CC BY
9БИОЛОГИЯ (БЮЬООУ)
УДК 57.085.23
Апросимов Д.А.
лаборант-исследователь Отдел ботанических исследований Института биологических проблем криолитозоны ЯНЦ СО РАН (г. Якутск, Россия)
Дьяконова А.Т.
младший научный сотрудник НИИ прикладной экологии Севера Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова
(г. Якутск, Россия)
Куркина И.И.
кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник Учебно-научно технологическая лаборатория "Графеновые нанотехнологии" Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова
(г. Якутск, Россия)
ИЗУЧЕНИЕ МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Аннотация: в работе получены однослойные первичные культуры клеток дермальных фибробластов крупного рогатого скота, проведена их морфометрическая характеристика. Результаты работы и полученные данные имеют значение для дальнейших исследований в области клеточной биологии, фармакологии, а также смежных дисциплин.
Ключевые слова: первичные клеточные культуры. фибробласты, морфометрическая характеристика клеток.
Культуры клеток используются в клеточной и молекулярной биологии в качестве модельных систем для изучения нормальной физиологии и биохимии клеток, воздействия лекарств и токсичных соединений на клетки, а также мутагенеза и канцерогенеза. Также они используются при скрининге и разработке лекарственных препаратов и крупномасштабном производстве биологических соединений (например, вакцин, терапевтических белков). Наибольшее распространение для изучения получили фибробласты. Изучением морфофункциональных свойств и оценкой жизнеспособности культур дермальных фибробластов сельскохозяйственных животных в отечественной науке занялись сравнительно недавно. До недавнего времени большая часть исследований в области генетических технологий для использования в сельском хозяйстве была сосредоточена на секвенировании геномов, обнаружении и каталогизации вариантов последовательностей для различных видов и пород. Дальнейший прогресс в области генетического совершенствования видов и пород сельскохозяйственных животных связывают с развитием технологий геномного редактирования (GE). Именно применение GE-технологий в рутинном режиме, в будущем станет определяющим фактором в обеспечении конкурентоспособности производства сельскохозяйственной продукции. Создание собственных линий животных с заданными свойствами непосредственно связано с культивированием различных клеточных культур. Первым и самым важным этапом вышеуказанного длительного и сложного исследования является поиск оптимальных условий для получения и культивирования клеток млекопитающих различных видов и характеристика полученных культур.
Целью данного исследования является получение однослойных первичных культур клеток дермальных фибробластов крупного рогатого скота и их морфометрическая характеристика.
Материалы и методы. Работа была выполнена в лаборатории "Молекулярная палеонтология" НИИ прикладной экологии Севера и лаборатории "Графеновые нанотехнологии" Северо-Восточного федерального университета им. М.К. Аммосова. В качестве модели были выбраны смешанные породы крупного рогатого скота из центральных районов Якутии. Культивирование и изучение морфометрических показателей фибробластов, полученных от крупного рогатого скота, проводили по стандартной методике. Для получения стабильных культур, свободных от грибковой и бактериальной контаминации, нами была модифицирована методика культивирования дермальных фибробластов крупного рогатого скота. Морфометрический анализ проводился с электронных фотографий в приложении ImageJ. Изучение морфометрических показателей (длина, ширина, площадь, плотность на культуральной чашке) аутологичных дермальных фибробластов проводили в течение трёх пассажей на временных отрезках культивирования 24, 48, 96 часов, на микроскопе Leica DFC-295 (Германия). С каждой культуры выполняли по 5 снимков в формате TIF размером 2048x1536 пикселей в случайно выбранных полях зрения при увеличении x5, x10 и х20 с помощью микроскопа Leica DFC-295 (Германия).
Морфометрические показатели определяли в программе с открытым исходным кодом для анализа и обработки изображений ImageJ (National Institutes of Health, США).
Также было проведено изучение клеток на сканирующем электронном микроскопе фирмы JSM-7800F (JEOL, Япония).
В ходе экспериментальной части исследования были получены культуры дермальных фибробластов сельскохозяйственных животных. Микроскопия культуральных чашек показала, что культуры преимущественно состоят из отростчатых, веретенообразных или распластанных клеток размером около 2040 мкм (Рис.1). В них хорошо развиты органеллы внутренней метаболической среды. Ядро фибробласта овальной формы, характеризуются преобладанием
клеток узкой вытянутой формы, с хорошо визуализируемым ядром и ядрышками, с 2 - 4 отростками. Цитоплазма отчетливо подразделяется на интенсивно окрашенную эндоплазму и слабо окрашенную эктоплазму. Цитоплазма фибробластов базофильна. В ней выявляется хорошо развитая эндоплазматическая сеть с большим количеством рибосом, прикрепленных к мембранам в виде цепочек более 10 гранул.
В клетках в различных временных отрезках (24ч, 48ч и 96ч) при визуальном сравнении наблюдается значимые визуальные различия в плотности, а также количеству отростков.
Рис. 1. Фибробласты через 96 часов культивирования на увеличении х20.
Подсчет клеток проводился в конечном цикле пассажа, непосредственно перед новым пассированием. При разделении клеток на две культуральные чашки наблюдается лаг фаза клетки в течении первых 24 часов после пересева (пассирования) (Рис.2). Между 2м и 3м пассажом зафиксированы отрицательные показатели лаг фазы (Табл. 5).
КЛЕТОК / 1000МКЛ
3,000
> +
№ Г
/ # #
* € # # /
¥ * * м / /
Г / в # 0
9 ...........V ^-----/
2.750 2,500 2,250 2,000 1,750 1,500 1,250 1,000 750 500 250
Начало (Пассаж -1) Конец (Пассаж -1) Начало (Пассаж - 2) Конец (Пассаж - 2 Начало (Пассаж - 3) Конец (Пассаж - 3)
Рис. 2. График роста клеток (шт.).
Таблица 5. Количество клеток (шт./1мл)
Пассаж Количество в начале (шт./1мл) Количество в конце (шт./1мл)
Пассаж - 1 1х103 2,5х103
Пассаж - 2 1,25х103 3х103
Пассаж - 3 1,25х103 3х103
Рис. 3. Открепленный фибробласт на сканирующем электронном микроскопе. Увеличение х5000.
На сканирующем электронном микроскопе выявлен средний диаметр открепившегося фибробласта (Рис.3). Фиксация препарата трипсинизированного фибробласта проводилась в трёх растворах - раствор ЭМБМ, физиологический раствор и вода для инъекций. На препарате, зафиксированном в физиологическом растворе кристаллизация была минимальна. Средний диаметр неприкрепившегося фибробласта равен около 1012 мкм.
В настоящей работе были получены культуры дермальных фибробластов крупного рогатого скота характеризующиеся преимущественно двумя видами клеток: незрелые фибробласты - это клетки веретеновидной формы с 1 - 3 отростками, и зрелые активно функционирующие фибробласты веретеновидной формы с 3 и более отростками. Число клеток в монослое составило около 5660 шт. в каждой культуральной чаше диаметром 60 мм. Монослой образуется в среднем за 10 дней культивирования. Показатель жизнеспособности клеток 98%. В ходе проведенных морфометрических исследований было установлено, что клетки уплощены, распластаны по дну культуральной чашки. Прирост в пассажах по длине составил ~ 1,5 мкм, по ширине ~ 0,05 мкм, по площади ~ 4,5мкм2. Рост показателей по ходу пассирования минимален, что показывает устойчивое состояние морфометрических показателей монослоя.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Зиновьева Н. А., Позябин С. В., Чинаров Р. Ю. Вспомогательные репродуктивные технологии: история становления и роль в развитии генетических технологий в скотоводстве (обзор) //Сельскохозяйственная биология. - 2020. - Т. 55. - №. 2. - С. 225-242.
2. Левченко Владимир Михайлович, Гвоздецкий Николай Алексеевич Разработка современной методики культивирования аутологичных дермальных фибробластов // Известия ОГАУ. 2016. №2 (58).
3. Селионова М. И., Айбазов А. М. М. Геномные технологии в селекции сельскохозяйственных животных //Сельскохозяйственный журнал. - 2014. - Т. 1. - №. 7. - С. 140-145.
Aprosimov D.A.
Institute for Biological Problems of Cryolithozone YSC SB RAS (Yakutsk, Russia)
Dyakonova A.T.
North-Eastern Federal University. M.K. Ammosova (Yakutsk, Russia)
Kurkina I.I.
North-Eastern Federal University. M.K. Ammosova (Yakutsk, Russia)
STUDY OF MORPHOMETRIC PARAMETERS OF CATTLE DERMAL FIBROBLASTS
Abstract: single-layer primary cell cultures of bovine dermal fibroblasts were obtained in the work, their morphometric characteristics were carried out. The results of the work and the data obtained are important for further research in the field of cell biology, pharmacology, as well as related disciplines.
Keywords: primary cell cultures. fibroblasts, morphometric characteristics of cells.
