышей. С помощью прибора Rodent shocker Type 221 фирмы Harvard apparatus GmbH (Германия) через корнеальные электроды животное получало электрический стимул (10—12 mA, 250 V, длительностью 0,2 с), вызывающий у 40—50% контрольных мышей тоническую экстензию задних конечностей. Регистрировались подергивания (1 балл), клонические судороги (2 балла), тоническая экстензия (3 балла) и гибель мышей (4 балла).
Депрессивноподобное поведение вызывали у мышей с использованием теста вынужденного плавания по Порсолт [14] и теста подвешивания за хвост [15] в опытах на мышах.
Исследование ориентировочно-исследовательского поведения и двигательной активности у животных проводилось в открытом поле размером 60 х60 см с полом равномерно разделённым линиями на 9 квадратов с 16 отверстиями диаметром 4 см для крыс и размером 40 х40 см с полом разделенным линиями на 9 квадратов с 16 отверстиями диаметром 2 см для мышей. Регистрировалась вертикальная (число подъёмов на задние лапы) и горизонтальная (число пересечений линий квадратов) двигательная активность и количество заглядываний в отверстия.
Статистическую обработку результатов проводили с определением среднего значения и стандартной ошибки среднего значения, которые представлены в итоговых таблицах. Использовался пакет статистических программ Statistica 6.0 (StatSoft, USA). Различия определялись как статистически значимые при уровне p < 0,05. Для определения статистической значимости различий между группами использовали ранговый однофакторный анализ Kruskal—Wallis. Если различия были достоверны (p<0,05), проводилось попарное сравнение по непараметрическому критерию U Mann—Whitney, Стьюденту, а при анализе альтернативной формы учёта использовался точный метод Фишера (пакет программ Biostat).
юощшшш ^ммо^шмшм
Результаты и обсуждение
Изучение антиамнестических свойств ГК-2h на моделях амнезии УРПИ, показало, что МЭШ, скополамин в дозе 1,5 мг/кг или кетамин в дозе 10 мг/кг вызывали у крыс амнезию условной реакции пассивного избегания (УРПИ). Это характеризовалось по сравнению с контролем уменьшением латентного времени рефлекса при воспроизведении через 24 ч после обучения (рис. 1).
На модели амнезии УРПИ, вызванной МЭШ, показано, что ГК-2И в дозах 0,1; 0,3; 0,6; 1,0 и 2,0 мг/кг не оказывал влияния на формирование УРПИ, а в дозе 1,5 мг/кг ГК-2И существенно увеличивал латентное время при воспроизведении рефлекса (рис. 1). На модели амнезии УРПИ, вызванной скополамином, наиболее отчётливо эффект ГК-2h выявлялся при использовании соединения в дозах 0,5 и 1,0 мг/кг, в дозе 0,1 мг/кг наблюдалась тенденция увеличения латентного времени рефлекса. Вместе с тем, при повторном 5-дневном предварительном введении крысам ГК-2И в дозе 0,1 и 0,5 мг/кг регистрировался сильный антиамнестический эффект, характеризующийся полным восстановлением памятного следа. На модели амнезии УРПИ, вызванной кетамином, антиамнестический эффект ГК-2И выявлялся в дозе 1,0 мг/кг при 5-дневном введении (рис. 1).
Таким образом, ГК-2h в диапазоне доз от 0,1 до 1,5 мг/кг обладает антиамнестическими свойствами на моделях амнезии УРПИ, вызванной МЭШ, скополамином или кетамином.
Изучение противогипоксического действия ГК-2И осуществлялось на модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъёме. Противогипоксический эффект ГК-2h выявлен в дозе 1,0 мг/кг при 5-дневном введении в опытах на мышах линии С57В16 (табл. 1).
Исследование противосудорожных свойств ГК-2И на модели судорожных реакций, вызванных МЭШ, в опытах на мышах линии С57В16 показало, что в дозах 0,1, 0,5, 1,0 и 2,0 мг/кг соединение не способно предупреждать различные проявления судорожных реакций. Лишь в дозе 1,5 мг/кг отмечалось статистически достоверное ослабление судорожных реакций (табл. 2).
Изучение влияния вещества на депрессивноподобное поведение показало, что в тесте Порсолт в дозе 0,1 мг/ кг и в тесте подвешивания за хвост в дозах 0,1 и 1,0 мг/ кг ГК^ не оказывал влияния на поведение животных, а в дозе 1,0 мг/кг при предварительном 5-дневном введении у мышей наблюдалась тенденция уменьшения времени иммобилизации при плавании (табл. 3).
Изучение поведения животных в открытом поле. ГК-2h в дозах 0,1 и 1,0 мг/кг при субхроническом 3-дневном введении не оказывал влияния на ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность мышей в открытом поле (табл. 4).
Ранее было показано, что замещённый димерный дипептидный миметик 4-й петли фактора роста нервов человека ГК-2И, синтезированный как соединение, способное воспроизводить его эффекты, обладает нейропротекторными свойствами на моделях патологий, в механизме которых участвует ФРН. Показано, что в диапазоне доз от 0,1 до 1,0 мг/кг при
Рис. 1. Антиамнестический эффект ГК-2И на моделях амнезии УРПИ, вызванной максимальным электрошоком, скополамином или кетамином.
Примечание: 1 — пассивный контроль; 2 — активный контроль (МЭШ); 3 — ГК-2Й (0,1 мг/кг); 4 — ГК-2Й (0,3 мг/кг); 5 — ГК-2Й (0,5 мг/кг); 6 — rK-2h (1,0 мг/кг); 7 — ГК-2Й (1,5 мг/кг); 8 — ГК-2Й (2,0 мг/кг); 9 — пассивный контроль; 10 — активный контроль (скополамин 1,5 мг/кг); 11 — rK-2h (0,1 мг/кг); 12 — TK-2h (0,5 мг/кг); 13 — TK-2h (1,0 мг/кг); 14 — пассивный контроль; 15 — активный контроль (скополамин 1,5 мг/кг); 16 — rK-2h (0,1 мг/кг/5 дней); 17 — TK-2h (0,5 мг/кг/5 дней$) ($ — введение TK-2h внутрь); 18 — пассивный контроль; 19 — активный контроль (кетамин 10,0 мг/кг); 20 — TK-2h (0,1 мг/кг/5 дней); 21 — TK-2h (1,0 мг/кг/5 дней); * — достоверность отличий от пассивного контроля; # — достоверность отличий от активного контроля при p<0,05 (критерий Манна-Уитни)
No 3. 201С
28
ФАРМШШШ И ФАРМОЩШМШ
штщмшт ^шшщкшмиш-
Таблица 1
Изучение противогипоксических свойств ГК-2h на модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъёме в опытах на мышах
Группы животных Доза, продолжительность введения, в/б Время жизни, с
беспородные мыши мыши линии С57Bl6
Контроль Дистиллированная вода/5 дней 1 488±41,76 1 850,0±47,6
rK-2h 0,1 мг/кг/5 дней 1 360±72,1 2 001,0±105,1
rK-2h 1,0 мг/кг/5 дней 1 626±104,9 2 228,0±129,5*
Примечание: * — достоверность отличий от контроля прир<0,05 (критерий Манна—Уитни).
Таблица 2
Таблица 3
Изучение антидепрессивного действия ГК^ в тестах вынужденного плавания и подвешивания за хвост в опытах на мышах
Таблица 4
повторном введении ГК-2h на моделях БА ослабляет у крыс нарушения пространственной ориентации и памяти, а на моделях инсультов — обладает способностью увеличивать выживаемость, ослаблять неврологический дефицит, улучшать поведение и память. Нейропротекторный эффект соединения выявлен и при морфометрических исследованиях [11]. В результате проведённой работы по изучению общего спектра фармакологической активности ГК-2И в опытах на мышах и крысах показано, что соединение в используемых дозах и режимах введения обладает антиамнестическиими свойствами на моделях амнезии УРПИ, вызванной скополамином, МЭШ или кетамином, умеренным противогипоксическим и слабым противосудорожным эффектами, не влияет на ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность животных в открытом поле. Особенно отчётливо выявляются антиамнести-ческие свойства ГК-2^ что согласуется с полученным ранее мнемотропным эффектом нового соединения на моделях БА, инсультов [11]. Результаты настоящей работы подтверждают возможность использования методов скрининга нейропсихотропных препаратов, а именно, моделей амнезий УРПИ и гипоксий для первичной оценки и прогнозирования нейропротектор-ных свойств нейропептидов. Следует отметить, что эти эффекты соединения выявляются практически в том же диапазоне доз, что и его нейропротекторные свойства.
Выводы
1. ГК-2h в дозах 0,1; 0,5 и 1,0 мг/кг в/б обладает антиамнестическими свойствами на модели амнезии условной реакции пассивного избегания, вызванной скополамином; в дозе 1,5 мг/кг, вызванной максимальным электрошоком, а при использовании соединения в дозе 1,0 мг/кг/5 дней на модели кетаминовой амнезии, увеличивая у крыс латентное время при воспроизведении рефлекса.
2. ГК-2h в дозе 1,5 мг/кг, в/б при различных режимах введения обладает противогипоксическим эффектом в условиях гипоксии с гиперкапнией в гермообъёме и слабым противосудорожным действием на модели судорог, вызванных максимальным электрошоком, не влияет на ориентировочно-исследовательское поведение животных в открытом поле.
Влияние ГК^ на ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность мышей в открытом поле
Группы животных Горизонтальная двигательная активность Вертикальная двигательная активность Обследование отверстий
Контроль (дистиллированная вода) 92,8±9,9 23,67±5,7 7,0±1,3
rK-2h (0,1 мг/кг/ 3 дня) 80,7±7,86 13,1±2,05 8,2±0,88
rK-2h (1,0 мг/кг/ 3 дня) 83,9±8,8 19,7±3,86 7,3±1,28
Изучение противосудорожных свойств на модели судорог у мышей линии С57Bl6, вызванных МЭШ
Группы животных Доза в мг/кг, «=10 Судороги в баллах
Контроль 3,3±0,2
ГК^ 0,1 3,1±0,3
0,5 3,1±0,3
1,0 2,8±0,3
1,5 2,6±0,2*
2,0 2,8±0,3
Примечание: * — достоверность отличий от контроля при р<0,05 (критерий Манна—Уитни).
Группы животных Время иммобилизации, с
вынужденное плавание подвешивания за хвост
Контроль (дистиллированная вода) 229,13±14,62 118,76±16,51
ГК^ 0,1 мг/5 дней 233,26±20,11 116,41±13,64
ГК^ 1,0 мг/5 дней 177,92±18,38& 123,15±15,18
Примечание: & — достоверность отличий от контроля при р=0,067 (критерий Манна—Уитни).
Литература
1. Manni L., Rocco M.L., Bianchi P., Soligo M., Guaragna M., Barbaro S.P., Aloe L. Nerve growth factor: basic studies and possible therapeutic applications. Growth Factors. 2013; 31: 4: 115-122.
2. Calissano P., Matrone C., Amadoro G. Nerve growth factor as a paradigm ofneurotrophins to Alzheimer's disease. Dev. Neurobiol. 2010; 70: 5: 372-383.
3. Sopova K., Gatsiou K., Stellos K., Laske C. Dysregulation of neurotrophic and haematopoietic growth factors in Alzheimer's disease: from pathophysiology to novel treatment strategies. Curr. Alzheimer. Res. 2014; 11:1: 27-39.
4. Yang J., Liu H., Yang H., Feng P. Therapeutic time window for the neuroprotective effects of NGF when administered after focal cerebral ischemia. Neurol Sci. 2011; 32: 433-441.
5. Zhu, W., Cheng S., Xu G., Ma M., Zhou Z., Liu D, LiuX. Intranasal nerve growth factor enhances striatal neurogenesis in adult rats with focal cerebral ischemia. Drug Deliv. 2011; 18: 5: 338-43.
6. Obianyo O., Ye K. Novel small molecule activators of the Trk family of receptor tyrosine kinases. Biochim. Biophys Acta. 2013; 1834:10: 2213-2218.
7. Gudasheva T.A., Povarnina P. Yu, Antipova T.A., Firsova Yu.N., Konstantinopolsky M.A., Seredenin S.B. Dimeric dipeptide mimetics of the nerve growth factor Loop 4 and Loop 1 activate TRKA with different patterns of intracellular signal transductionJ. Biomed. Sci. 2015; 22: 106-116.
8. Середенин С.Б., Гудашева Т.А. Патент РФ № 2410392. Дипептид-ные миметики нейротрофинов NGF и BDNF. 27.01.2011. Бюл. № 3.
9. Поварнина П.Ю., Воронцова О.Н., Гудашева Т.А., Островская Р.У., Середенин С.Б. Оригинальный дипептидный миметик фактора роста нервов ГК-2 восстанавливает нарушенные когнитивные функции на моделях болезни Альцгеймера у крыс. Acta Naturae. 2013; 5: 3(18): 61-68.
10. Антипова Т.А., Николаев С.В., Гудашева Т.А., Середенин С.Б. Исследование in vitro нейропротекторных свойств нового оригинального миметика фактора роста нервов человека TK-2(h). Экспериментальная и клиническая фармакология. 2014; 77: 2: 8-11.
11. Котельникова С. О. Изучение нейропсихотропных свойств дди-мерного дипептидного миметика фактора роста нервов человека. Автореф. ддис. ... канд. биол. наук. 2015; 24.
12. Воронина, Т.А., ОстровскаяР.У., Гарибова Т.Л. Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов с ноот-ропным типом действия. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под общ. ред. А.Н. Миронова. Часть 1, М.: Гриф и К. 2012; 276-296.
13. Vogel H.G. Drug discovery and evaluation: pharmacological assays H.G. Vogel. Springer. Berlin. 3rd Edition. 2008; 1800.
14. Porsolt R.D. Animal model of depression. Biomedicine. 1979; 30: 3: 139-140.
15. Steru L., Chermat R., Thierry B., Simon P. The tail suspension test: a new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology (Berl). 1985; 85: 3: 367-370.
