CC BY
36
СТОМАТОЛОГИЯ
УДК 616-022.7
ИЗУЧЕНИЕ МИКРОБНОЙ АССОЦИАЦИИ ЗУБОДЕСНЕВЫХ КАРМАНОВ У БОЛЬНЫХ ХЕЛИКОБАКТЕРИОЗОМ
Богачева Н.В., Тунева Н.А., Колеватых Е.П., Зайцева И.В.
ФГБОУ ВО Кировский государственный медицинский университет Минздрава России, Киров, Россия (610998, г. Киров, ул. К. Маркса, 112), e-mail: bogacheva70@mail.ru
Воспалительные заболевания пародонта не являются строго изолированным, локальным патологическим процессом. В связи с этим ранняя индикация и идентификация, а также ликвидация, не только пародонтопатогенных, но и микроорганизмов - возбудителей ассоциативных инфекционных заболеваний является приоритетной задачей современной пародонтологии.
Цель работы - проанализировать микробную ассоциацию зубодесневых карманов у больных хелико-бактериозом.
В исследовании использовали биологический материал зубодесневых карманов 35 добровольцев в возрасте от 22 до 72 лет, страдающих заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки. Посев материала проводили на колумбийский агар, агар Шедлера с антибиотиками (ванкомицин, амфо-терицин Б). Для идентификации использовали микроскопию мазков по Граму, биохимические тесты -оксидазный, каталазный, уреазный. Для выделения ДНК из биопроб и генотипирования Helicobacter pylori (H. pylori) применяли набор реагентов «ДНК-ЭКСПРЕСС», «Хеликопол CA» и «Хеликопол VA» (НПФ «Литех», Россия).
По результатам исследования было установлено, что в 76,9% случаев у соответствующих пациентов выявлены микроорганизмы зубодесневых карманов, способствующие генерализации пародонтита. В 37,1% и 38,5% случаев в биологическом материале зубодесневых карманов, соответственно, бактериологическим методом и полимеразной цепной реакцией (ПЦР) идентифицирована H. pilory. Генотип выявленных штаммов H. pylori был определен как vacAm2. В клиническом материале добровольцев при наличии H. pylori с генотипом vacAm2 идентифицированы патогенные микроорганизмы зубодесневых карманов.
Ключевые слова: патогенные микроорганизмы, зубодесневые карманы, генотипирование H. pylori.
STUDY OF MICROBIAL ASSOCIATION OF DENTOGINGIVAL POCKETS IN PATIENTS WITH HELICOBACTERIOSIS
Bogacheva N.V., Tuneva N.A., Kolevatykh E.P., Zaitseva I.V.
Kirov State Medical University, Kirov, Russia (610998, Kirov, K. Marx St., 112), e-mail: bogacheva70@mail.ru
Inflammatory periodontal disease is not considered a localized disorder. In this regard it's urgent for present-day periodontics to provide early identification and eradication of both periodontal pathogenic microbes and microorganisms acting as pathogens of associative infectious diseases.
The objective is to analyze the microbial association of the dento-gingival pockets in patients with Helicobacteriosis. The biological material of the dento-gingival pockets of 13 patients aged 22 to 72 years was used. The patients were reported to suffer from diseases of the stomach and duodenum. Seeding was carried out on Columbia Agar, Schaedler agar and antibiotics (vancomycin, amfotireritsinom B). Gram smear microscopy, biochemical tests - oxidase, catalase, urease -have ben used for identification. Reagent kit «DNA-EXPRESS», «Helicopol CA» and «Helicopol VA» (NPF «Lytech», Russia) was used for DNA isolation and genotyping of bioassay H. Pylori.
According to the results of the study it was found that in 76,9% cases the respective patients had periodontal pockets with microorganisms that contribute to the generalization of periodontitis. In 37,1% and 38,5% of the biological material in the periodontal pockets, respectively, the bacteriological method and the PCR identified H. pilory. All identified strains of H. pylori had genotype vac A m2. All individuals positive for H. pylori vacA m2 genotype identified pathogens periodontal pockets.
Key words: pathogenic microorganisms, periodontal pockets, genotyping of H. pylori.
Введение
Воспалительные заболевания пародонта не являются строго изолированным, локальным патологическим процессом [1-6]. В связи с этим ранняя индикация и идентификация, а также ликвидация не только пародонтопатогенных бактерий, но и микро-
организмов - возбудителей ассоциативных инфекционных заболеваний является приоритетной задачей современной пародонтологии. Это, с одной стороны, обусловлено влиянием микрофлоры, персистирую-щей в организме человека, на течение заболеваний пародонта, а с другой, связано с возможностью па-
тогенной флоры зубодесневых карманов вызывать реинфицирование макроорганизма, в том числе способствовать развитию хронического течения инфекционного процесса [7, 8].
H. pylori является одним из ассоциативных микроорганизмов, вызывающих патологию желудочно-кишечного тракта и зубодесневых карманов [9]. Хеликобактериоз - глобальная проблема современной гастроэнтерологии. По данным проведенных исследований, серопозитивность по H. pylori среди лиц с патологией желудка и двенадцатиперстной кишки достигает 80% [10, 12].
Однако частота распространения хеликобакте-риоза и пародонтита является проблемой не только гастроэнтерологов, но и стоматологов.
Результаты исследований О.В. Еремина с соавт., а также Д.В. Каргина, показали, что между тяжестью течения заболеваний пародонта и одновременной сенсибилизацией организма человека H. pylori имеется прямая связь, которая проявляется в более тяжелом течении язвенной болезни, в неэффективной эрадикационной терапии, развитии более частых рецидивов и осложнений [13, 14].
С другой стороны, прослеживается обратная связь между тяжестью течения язвенной болезни и заболеваниями пародонта. Так, у серопозитивных по Н. pylori лиц, страдающих язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, частота заболеваний гингивитом и пародонтитом увеличивается в 2 раза [15].
Все вышесказанное определило актуальность и цель работы - изучение микробной ассоциации зубо-десневых карманов у больных хеликобактериозом.
Материал и методы
Забор биологического материала для выделения ассоциативной микрофлоры зубодесневых карманов провели у 35 добровольцев в возрасте от 22 до 72 лет (средний возраст 44,5±2,5 года), обратившихся в стоматологическую клинику ООО «Айсберг» г. Кирова. Все экспериментальные исследования были проведены в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации 1975 г. и ее пересмотренного варианта от 2000 г. Со всеми добровольцами был подписан договор на добровольное участие в исследовании. Взятие проб у каждого пациента из пародонтальных зубо-десневых карманов осуществляли при помощи эндо-донтальных штифтов, которые по 4 штуки вводили в верхние и нижние зубодесневые карманы. После 10 с. экспозиции в зубодесневых карманах эндодон-тальные штифты помещали в пластиковые стерильные пробирки с транспортной средой для выделения ДНК из биопроб «ДНК-ЭКСПРЕСС» (НПФ «Литех», Россия).
Полученный от каждого добровольца материал делили на две пробирки.
Материал из первой пробирки использовали для бактериологического исследования. Для этого содержимое засевали на готовые чашки Петри, содержащие колумбийский агар с 5% бараньей кровью. Посев осуществляли бактериологической петлей по методу Дригальского. Материал в чашках Петри для инкубации ставили в анаэростат и культивировали в течение 3 суток при температуре 37°С. Предварительную идентификацию микроорганизмов проводили с помощью микроскопии фиксированных препаратов, окрашенных по методу Грама.
Чистые культуры микроорганизмов выделяли, используя пересев отдельных колоний на агар Шед-лера с ванкомицином (10 мкг/мл среды) и амфоте-рицином Б (5 мкг/мл среды). Процедуру инкубации при выращивании чистых культур повторяли, как описано выше. Для идентификации микроорганизмов использовали биохимический тест API Rapid 20Е (BioMerieux, Франция).
Для амплификации использовали наборы реагентов - ХЕЛИКОПОЛ CA (Helicobacter pylori генотип cagA) и ХЕЛИКОПОЛ VA (Helicobacter pylori генотип vacA). Из отдельных компонентов набора готовили смесь реагентов для амплификации. Программа амплификации представлена в таблице 1.
Статистическую обработку результатов проводили, используя программы «Microsoft Excel» и пакета прикладных программ «Statistica 10».
Таблица 1
Программа амплификации
T, оС Время, мин. Количество циклов
94 Pause
94 1 1
94 1
52 1 35
72 2
72 5 1
10 Storage
Результаты и их обсуждение
Перед проведением исследования все пациенты проходили анкетирование, по результатам которого в обследование были включены лица, одновременно страдающие заболеваниями желудочно-кишечного тракта (гастритом, дуоденитом, язвенной болезнью и др.) и полости рта.
Частота встречаемости бессимптомного но-сительства H. pylori варьирует в разных странах от 25% до 70% [11, 12]. По результатам данной работы H. pylori выявлена в 37,1% случаев у лиц, страдающих воспалительными заболеваниями пародонта.
По результатам бактериологической диагностики у 35 добровольцев были идентифицированы обитатели зубодесневых карманов: представители резидентной флоры (аэробы и факультативные анаэробы) - стрептококки, стафилококки, лактобацил-лы; облигатные анаэробы - вейлонеллы, пептостреп-тококки, бактероиды, фузобактерии; представители непостоянной флоры (факультативные анаэробы) -превотеллы, актинобациллы. Микроорганизмы, относящиеся к условно-патогенной флоре пародон-та, в отношении которых, по данным литературы, установлена средняя (Prevotella, Peptostreptococcus, Fusobakterium), большая (Bacteroides) и очень большая (Actinobacillus) связь с прогрессированием паро-донтита, по данным настоящей работы, были идентифицированы в 76,9% случаев [16].
Характеристика воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта и полости рта, а также спектр идентифицированных микроорганизмов у 13 (37,1%) из 35 добровольцев, при обследовании которых наряду с микроорганизмами-возбудителями пародонтита была выявлена в ассоциации H. pylori, представлена в таблице 2.
Таблица 2
Варианты сочетания воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта и полости рта,
имеющихся в анамнезе у добровольцев
№ п/п Возраст, лет Диагноз Ассоциации микроорганизмов, выявленные у добровольцев
гастроэнтерологический стоматологический
1 33 Язвенная болезнь 12-перстной кишки Хронический генерализованный катаральный гингивит легкой степени тяжести Превотеллы, вейлонеллы, лактобациллы, H. pylori
2 61 Хронический гастрит Хронический генерализованный пародонтит тяжелой степени Превотеллы, вейлонеллы, фузобактерии, H. pylori
3 61 Хронический гастрит Хронический генерализованный пародонтит средней степени тяжести Вейлонеллы, H. pylori
4 62 Хронический гастрит Хронический генерализованный пародонтит средней степени тяжести Пептострептококки, превотеллы, H. pylori
5 41 Хронический гастрит Хронический локальный пародонтит легкой степени тяжести Стрептококки, стафилококки, вейлонеллы, H. pylori
6 42 Хронический гастродуоденит Хронический генерализованный пародонтит средней степени тяжести Вейлонеллы, бактероиды, стрептококки, H. pylori
7 57 Хронический гастрит. Дискинезия желчевыводящих путей Хронический генерализованный пародонтит средней степени тяжести Стафилококки, вейлонеллы, актинобациллы, H. pylori
8 47 Язвенная болезнь 12-перстной кишки Хронический локальный пародонтит легкой степени тяжести Стрептококки, стафилококки, лактобациллы, вейлонеллы, H. pylori
9 31 Хронический гастродуоденит Хронический язвенно-некротический гингивит средней степени тяжести Лактобациллы, бактероиды, актинобациллы, фузобактерии, H. pylori
10 72 Язвенная болезнь 12-перстной кишки Острый генерализованный пародонтит тяжелой степени Стафилококки, пептострептококки, вейлонеллы, H. pylori
11 60 Хронический гастрит, язвенная болезнь желудка Хронический генерализованный пародонтит средней степени тяжести Лактобациллы, стафилококки, актинобациллы, H. pylori
12 22 Хронический дуоденит Хронический генерализованный гипертрофический гингивит средней степени тяжести Пептострептококки, H. pylori
13 23 Хронический дуоденит Хронический генерализованный катаральный гингивит средней степени тяжести Стафилококки, пептострептококки, фузобактерии, H. pylori
Параллельно с бактериологическим исследованием проводили постановку ПЦР в три лабораторных этапа:
1. Выделение ДНК из биологического материала.
2. Амплификация.
3. Выявление продуктов амплификации путем электрофоретического разделения продуктов в ага-розном геле.
Выделение ДНК из биологического материала зубодесневых карманов добровольцев осуществляли
путем кипячения в реагенте для выделения ДНК. Накопленный материал использовали для постановки ПЦР. Амплификацию проводили в соответствии с программой, представленной в таблице 1.
Продукты амплификации выявляли путем горизонтального электрофоретического разделения их в агарозном геле с последующей визуализацией геля на стекле УФ-трансиллюминатора. Необходимые фрагменты ДНК на геле при облучении ультрафиолетом с длиной волны 310 нм выглядели в виде светящихся
оранжево-красных полос. Оценку результата анализа проводили при соблюдении следующих критериев:
• полосы в отрицательном контрольном образце К(-) должны отсутствовать; полос, свидетельствующих о контаминации набора на уровне положительного контроля, быть не должно;
• одна полоса, соответствующая уровню положительного контроля, должна быть в положительном контрольном образце К(+);
• отсутствие полосы оранжево-красного цвета в исследуемой пробе на уровне положительного контроля свидетельствует об отсутствии ДНК H. pylori;
Результат определения разм<
• наличие полосы оранжево-красного цвета в исследуемой пробе на уровне положительного контроля свидетельствует о присутствии ДНК H. pylori.
Для фиксации результатов электрофоретиче-ского разделения продуктов амплификации в геле их фотографировали, используя оранжевый (594 нм) светофильтр.
Результаты определения размеров фрагментов ДНК H. pylori в пробах, соответствующих фрагменту положительного контрольного образца, представлены в таблице 3.
Таблица 3
№ фрагментов ДНК H. pylori
ДНК набор Возбудитель Фрагмент ПК, п.н.
ХЕЛИКОПОЛ СА генотип cagA 404
ХЕЛИКОПОЛ VA генотип vacA vacA s1: 259 vacA s2: 286 vacA ml: 290 vacA m2: 352
По результатам ПЦР у 13 (37,1%) из 35 добровольцев наряду с микроорганизмами-возбудителями пародонтита была выявлена H. pylori.
При этом H. pylori с генотипом vacA m2 была идентифицирована у 5 добровольцев из 13: №№ 4, 10, 11, 12, 13, то есть у 38,5% лиц. Соответствующий генотип H. pylori методом постановки ПЦР был определен в биологическом материале добровольцев № 10 и № 13 и не выявлен у добровольца № 3, у которого микроорганизм бактериологическим методом в первом случае выявить не удалось, а во втором случае он был идентифицирован. Данный факт свидетельствует о необходимости комплексного обследования пациентов с использованием современных методов диагностики при идентификации этиологических агентов инфекционных заболеваний.
По данным работ Г.Ш. Исаева с соавт. и Я.С. Циммермана [17, 18], ген VacA кодирует образование вакуолизирующего цитотоксина VacA. Последний влияет на образование вакуолей и гибель эпителио-цитов, подавляет секрецию соляной кислоты в желудке, повышает секрецию пепсиногена, снижает расщепляющую способность эндосом и лизосом, способствует повышению внеклеточной секреции кислых гидролаз, ингибирует размножение клеток, нарушает иммунный ответ на антиген, повреждает митохондрии и другие структуры желудочного эпителия, снижает энергетическое обеспечение эпителио-цитов, повышает выживаемость H. pylori в гастроин-тестинальных клетках, стимулирует апоптоз клеток.
Штамм H. pylori с генотипом VacAm2 способен обеспечить средний уровень секреции цитотоксина VacA. Исходя из вышеописанных механизмов участия цитоксина VacA в патогенезе развития язвенной болезни, добровольцы №№ 4, 10, 11, 12, 13 имеют предрасположенность к хроническому, осложненному течению хеликобактерной инфекции [18].
Кроме этого, у данных добровольцев, позитивных по H. pylori, с генотипом микроорганизма VacAm2, в 100% случаев, по результатам проведенного в данной работе бактериологического исследования, выявлены патогенные микроорганизмы, являющиеся факторами прогрессирования воспалительных заболеваний пародонта.
Выводы
1. По результатам анкетирования у всех стоматологических пациентов, страдающих воспалительными заболеваниями пародонта, были выявлены сопутствующие заболевания желудочно-кишечного тракта.
2. В 76,9% случаев у обследованных пациентов выявлены высокопатогенные микроорганизмы зу-бодесневых карманов, способствующие развитию и поддержанию генерализованного пародонтита.
3. В 37,1% и 38,5% случаев по результатам исследования биологического материала зубодесневых карманов, соответственно, бактериологическим методом и методом постановки ПЦР идентифицирована H. pilory с генотипом vacA m2, обеспечивающая средний уровень секреции патогенного цитотоксина VacA.
4. В образцах пациентов, позитивных по H. pylori с генотипом vacA m2, в 100% случаев бактериологическим методом выявлены патогенные микроорганизмы зубодесневых карманов.
Литература/References
1. Periodontal Aspects of Systemic Health. The Compendium of Continuing Education in Dentistry. 2000;19(1):55.
2. Paul A.T. Moore Orchard et al. Diabetes and oral health promotion. JADA. 2000;131: P. 1333-1341.
3. Straka, Michal. Пародонтит и диабет. Новое в стоматологии. 2002; 8: 32-35. [Straka, Michal. Parodontit i diabet. Novoe v stomatologii. 2002; 8: 32-35 (In Russ.)].
4. Mattila K.J. et al. Dental infections and coronary atherosclerosis. Atherosclerosis. 1993;103: 205-211.
5. Manau C. Periodontal disease definition may determine the association between periodontitis and pregnancy outcomes. J Clin Periodontal. 2008; 35: 385-397.
6. Татимова А.Ю., Мокрецова И.М., Богачева Н.В. Обоснование комплексного подхода к выявлению возбудителей инфекционных заболеваний, локализованных в полости рта человека. Всероссийская ежегодная научно-практическая конференция «Общество, наука, инновации». 2013;108-110. [Tatimova A.Yu., Mokretsova I.M., Bogacheva N.V. Obosnovanie kompleksnogo podkhoda k vyyavleniyu vozbuditelei infektsionnykh zabolevanii,
lokalizovannykh v polosti rta cheloveka. Vserossiiskaya ezhegodnaya nauchno-prakticheskaya konferentsiya «Obshchestvo, nauka, innovatsii». 2013; 108-110 (In Russ.)].
7. Абаев З.М. Качество жизни пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом тяжелой степени и агрессивными формами пародонтита. // Проблемы социальной гигиены, здравоохранения и истории медицины. 2012;4:33-35. [Abaev Z.M. Kachestvo zhizni patsientov s khronicheskim generalizovannym parodontitom tyazheloi stepeni i agressivnymi formami parodontita. Problemy sotsial'noi gigieny, zdravookhraneniya i istorii meditsiny. 2012; 4: 33-35 (In Russ.)].
8. Мокрецова И.М., Тарасова Т.С., Богачева Н.В. Совершенствование методики микробиологической диагностики хеликобактериоза. Всероссийская ежегодная научно-техническая конференция «Общество, наука, инновации». 2012; 141-146. [Mokretsova I.M., Tarasova T.S., Bogacheva N.V. Sovershenstvovanie metodiki mikrobiologicheskoi diagnostiki khelikobakterioza. Vserossiiskaya ezhegodnaya nauchno-tekhnicheskaya konferentsiya «Obshchestvo, nauka, innovatsii». 2012;141-146 (In Russ.)].
9. Нейсберг Д.М., Стюф И.Ю. Роль эктопических очагов Helicobacter pylori при хроническом генерализованном пародонтите. // Пародонтология. 2011;2(59):9-13. [Neysberg D.M., Styuf I.Yu. Rol' ektopicheskikh ochagov Helicobacter pylori pri khronicheskom generalizovanom parodontite. Parodontologiya. 2011;2(59): 9-13 (In Russ.)].
10. Шкитин В.А., Шпирна А.И., Старовойтов Г.Н. Роль Helicobacter pylori в патологии человека. Клиническая микробиология и антимикробная терапия. 2002;4(2):128-145. [Shkitin V.A., Shpirna A.I., Starovoitov G.N. Rol' Helicobacter pylori v patologii cheloveka. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya terapiya. 2002;4(2):128-145 (In Russ.)].
11. Сварваль A.B., Ферман Р.С., Жебрун А.Б. Ин-фицированность Helicobacter pylori населения Северо-Западного региона федерального округа. Четвертая Международная конференция «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». СПб. 2008. 136 c. [Svarval A.V., Ferman R.S., Zhebrun A.B. Infitsirovannost' Helicobacter pylori naseleniya Severo-Zapadnogo Regiona Federal'nogo Okruga. Chetvertaya Mezhdunarodnaya Konferentsiya «Idei Pastera v bor'be s infektsiyami». St-Petersburg. 2008. 136 p. (In Russ.)].
12. Жебрун А.Б., Сварваль A.B., Ферман Р.С. Сравнительный анализ инфицированности Helicobacter pylori населения различных возрастных групп Северо-Западного региона и Якутии. // Вестник Российской военно-медицинской академии. СПб. 2008; 2 (22): 653-654. [Zhebrun A.B., Svarval A.V., Ferman R.S. Sravnitel'nyi analiz infitsirovannosti Helicobacter pylori naseleniya razlichnykh vozrastnykh grupp
Severo-Zapadnogo regiona i Yakutii. VestnikRossiiskoi Voenno-meditsinskoi akademii. St-Petersburg. 2008;2(22): 653-654 (In Russ.)].
13. Еремин О.В., Лепилин А.В., Козлова И.В. Ко-морбидность болезней пародонта и желудочно-кишечного тракта. // Саратовский научно-медицинский журнал. 2009; 5(3): 393-398. [Eremin O.V., Lepilin A.V., Kozlova I.V. Komorbidnost' boleznei parodonta i zheludochno-kishechnogo trakta. Saratovskii nauchno-meditsinskii zhurnal. 2009; 5(3): 393-398 (In Russ.)].
14. Каргин Д.В. Клинические особенности, диагностика и оценка эффективности лечения воспалительных заболеваний пародонта у пациентов с различными вариантами течения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Волгоград; 2007. 28 с. [Kargin D.V. Klinicheskie osobennosti, diagnostika i otsenka effektivnosti lecheniya vospalitel'nykh zabolevanii parodonta u patsientov s razlichnymi variantami techeniya yazvennoi bolezni dvenadtsatiperstnoi kishki. [dissertation]. Volgograd; 2007. 28 p. (In Russ.)].
15. Айвазова Р.А. Эффективность эрадикационной терапии в лечении заболеваний пародонта у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Helicobacter pylori: дис. ... канд мед. наук. Москва; 2007. 144 c. [Aivazova R.A. Effektivnost' eradikatsionnoi terapii v lechenii zabolevanii parodonta u bol'nykh yazvennoi bolezn'yu dvenadtsatiperstnoi kishki, assotsiirovannoi s Helicobacter pylori. [dissertation]. Moscow; 2007. 144 p. (In Russ.)].
16. Рехвиашвили Б.А. Оценка качественного и количественного состава микробиоценоза пародонтального кармана у пациентов с агрессивным пародонтитом: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Москва; 2013. 24 c. [Rekhviashvili B.A. Otsenka kachestvennogo i kolichestvennogo sostava mikrobiotsenoza parodontal'nogo karmana u patsientov s agressivnym parodontitom. [dissertation]. Moscow; 2013. 24 p. (In Russ.)].
17. Исаева Г.Ш., Поздеев О.К. Роль H. pylori в патогенезе злокачественных трансформаций эпителия слизистой оболочки желудка. // Казанский медицинский журнал. 2003. 84 (6): 437-441. [Isaeva G.Sh., Pozdeev О.К. Rol' H. pylori v patogeneze zlokachestvennykh transformatsii epiteliya slizistoi obolochki zheludka. Kazanskii meditsinskii zhurnal. 2003;84(6):437-441 (In Russ.)].
18. Циммерман Я.С. Клиническая гастроэнтерология: избранные разделы. М.: ГЕОТАР-Медиа. 2009. 416 c. [Zimmerman Y.S. Klinicheskaya gastroenterologiya: izbrannye razdely. Moscow: GEOTAR-Media; 2009. 416 p. (In Russ.)].
Внешние источники финансирования отсутствовали.
