CC BY
41
Научная статья УДК 636.92
doi: 10.24412/2078-1318-2022-4-131-138
ИЗУЧЕНИЕ МИКРОБИОМА РУБЦА КОРОВ МЕТОДОМ NGS-СЕКВЕНИРОВАНИЯ
Башир Хайрулламин1, Виталий Юрьевич Морозов2, Сергей Павлович Скляров3
1 Санкт-Петербургский государственный аграрный университет, Петербургское шоссе, д. 2, Пушкин, Санкт-Петербург, 196601, Россия; [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-1275-215X 2Санкт-Петербургский государственный аграрный университет, Петербургское шоссе, д. 2, Пушкин, Санкт-Петербург, 196601, Россия; [email protected]; http://orcid.org/0000-000-3688-1546 3Санкт-Петербургский государственный аграрный университет, Петербургское шоссе, д. 2, Пушкин, Санкт-Петербург, 196601, Россия; [email protected]; http://orcid.org/0000-0001 -6417-5858
Реферат. Микробиом жвачных животных давно рассматривается как отдельный «орган», который выполняет множество важных функций. На состав микробиома позитивно влияет введение в рацион пробиотических добавок. Актуально изучение состава популяций микроорганизмов на основе секвенирования генов 16S рРНК. Целью исследования было изучение с применением NGS-секвенирования состава микробиоценоза рубца лактирующих коров на фоне использования пробиотика Целлобактерин+. Задачи исследования включали выделение ДНК из тестируемых образцов с использованием набора для очистки геномной ДНК ("Fermentas, Inc.", Литва) в соответствии с прилагаемыми инструкциями, а также проведение сравнительного анализа микрофлоры у коров опытной и контрольной групп с применением NGS-секвенирования и прибора MiSeq («Illiumina, Inc.», США). В результате проведения анализа в образцах было выявлено до 530 видов микроорганизмов. Наибольшее суммарное количество полезных вейлионелл, синтезирующих летучие жирные кислоты, детектировалось в рубце коров опытной группы после применения пробиотика Целлобактерин+ (21,1%). У коров опытной группы наблюдалось также наименьшее содержание актиномицетов (не более 0,04%), которые являются нежелательными микроорганизмами. Таким образом, в группе коров, получавших пробиотик Целлобактерин+, по сравнению с контрольной группой до пробиотика было выявлено высокое количество «полезных» микроорганизмов и низкое содержание нежелательных бактерий.
Ключевые слова: Целлобактерин+, NGS-секвенирование, молекулярная генетика, рубцовые бактерии и микрофлора, жирные кислоты, микроорганизмы, пробиотик
Цитирование. Хайрулламин Б., Морозов В.Ю, Скляров С.П. Изучение микробиома рубца коров методом NGS-секвенирования // Известия Санкт-Петербургский государственный аграрный университет. - 2022. - № 4 (69). - С. 131-138. doi: 10.24412/2078-1318-2022-4-131138.
STUDY OF THE RUMEN MICROBIOME OF COWS BY NGS SEQUENCING Bashir Khairullamin1, Vitaliy Yu. Morozov2, Sergey P. Sklyarov3
1Saint-Petersburg State Agrarian University, Peterburgskoye Shosse, house 2, Pushkin, Saint-Petersburg, 196601, Russia; [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-1275-215X
2Saint-Petersburg State Agrarian University, Peterburgskoye Shosse, house 2, Pushkin, Saint-Petersburg, 196601, Russia; [email protected]; http://orcid.org/0000-000-3688-1546
3Saint-Petersburg State Agrarian University, Peterburgskoye Shosse, house 2, Pushkin, Saint-Petersburg, 196601, Russia; [email protected]; http://orcid.org/0000-0001-6417-5858
Abstract. The ruminant microbiome has long been regarded as a separate "organ" that performs many important functions. The microbiome composition is positively influenced by the introduction of probiotic supplements into the diet. It is relevant to study the composition of microbial populations based on 16S rRNA gene sequencing. The aim of the research was to study the composition of the rumen microbiocenosis of lactating cows against the background of Celobacterin+ probiotic using NGS sequencing. The objectives of the study included DNA extraction from test samples using a genomic DNA purification kit (Fermentas, Inc., Lithuania) in accordance with the attached instructions, as well as a comparative analysis of the microflora in cows of the experimental and control groups using NGS sequencing and the device MiSeq (Illiumina, Inc., USA). As a result of the analysis, up to 530 types of microorganisms were identified in the samples. The largest total amount of useful veillionella synthesizing volatile fatty acids was detected in the rumen of cows of the experimental group after the application of the probiotic Cellobacterin+ (21.1%). The cows of the experimental group also had the lowest content of actinomycetes (not more than 0.04%), which are undesirable microorganisms. Thus, in the group of cows treated with the Cellobacterin+ probiotic, compared with the control group before the probiotic, a high number of "beneficial" microorganisms and a low content of undesirable bacteria were revealed.
Keywords: Cellobacterin+, NGS sequencing, molecular genetics, rumen bacteria and microflora, fatty acids, microorganisms, probiotic
Citation. Khairullamin, B., Morozov, V.Y., Sklyarov, S.P. (2022), "Study of the rumen microbiome of cows by NGS sequencing", Izvestiya of Saint-Petersburg State Agrarian University, vol. 69, no. 4, pp. 131-138. (In Russ.). doi: 10.24412/2078-1318-2022-4-131-138.
Введение. Жвачные животные - одна из самых интересных групп травоядных млекопитающих на планете, имеющих преджелудок - рубец, где корм разлагается до того, как он попадает в «истинный» желудок и остальную пищеварительную систему. Рубец обеспечивает среду для разнообразных анаэробных микробов. Эти микробы вырабатывают ферменты, которые необходимы для расщепления сложных молекул, в первую очередь растительных полисахаридов [1]. Разложение волокон, богатых целлюлозой, включает в себя предварительные симбиотические отношения в микробиоте [2]. Гидролиз лигноцеллюлозы часто ограничивает кинетику и эффективность образования метаболитов. Микробиом рубца -это хорошо изученная экосистема, которая способна использовать растительный материал в неорганизованной пищевой цепи [3]. На первом этапе простейшие, грибы и бактерии осуществляют гидролиз полимеров, таких как целлюлоза и другие сложные углеводы, белки и липиды. Мировые знания в области микробиологии рубца были накоплены благодаря использованию методов, основанных на культивировании. Исследования изолированных культур позволили получить базовое представление о биохимии выделенных штаммов [4]. К сожалению, большинство микробных штаммов в сложных средах обитания не могут быть культивированы в чистых культурах, поэтому эти подходы малополезны, когда целью является прояснение взаимоотношений между членами сообщества. В настоящее время для
исследования этих сообществ также используются молекулярно-генетические, метагеномные подходы, такие как секвенирование на платформе Illumina [5; 6].
Цель исследования - анализ структуры бактериального сообщества в рубцовом содержимом коров различных групп (до и после использования пробиотика) с применением молекулярно-генетического метода NGS-секвенирования.
Материалы, методы и объекты исследования. Эксперимент по скармливанию пробиотика Целлобактерин+ проводили на новотельных коровах черно-пёстрой голштинизированной породы 2-3-й лактации (табл. 1). Через 2 месяца после начала эксперимента у коров в период раздоя с соблюдением условий асептики были отобраны пробы для анализа микробных сообществ рубцового содержимого. Целлобактерин+ является пробиотиком на основе полезных бактерий (ООО «БИОТРОФ», Россия). Было сформировано 2 группы: контрольная - до применения пробиотика Целлобактерин+ и опытная - через 2 месяца после применения пробиотика Целлобактерин+.
Таблица 1. Схема опыта Table 1. Chart of experiment
№ п/п Наименование групп Вариант опыта
животных
1 Контрольная
2 До применения пробиотика Целлобактерин+
3
4
5 Опытная
б Через 2 месяца после применения пробиотика
l Целлобактерин+
В
Тотальную ДНК из исследуемых образцов выделяли с использованием набора Genomic DNA Purification Kit («Fermentas, Inc.», Литва) согласно прилагаемой инструкции.
Состав бактериального сообщества рубца анализировали методом NGS-секвенирования на платформе MiSeq («Illiumina, Inc.», США) с праймерами для V3-V4 региона гена 16S рРНК: прямой праймер — 5'-TCGTC-GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3', обратный — 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGA-CTACHVGGGTATCTAATCC-3'.
Секвенирование проводили с применением следующих реагентов: для приготовления библиотек — Nextera® XT Index Kit («Illiumina, Inc.», США), для очистки ПЦР-продуктов — Agencourt AMPure XP («Beckman Coulter, Inc.», США), для секвенирования — MiSeq® ReagentKit v2 (500 cycle) («Illiumina, Inc.», США). Максимальная длина полученных последовательностей составила 2^250 п. н.
Результаты исследования. При помощи анализа методом NGS-секвенирования в образцах было обнаружено в зависимости от пробы до 530 видов микроорганизмов. Среди них были выявлены представители нормальной микрофлоры, условно-патогенной и патогенной микрофлоры, а также представители некультивируемой микрофлоры, роль которых еще не изучена, и транзитной микрофлоры, не играющей существенной роли в жизнедеятельности животного.
Как видно из рис. 1, целлюлозолитические бактерии в рубцовом содержимом исследованных коров обеих групп в основном были представлены семействами бактерий: Clostridiaceae, Prevotellaceae, Eubacteriaceae, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Thermoanaerobacteraceae, Peptostreptococcaceae, а также порядком Bacteroidales. Целлюлозолитические бактерии - это основные доминирующие бактерии рубца коров, расщепляющие клетчатку растительных кормов до летучих жирных кислот [7].
Общая доля целлюлозолитических бактерий была высокая во всех образцах рубцового содержимого и колебалась от 66,08% до 79,87% в зависимости от образца. Самое высокое содержание данных полезных целлюлозолитиков было обнаружено в образце № 8 (корова опытной группы). Всего было обнаружено более 170 видов целлюлозолитических микроорганизмов.
Рисунок 1. Содержание целлюлозолитиков, %: 1-4 - животные до применения пробиотика Целлобактерин+; 5-8 - животные после применения пробиотика Целлобактерин+ Figure 1. The content of cellulolytics, %: 1-4 - animals before the use of the probiotic Cellobacterin+;
5-8 - animals after the use of the probiotic Cellobacterin+
NGS-анализ образцов показал, что содержание лактат-утилизирующих бактерий в рубце исследованных коров было неоднородно - от 0,99% в пробе № 1 (контрольная группа) до 10,17% в пробе № 7 (опытная группа). Наибольшее суммарное количество данных полезных бактерий наблюдалось в рубцовом содержимом коров, получавших пробиотическую добавку Целлобактерин+ (21,1%). Сумма вейлионелл в группе без пробиотика Целлобактерин+ (контрольной) составила 9,07%, что является низким показателем, и такая концентрация может привести к накоплению молочной кислоты и, как следствие, к ацидозу [8]. Дело в том, что лактат-утилизирующие бактерии ферментируют молочную кислоту, которая образуется бактероидами и молочнокислыми бактериями (а также другие органические кислоты), до летучих жирных кислот, используемых организмом в метаболических процессах (рис. 2).
Рисунок 2. Содержание лактат-утилизирующих бактерий, %: 1-4 - животные до применения пробиотика Целлобактерин+ (контроль); 5-8 - животные после применения пробиотика
Целлобактерин+ (опыт)
Figure 2. The content of lactate-utilizing bacteria, %: 1-4 - animals before the use of the probiotic Cellobacterin+ (control); 5-8 - animals after the use of the probiotic Cellobacterin+ (experience)
Доля бифидобактерий в пробах рубцового содержимого коров обеих групп была крайне
мала (от 0 до 0,1%) (рис. 3). Функции бифидобактерий в пищеварительном тракте: антимикробная активность, иммуномодулирующая активность, синтез витаминов, синтез некоторых незаменимых аминокислот [9].
0,12 0,10
0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 12 И И 4 m 5 m 7 8
Рисунок 3. Содержание бифидобактерий, %: 1-4 - животные до применения пробиотика
Целлобактерин+; 5-8 - животные после применения пробиотика Целлобактерин+ Figure 3. The content of bifidobacteria, %: 1-4 - animals before the use of the probiotic Cellobacterin+; 5-8 - animals after the use of the probiotic Cellobacterin+
Семейство Bacillaceae представлено несколькими родами. В рубцовой жидкости исследованных коров обеих групп были обнаружены такие представители этого семейства, как Bacillus sp., Paenibacillus sp., Geobacillus sp., Alcalibacillus sp., и др. Функции бацилл в рубце коров: антимикробная активность, иммуномодулирующая активность, протеолитическая активность, ферментативная активность в отношении углеводов кормов [10].
Содержание бацилл в пробах рубцового состава было очень незначительным (рис. 4) и образцы различались между собой по их количеству. Суммарное процентное количество в отдельных пробах рубцового содержимого не превышало 0,49%.
0,60 0,50 0,40 ■
0,30 0,20 0,10 0,00 1 =1 III 34 lili 5678
Рисунок 4. Содержание бацилл, %: 1-4 - животные до применения пробиотика Целлобактерин+; 5-8 -животные после применения пробиотика Целлобактерин+ Figure 4. The content of bacilli, %: 1-4 - animals before the use of the probiotic Cellobacterin+; 5-8 -
animals after the use of the probiotic Cellobacterin+
Подведем итоги исследований нормофлоры в обеих группах: содержание целлюлозолитиков было высокое, однако концентрация отдельных представителей целлюлозолитических микроорганизмов ниже допустимых норм. Средняя концентрация лактат-утилизирующих бактерий была выше в рубцовом содержимом животных после применения Целлобактерина+. Количество бифидобактерий и бацилл было ниже допустимых норм в рубцовой жидкости коров у обеих групп.
В исследованных образцах лактобактерии были представлены в низкой концентрации, в основном порядком LactobaciШales. Суммарная доля лактобацилл в исследованных образцах у коров обеих групп колебалась от 0,24% до 0,52%. Лактобактерии в рубце коров ферментируют моносахара до молочной кислоты и могут приводить к снижению рН в рубце, поэтому являются нежелательными [11].
Рисунок 5. Содержание лактобактерий, %: 1-4 - животные до применения пробиотика Целлобактерин+; 5-8 -животные после применения пробиотика Целлобактерин+ Figure 5. Lactobacilli content, %: 1-4 - animals before the use of the probiotic Cellobacterin+; 5-8 - animals
after the use of the probiotic Cellobacterin+
Как видно из рис. 5, суммарная доля актиномицетов в образцах рубцового содержимого коров обеих групп колебалась от 0,031% до 0,16% и не превышала допустимые нормы. Наименьшее содержание актиномицетов (не более 0,04%) (рис. 6) наблюдалось в образцах рубцового содержимого после применения пробиотика Целлобактерин+ (опытная группа). Актиномицеты - это нежелательные микроорганизмы рубца коров, поскольку они могут являться возбудителями актиномикозов, резкое возрастание их доли может свидетельствовать о дисбиотических нарушениях [12].
0,20 0,15 0,10 0,05 0,00
1
я \ 11
1 2 3 4 5 6 7
8
Рисунок 6. Содержание актиномицетов, %: 1-4 - животные до применения пробиотика Целлобактерин+; 5-8 - животные после применения пробиотика Целлобактерин+ Figure 6. The content of actinomycetes, %: 1-4 - animals before the use of the probiotic Cellobacterin+;
5-8 - animals after the use of the probiotic Cellobacterin+
Выводы. По результатам молекулярно-генетических анализов группа коров, получавших Целлобактерин+, показала лучшие результаты в высоком количестве «полезных» микроорганизмов и в меньшей концентрации нежелательных бактерий по отношению к другой группе. Это свидетельствует о восстановлении микробиома под влиянием данной кормовой добавки.
Список источников литературы
1. Goodwin, S. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies / S. Goodwin, J. D. McPherson, and W. R. McCombie // Natur Reviews Genetics.- 2016. - № 17. - Р. 333-351. - doi: 10.1038/nrg.2016.49.
2. Метабиотики как естественное развитие пробиотической концепции / М.Д. Ардатская, Л.Г. Столярова, Е.В. Архипова, О.Ю. Филимонова // Трудный пациент. - 2017.- Т. 15. - № 6-7. - С. 35-39.
3. MEGAN community edition - interactive exploration and analysis of large-scale microbiome sequencing data / D. H. Huson, S. Beier, I. Flade, A. Gorska, M. El-Hadidi, S. Mitra, et al. // PLOS Computational Biology. - 2016. - № 12(6):e1004957. - doi: 10.1371/journal.pcbi.1004957.
4. A structural and functional elucidation of the rumen microbiome influenced by various diets and microenvironments / S. Deusch, A. Camarinha-Silva, J. Conrad, U. Beifuss, M. Rodehutscord, J. Seifert // Frontiers in Microbiology. - 2017. - № 8:1605. - doi: 10.3389/fmicb.2017.01605
5. Ruminal bacterial community composition in dairy cows is dynamic over the course of two lactations and correlates with feed efficiency / K.A., Jewell, C.A. McCormick, C.L. Odt, P.J. Weimer, G. Suen // Applied and Environmental Microbiology. - 2015. - № 81. - Р. 4697-4710. - doi: 10.1128/AEM.00720-15.
6. The effect of wheat prebiotics on the gut bacterial population and iron status of iron deficient broiler chickens / E. Tako, R.P. Glahn, M. Knez J.C. Stangoulis // The Journal of Nutrition. - 2014. - Vol. 13. - doi: 10.1186/1475-2891-13-58.
7. Антибиотики, пребиотики, пробиотики, метабиотики при избыточном бактериальном росте в тонкой кишке / Э.П. Яковенко, Н.А. Агафонова, А.В. Яковенко, А.Н. Иванов, И.П. Солуянова // Трудный пациент. - 2018. - Т. 16. - № 4. - С. 16-22.
8. Сравнительное исследование бактериотропного действия метабиотиков / В.А. Несчисляев, Т.В. Фёдорова, Ю.В. Сорокина, Е.И. Молохова, А.С. Савина // Медицинский совет. - 2019. - № 21.
- С. 154-158.
9. Нормы потребления молочного скота и свиней в питательных веществах / Р.В. Некрасов, А.В. Головин, Е.А. Махаев, А.С. Аникин, Н.Г. Первов, Н.И. Стрекозов, А.Т. Мысик, В.М. Дуборезов, М.Г. Чабаев, Ю.П. Фомичев, И.В. Гусев; под ред. Р.В. Некрасова. - Москва, 2018.
- 281 с.
10. InterPro in 2017-beyond protein family and domain annotations / R. D. Finn, T. K. Attwood, P. C. Babbitt, A. Bateman, P. Bork, A. J. Bridge, et al. // Nucleic Acids Research. - 2017. - № 45 (D1): D190-D199. - doi: 10.1093/nar/gkw1107
References
1. Goodwin, S., McPherson, J. D., and McCombie, W. R. (2016), Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies, Nat. Rev. Genet., no. 17, pp. 333-351, doi: 10.1038/nrg.2016.49).
2. Ardatskaya, M.D., Stolyarova, L.G., Arkhipova, E.V., Filimonova, O. Yu., (2017), Metabiotics as a natural development of the probiotic concept, Trudnyy patsiyent, vol. 15, no. 6-7, pp. 35-39. (In Russian)
3. Huson, D. H., Beier, S., Flade, I., Gorska, A., El-Hadidi, M., Mitra, S., et al. (2016), MEGAN community edition - interactive exploration and analysis of large-scale microbiome sequencing data, PLoS Comput. Biol., 12:e1004957, doi: 10.1371/journal.pcbi.1004957.
4. Deusch, S., Camarinha-Silva, A., Conrad, J., Beifuss, U., Rodehutscord, M., and Seifert, J. (2017), A structural and functional elucidation of the rumen microbiome influenced by various diets and microenvironments, Frontiers in Microbiology, no. 8:1605, doi: 10.3389/fmicb.2017.01605
5. Jewell, K. A., McCormick, C. A., Odt, C. L., Weimer, P. J., and Suen, G. (2015), Ruminal bacterial community composition in dairy cows is dynamic over the course of two lactations and correlates with feed efficiency, Appl. Environ. Microbiol., no. 81, pp. 4697-4710, doi: 10.1128/AEM.00720-15.
6. Tako E., Glahn R.P., Knez M. and Stangoulis J.C. (2014), The effect of wheat prebiotics on the gut bacterial population and iron status of iron deficient broiler chickens, Nutr. J., vol. 13, doi: 10.1186/1475-2891-13-58.
7. Yakovenko, E.P., Agafonova N.A., Yakovenko A.V., Ivanov A.N., Soluyanova I.P. (2018), Antibiotics, probiotics, prebiotics, metabiotics with excessive bacterial growth in the small intestine, Trudnyypatsiyent, vol. 16, no. 4, pp. 16-22. (In Russian)
8. Neschislyayev, V.A., Fedorova T.V., Sorokina Yu.V., Molokhova E.I., Savina A.S. (2019), Comparative study of the bacteriotropic effect of metabiotics, Meditsinskoy sovet, no. 21, pp. 154158. (In Russian)
9. Nekrasov R.V., Golovin A.V., Makhayev E.A., Anikin A.S., Pervov N.G.. Strekozov N.I., Mysik A.T., Duborezov V.M., Chabayev M.G., Fomichev Yu.P., Gusev I.V. (2018), Normy potrebleniya molochnogo skota i sviney v pitatelnykh veshchestvakh. molochnyy skot i svini [Norms of consumption of dairy cattle and pigs in nutrients], Moscow, 281 p. (In Russian)
10. Finn, R. D., Attwood, T. K., Babbitt, P. C., Bateman, A., Bork, P., Bridge, A. J., et al. (2017), InterPro in 2017-beyond protein family and domain annotations, Nucleic Acids Res., no. 45, D190-D199, doi: 10.1093/nar/gkw 1107
Сведения об авторах
Хайрулламин Башир - магистрант 2-го курса факультета зооинженерии и биотехнологий, федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный аграрный университет».
Морозов Виталий Юрьевич - доктор ветеринарных наук, ректор, федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный аграрный университет», spin-код: 7773-7257. Скляров Сергей Павлович - кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры крупного животноводства, федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный аграрный университет», spin-код: 3529-8440.
Information about the authors
Bashir Khairullamin - 2nd year master's student of the Faculty of Zooengineering and Biotechnology Saint-Petersburg State Agrarian University.
Vitaliy Yu. Morozov - Doctor of Veterinary Sciences, Rector, Saint-Petersburg State Agrarian University, spin-code: 7773-7257.
Sergey P. Sklyarov - Candidate of Veterinary Sciences, Associate Professor of the Department of Large Animal Husbandry, Saint-Petersburg State Agrarian University, spin-code: 3529-8440.
Авторский вклад. Все авторы настоящего исследования принимали непосредственное участие в планировании, выполнении и анализе данного исследования. Все авторы настоящей статьи ознакомились и одобрили представленный окончательный вариант. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Author's contribution. All authors of this study were directly involved in the planning, execution and analysis of this study. All authors of this article reviewed and approved the submitted final version.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Статья поступила в редакцию 25.10.2022; одобрена после рецензирования 07.12.2022; принята к публикации 14.12.2022
The article was submitted 25.10.2022; approved after reviewing 07.12.2022; accepted after publication 14.12.2022
