CC BY
39
УДК 616-018
DOI 10.21685/2072-3032-2018-4-4
М. А. Леонтьев, Е. Б. Родзаевская, Т. Е. Пылаев, А. В. Леонтьева, В. В. Масляков
ИЗУЧЕНИЕ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ТРОМБОЦИТОВ НОВОРОЖДЕННЫХ В НОРМЕ, ПРИ ГИПОКСИИ И СИНДРОМЕ СИСТЕМНОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВИТАЛЬНОГО ОКРАШИВАНИЯ
Аннотация.
Актуальность и цели. Приведены новые данные цитохимического исследования тромбоцитов, дающие представление об их морфофункциональном состоянии у новорожденных в норме и при различных патологических процессах (острая / хроническая гипоксия, синдром системного воспалительного ответа), полученные с помощью методики витального (прижизненного) окрашивания.
Материалы и методы. Изучены тромбоциты периферической крови новорожденных в норме и при патологии при витальном окрашивании трипафла-вином и акридиновым оранжевым.
Результаты. Выявлена неоднородность популяции тромбоцитов новорожденных, определена адгезивная активность, установлены закономерности изменения морфофункциональных свойств при рассмотренных патологических процессах.
Выводы. Доказана морфофункциональная гетерогенность тромбоцитов новорожденных в норме и при типовых патологических процессах. При воздействии острой гипоксии возникают несущественные изменения морфофункцио-нальных свойств. При воздействии хронической гипоксии наблюдается умеренное снижение функциональности тромбоцитов. У новорожденных с синдромом системного воспалительного ответа имеет место достоверное уменьшение числа гранул и снижение адгезивной активности, что обусловливает несовершенство тромбоцитарного гемостаза и повышает риск развития геморрагических осложнений.
Ключевые слова: тромбоциты, новорожденные, морфофункциональные свойства, витальное окрашивание.
M. A. Leont'ev, E. B. Rodzaevskaya, T. E. Pylaev, A. V. Leont'eva, V. V. Maslyakov
THE STUDY OF THE MORPHOFUNCTIONAL PROPERTIES OF NEWBORN PLATELETS IN NORMAL, WITH HYPOXIA AND THE SYNDROME OF A SYSTEMIC INFLAMMATORY RESPONSE USING VITAL STAINING
© Леонтьев М. А., Родзаевская Е. Б., Пылаев Т. Е., Леонтьева А. В., Масляков В. В., 2018. Данная статья доступна по условиям всемирной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License (http:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая дает разрешение на неограниченное использование, копирование на любые носители при условии указания авторства, источника и ссылки на лицензию Creative Commons, а также изменений, если таковые имеют место.
Abstract.
Background. Herein, we present the investigation of the morphofunctional properties of newborn platelets at normal and various pathological processes (acute / chronic hypoxia, syndrome of the systemic inflammatory response (SIRS)), performed with the use of the vital staining technique.
Materials and methods. Clinical samples of the platelets of peripheral blood of newborns (in norm and in pathology), vital staining with two fluorescent dyes (trypaflavin and acridine orange).
Results. The heterogeneity of the newborns platelets population, their adhesive activity, the regularities of change of the morphofunctional properties were determined in the examined pathological processes.
Conclusions. We conclude that newborn platelets at normal conditions and under the influence of acute hypoxia have morphofunctional heterogeneity, with no significant alterations of the morphofunctional properties. The influence of chronic hypoxia displaces a moderate decrease in the functionality of platelets. The evident decrease in the number of granules and adhesive activity was detected for platelets from neonates with SIRS, which in turn, causes the imperfection of platelet hemo-stasis and increases the risk of hemorrhagic complications.
Keywords: platelets, newborns, morphofunctional properties, vital staining, trypaflavin, acridine orange.
Введение
В последние годы интерес исследователей все чаще направлен на изучение морфологии и функциональной способности тромбоцитов новорожденных [1]. Это обусловлено высокой частотой встречаемости у данной категории детей различной патологии, прямо или опосредованно связанной с системой тромбоцитарного гемостаза. Методика витального окрашивания тромбоцитов позволяет дифференциально визуализировать основные структуры тромбоцита без повреждения его целостности и дает возможность использовать полученные результаты в качестве интегральных показателей функционального состояния тромбоцита.
Материал и методика
Исследовано несколько групп новорожденных, характеристика каждой приведена в табл. 1. В группу 1 вошли абсолютно здоровые дети, рожденные при сроке гестации 37-42 недели с оценкой по шкале В. Апгар (1952) на первой минуте не менее 7 баллов. В группу 2 включались новорожденные с установленным во время беременности матери диагнозом хроническая внутриутробная гипоксия плода (ХВГП). Постановка диагноза основывалась на оценке маточно-плацентарно-плодового кровотока при помощи ультразвуковой допплерометрии и цветового допплеровского картирования, сделанных во время беременности. В группу 3 вошли новорожденные, у которых не отмечено нарушений кровотока и развития в антенатальном периоде, но имелся эпизод острой интранатальной гипоксии (асфиксии), подтвержденный с помощью кардиотокографии и оценки после рождения по общепринятой шкале В. Апгар. Группу 4 составили новорожденные, имеющие признаки синдрома системного воспалительного ответа (ССВО), подтвержденные кли-нико-лабораторными данными. К ним согласно Национальным рекомендациям относятся [2]:
- изменения теплового гомеокинеза - аксиллярная температура > 37,5 °С или < 36,2 °С при соблюдении адекватного температурного режима;
- изменения в общем анализе крови (лейкоцитоз или лейкопения менее 5 тыс./л, нейтрофильный индекс более 0,2);
- повышение уровня С-реактивного протеина в сыворотке крови более 10 мг/л;
- повышение уровня прокальцитонина в сыворотке крови более 2 нг/мл;
- повышение уровня ИЛ-8 в сыворотке крови более 100 пг/мл.
Необходимо отметить, что у 100 % новорожденных, вошедших в данную группу, отмечались нарушение теплового гомеокинеза в виде субфеб-рильной или фебрильной лихорадки, изменения в общеклиническом анализе крови в виде лейкоцитоза или лейкопении, а также многократное увеличение уровня С-реактивного протеина, этого достаточно для постановки диагноза ССВО. Кроме того, данная группа новорожденных характеризуется проявлением геморрагического синдрома в виде желудочно-кишечного, легочного кровотечения и внутрижелудочкового кровоизлияния различной степени. Критерии исключения из исследования: возраст старше 28 дней (неонаталь-ный период - первые 28 дней жизни), наличие генетически обусловленной патологии системы гемостаза, а также отказ родителей от участия в исследовании (табл. 1).
Таблица 1
Характеристика групп исследуемых пациентов
Критерий Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4
Здоровые (п = 50) ХВГП (n = 20) Асфиксия (п = 20) ССВО (n = 20)
Возраст, сут 1 2,7 ± 1,27 1,5 ± 0,67 10,3 ± 5,4
Масса при рождении, г 3441±419 1986 ± 767 2783 ±1131 1487 ± 837
Срок гестации, недели 39,6 ± 2,6 33,8 ± 3,5 34,9± 3,49 31,8 ± 3,055
Оценка по шкале Апгар на 1-й мин, баллы 8 ± 0,7 2,9 ± 1,5 1,6 ± 0,66 3,5 ± 1,9
Взятие венозной крови осуществляли в соответствии с рекомендациями международного комитета по стандартизации в гематологии (1С8Н) стандартным способом венепункции в вакуумную пробирку, содержащую стандартное количество распыленного ЭДТА К3 (калиевая соль этилендиаминтет-рауксусной кислоты). Для получения богатой тромбоцитами плазмы кровь центрифугировали в течение 5 мин при скорости 1200 об/мин, затем отбирали надосадок. Для витального окрашивания тромбоцитов использовали смесь флуорохромов - трипафлавина и акридинового оранжевого, предложенную М. С. Макаровым [3]. Методика включает в себя приготовление смеси из двух витальных красителей - трипафлавина и акридинового оранжевого на 0,15 М фосфатном буфере Зеренсена. Для этого смешивали 23 мл 0,15 М КаН2Р04Н20 (18,38 г в 1000 мл дистиллированной воды) и 77 мл 0,15 М Ка2НР04Н20 (18,92 г в 1000 мл дистиллированной воды). Концентрирован-
ный раствор акридинового оранжевого разводили 0,15 М буфером Зеренсена в соотношении 1:1500, а раствор трипафлавина разводили тем же буфером в соотношении 1:2000. После чего оба готовых раствора смешивали в соотношении 1:1. Препараты окрашивали на предметном стекле, внося в 10 мкл богатой тромбоцитами плазмы 5 мкл полученного красителя с последующей окраской в течение 10 мин, после чего окрашенный препарат накрывали покровным стеклом и проводили микроскопирование. Использованная методика окрашивания при рассмотрении во флуоресцентном инвертированном микроскопе DMI 3000B (Leica, Германия, Центр коллективного пользования научным оборудованием в области физико-химической биологии и нанобио-технологии «Симбиоз») в режиме флуоресценции (фильтр I3, возбуждение 450-490 нм) конденсор 0,90/1,25, объектив Planachronat 100/1,25) вызывает красное свечение гранул и зеленое свечение цитоплазмы. При выполнении микроскопии оценивали два параметра: относительное содержание тромбоцитов с гранулами, выраженное в процентах от общего количества анализированных клеток, и адгезивную активность тромбоцитов (ААТ) на стекле. ААТ оценивали также с помощью методики, предложенной М. С. Макаровым [3]. Для этого препарат с прижизненно окрашенными тромбоцитами на стекле помещали на 15 мин в термостат при температуре 37 °С, а затем при помощи флуоресцентного микроскопа определяли количество адгезированных тромбоцитов в расчете на 100 анализируемых форменных элементов. Адгези-рованные тромбоциты при этом выглядят как большие распластанные клетки округлой формы, в которых гранулы либо оттеснены к периферии, либо выходят за пределы клетки. Адгезивную активность выражали в процентах от общего числа проанализированных клеток. Математический и статистический анализы результатов обследования пациентов проведены с использованием пакетов прикладных программ Statistica 7.0 for Windows корпорации StatSoft-Russia, Microsoft Office Exœl 2016. Использованы непараметрические методы статистической обработки данных, так как объем выборки достаточно мал (n = 50). Результаты представляли в виде медианы и квартилей (Ме, Q25, Q75).
Результаты
Установлено, что популяция тромбоцитов новорожденных гетерогенна по составу и представлена формами с различным содержанием гранул вплоть до их отсутствия (рис. 1). Нами выделены следующие классы: тромбоциты с большим количеством гранул (содержащие от 10 до 13 отчетливых гранул), их количество составило 40 (34-42) %, тромбоциты со средним количеством гранул (содержащие 4-9 гранул) - 45 (43-46) %, тромбоциты с низким количеством гранул (содержащие 1-3 гранулы) - 10 (8-11) % и тромбоциты без гранул, которые составили 5 (4-7) % от общего количества.
При изучении адгезивных свойств выявлено несколько различных форм тромбоцитов, по-видимому, отражающих кинетику активации во времени. Это увеличенные в размерах тромбоциты с большим числом гранул (до 16 на клетку), тромбоциты с оттесненными к периферической части клетки гранулами и тромбоциты с измененной формой, наличием отростков и полным отсутствием гранул, что свидетельствует о дегрануляции и необратимости активации (рис. 2).
Рис. 1. Популяция тромбоцитов новорожденных
а) б) в)
Рис. 2. Процесс активации тромбоцита во времени: а - тромбоциты с большим
количеством гранул; б - с оттесненными к периферии клетки гранулами; в - с отсутствием гранул и измененной формой
Подавляющее большинство проанализированных тромбоцитов являются функционально полноценными и проявляют адгезивные свойства в 72 (64-78) %, меньшая часть 28 (21-31) % представляет собой неадгезиро-ванные форменные элементы (рис. 3).
Установлено, что тромбоциты с небольшим количеством гранул и тромбоциты без них не обладают адгезивными свойствами, т.е. являются аре-активными.
При исследовании тромбоцитов новорожденных, подвергшихся влиянию хронической гипоксии, с помощью методики витального окрашивания обнаружено, что в этой группе уменьшается содержание тромбоцитов с большим количеством гранул и возрастает содержание тромбоцитов с малым количеством гранул и с отсутствием таковых (рис. 4).
При острой гипоксии (асфиксии) содержание гранул в тромбоцитах также снижается, подавляющее большинство клеток - тромбоциты, содержащие 5-6 гранул (рис. 5).
Рис. 3. Адгезия тромбоцитов на стекле
Рис. 4. Тромбоциты новорожденного с ХВГП
Рис. 5. Тромбоциты новорожденного с острой гипоксией
У новорожденных с признаками ССВО отмечено значительное снижение функциональной активности. Приоритетными являются клетки, не содержащие гранул и с 2-3 гранулами, т.е. тромбоциты, не проявляющие адгезивных свойств (рис. 6). Показатели функциональной полноценности отражены в табл. 2.
Рис. 6. Тромбоциты новорожденного с ССВО: на верхнем снимке заметны малочисленные тромбоциты, на нижних представлены тромбоциты той же группы в увеличенном виде. Хорошо различимы единичные гранулы в тромбоцитах, которые имеют заметно меньшую яркость свечения гранул по сравнению с тромбоцитами других групп
Таблица 2
Показатели функциональной полноценности тромбоцитов, полученные с помощью методики витального окрашивания
Показатель Группа 1, n = 20 Группа 2, n = 20 Группа 3, n = 20 Контрольная группа, п = 50
Me LQ-UQ Me LQ-UQ Me LQ-UQ Ме ьо-ио
1 2 3 4 5
Тромбоциты с большим количеством гранул, % 28* 26-35 37 36-40 8* 5-9 40 34-42
Тромбоциты со средним количеством гранул, % 40 33-42 43 40-44 22* 20-22 45 43-46
Окончание табл. 2
1 2 3 4 5
Тромбоциты с малым 16* 12,2 30* 10
количеством гранул, % 13-19 9-12 27-34 8-11
Тромбоциты 16* 8 40* 5
без гранул, % 12-17 7-10 37-45 4-7
ААТ, % 56 68 20* 72
52-60 60-70 14-24 64-78
Примечание: для всех параметров указаны медианы и интерквартильный размах. * - р < 0,05 критерий достоверности различий Краскела - Уоллиса по отношению к контрольной группе с поправкой Данна для множественных сравнений.
Обсуждение полученных результатов
Популяция тромбоцитов новорожденных гетерогенна по составу и представлена формами с различным содержанием гранул вплоть до их отсутствия. Подавляющее большинство изученных тромбоцитов являются функционально полноценными и проявляют адгезивные свойства в 72 (64-78) %. Установлено, что тромбоциты с небольшим количеством гранул и тромбоциты без них не проявляют адгезивных свойств. Данное утверждение полностью согласуется с результатами, полученными в ходе предыдущих исследований [3, 4], где также было показано, что тромбоциты без гранул или с 1-2 гранулами не способны к адгезии на стекле, независимо от морфологического типа.
При витальной окраске тромбоцитов новорожденных, подвергшихся влиянию хронической гипоксии, обнаружено, что в этой группе уменьшено содержание тромбоцитов с большим количеством гранул и повышено содержание тромбоцитов с малым количеством гранул и с отсутствием таковых. Это свидетельствует о сниженной функциональной способности тромбоцитов в изученной группе новорожденных, что также подтверждается умеренным снижением адгезивной активности. При острой гипоксии (асфиксии) содержание гранул в тромбоцитах также снижается, подавляющее большинство клеток - тромбоциты, содержащие 5-6 гранул, однако адгезивная активность близка к значению, полученному в группе здоровых новорожденных. У новорожденных с признаками ССВО отмечается значимое снижение функциональной активности, приоритетными являются клетки, не содержащие гранул и с немногочисленными (2-3) гранулами, крайне редко встречаются тромбоциты, содержащие более 10 гранул. При изучении адгезивной активности обнаружено выраженное ее снижение, что согласуется с исследованием Бегкаи А. с соавторами, в котором показано, что у недоношенных новорожденных с сепсисом (ССВО) адгезия тромбоцитов более низкая, чем у здоровых недоношенных детей, что указывает на существование механизма, определяющего тенденцию к развитию геморрагического синдрома в этой популяции [5].
Заключение
Использование методики витального окрашивания ставит на новый уровень изучение тромбоцитов и открывает перспективы для создания качественно иных критериев оценки их морфофункциональной целостности. Методика витального окрашивания является высокоинформативной, легко воспроизводимой, а полученные данные должны быть использованы в практике
лабораторной диагностики отделений перинатальной патологии и при лечении новорожденных, имеющих признаки ССВО, так как сниженная адгезия и малое число гранул у этой категории пациентов обусловливают несовершенство тромбоцитарного гемостаза и повышение риска возникновения геморрагических осложнений.
Библиографический список
1. Thrombocytopenia in neonatal sepsis: Incidence, severity and risk factors / I. M. C. Ree, S. F. Fustolo-Gunnink, V. Bekker, K. J. Fijnvandraat, S. J. Steggerda, E. Lopriore // PloS one. - 2017. - Vol. 12, № 10. - P. 0185581.
2. Неонатология: национальное руководство / А. Г. Антонов, Н. Н. Арестова, Е. Н. Байбарина и др. ; под. ред. Н. Н. Володина. - М. : ГЭОТАР-медиа, 2009. -848 с.
3. Макаров, М. С. Особенности морфофункционального статуса тромбоцитов человека в норме и при патологии : дис. ... канд. биол. наук / Макаров М. С. - М., 2013. -126 с.
4. Хватов, В. Б. Морфологическая оценка адгезивной активности тромбоцитов человека с помощью витального окрашивания / В. Б. Хватов, М. С. Макаров, Н. В. Боровкова // Клиническая лабораторная диагностика. - 2013. - № 7. - С. 58-61.
5. Infection-associated platelet dysfunction of canine platelets detected in a flow chamber model / A. Ferkau et al. // BMC veterinary research. - 2013. - Vol. 9, № 1. - P. 112.
References
1. Ree I. M. C., Fustolo-Gunnink S. F., Bekker V., Fijnvandraat K. J., Steggerda S. J., Lopriore E. PloS one. 2017, vol. 12, no. 10, p. 0185581.
2. Antonov A. G., Arestova N. N., Baybarina E. N. et al. Neonatologiya: natsional'noe rukovodstvo [Neonatology: national guidance]. Moscow: GEOTAR-media, 2009, 848 p.
3. Makarov M. S. Osobennosti morfofunktsional'nogo statusa trombotsitov cheloveka v norme i pri patologii: dis. kand. biol. nauk [Features of the morphofunctional status of human platelets in health and disease: dissertation to apply for the degree of the candidate of biological sciences]. Moscow, 2013, 126 p.
4. Khvatov V. B., Makarov M. S., Borovkova N. V. Klinicheskaya laboratornaya diag-nostika [Clinical laboratory diagnosis]. 2013, no. 7, pp. 58-61.
5. Ferkau A. et al. BMC veterinary research. 2013, vol. 9, no. 1, p. 112.
Леонтьев Михаил Александрович аспирант, Саратовский медицинский университет «Реавиз» (Россия, г. Саратов, ул. Верхний рынок, корп. 10)
E-mail: [email protected]
Родзаевская Елена Борисовна доктор биологических наук, профессор, кафедра морфологии и патологии, Саратовский медицинский университет «Реавиз» (Россия, г. Саратов, ул. Верхний рынок, корп. 10)
E-mail: [email protected]
Leont'ev Mikhail Aleksandrovich Postgraduate student, Saratov Medical Institute "Reabilitation, Doctor and Health" (building 10 Verkhny rynok street, Saratov, Russia)
Rodzaevskaya Elena Borisovna Doctor of biology sciences, professor, sub-department of morphology and pathology, Saratov Medical Institute "Reabilitation, Doctor and Health" (building 10 Verkhny rynok street, Saratov, Russia)
Пылаев Тимофей Евгеньевич кандидат биологических наук, научный сотрудник, лаборатория нанобиотехнологии, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (Россия, г. Саратов, пр. Энтузиастов, 13)
E-mail: [email protected]
Леонтьева Анастасия Владимировна врач анестезиолог-реаниматолог, отделение реанимации и интенсивной терапии новорожденных, Клинический перинатальный центр Саратовской области (Россия, г. Саратов, ул. Зерновая, 33)
E-mail: [email protected]
Масляков Владимир Владимирович
доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой клинической медицины, Саратовский медицинский университет «Реавиз», (Россия, г. Саратов, ул. Верхний рынок, корп. 10)
E-mail: [email protected]
Pylaev Timofey Evgen'evich Candidate of biological sciences, researcher, laboratory of nanobiotechnology, Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences (13 Entuziastov avenue, Saratov, Russia)
Leont'eva Anastasiya Vladimirovna Anesthesiologist-resuscitator, intensive care unit and intensive newborn therapy, Clinical perinatal center of the Saratov region (33 Zernovaya street, Saratov, Russia)
Maslyakov Vladimir Vladimirovich Doctor of medical sciences, professor, head of the sub-department of clinical medicine, Saratov Medical Institute "Reabilitation, Doctor and Health" (building 10 Verkhny rynok street, Saratov, Russia)
УДК 616-018
Изучение морфофунциональных свойств тромбоцитов новорожденных в норме, при гипоксии и синдроме системного воспалительного ответа с использованием витального окрашивания / М. А. Леонтьев, Е. Б. Родзаевская, Т. Е. Пылаев, А. В. Леонтьева, В. В. Масляков // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. -2018. - № 4 (48). - С. 30-39. - БОТ 10.21685/2072-3032-2018-4-4.
