CC BY
42
А.О. Соловьева, О.В. Повещенко, А.Ф. Повещенко, В.И. Коненков, А.М. Караськов*
Изучение миграции трансплантированных клеток костного мозга в ткань сердца
ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН, 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2, solovevaao@yandex.ru * ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздравсоцразвития России, 630055, Новосибирск, ул. Речкуновская, 15 cpsc@nricp.ru
УДК 612.42: 612.179 ВАК 14.00.15
Поступила в редакцию 18 июля 2012 г.
© А.О. Соловьева, О.В. Повещенко,
A.Ф. Повещенко,
B.И. Коненков,
А.М. Караськов, 2012
Исследована динамика миграции и проведен сравнительный анализ распределения 5гу-позитивных клеток костного мозга доноров мышей-самцов в разные сроки после внутривенной трансплантации в сердце сингенных реципиентов, самок линии СВА. В качестве маркера клеток костного мозга самцов-доноров был использован sry-ген Y-хромосомы. Маркер донорских клеток определялся в ткани сердца во все исследуемые сроки. Уровень хромосомной метки в миокарде в отдаленные сроки наблюдения превышает аналогичный показатель в более ранние временные точки, что может свидетельствовать о пролиферации трансплантируемых донорских костномозговых прогениторных клеток в миокарде. Ключевые слова: клетки костного мозга; миграция; миокард.
В последние годы представления о роли и месте стволовых клеток в норме и патологии значительно расширились. На сегодняшний день возможно выделение мульти-потентных стволовых клеток человека из различных источников, таких как пуповин-ная кровь, костный мозг или жировая ткань, а также существуют этически корректные безопасные технологии получения от конкретных доноров так называемых индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS), которые обладают свойствами эмбриональных стволовых клеток. Классическим, часто используемым в клинике источником стволовых клеток служит костный мозг.
Как известно, существует целый ряд гипотез о вероятных механизмах позитивного влияния трансплантируемых прогениторных клеток на поврежденный миокард. Среди них концепции о непосредственной диффе-ренцировке и пролиферации прогениторных клеток в кардиомиоциты; клеточном химеризме; цитокиновой активности введенных клеток и т. п. При любом типе стволовых клеток и их источнике успех терапии, применяемой для регенерации тканей, зависит не только от пролиферативного и дифференцировочного потенциалов клеток, но и от их способности к миграции. Миграция позволяет стволовым клеткам достигать соответствующие органы и ткани. Нами была поставлена цель непосредственного определения судьбы трансплантируемых внутривенно прогениторных клеток в мио-
карде с постановкой ряда вопросов [2]. Во-первых, мигрируют ли трансплантируемые внутривенно клетки в миокард. Во-вторых, как долго они могут присутствовать и сохранять жизнеспособность в миокарде. В-третьих, пролиферируют ли трансплантируемые клетки в миокарде в отдаленные сроки после введения. Таким образом, изучение миграции стволовых клеток из костного мозга в ткань сердца имеет огромное фундаментальное и прикладное значение.
материал и методы
В работе использовались мыши линии СВА в возрасте 8 нед. Животные находились на стандартной сбалансированной диете в виварии СО РАМН. Эксперименты на животных проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» Приложения к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755. Суспензию костного мозга выделяли из бедренных и большеберцовых костей самцов СВА. В стерильных условиях удаляли эпифизы бедренных и большеберцовых костей, а диафизы промывали средой RРМI-1640. Клетки костного мозга мышей суспендировали в среде RРМI-1640 при комнатной температуре. Введение суспензии клеток от самцов-доноров мышам-реципиентам (самкам СВА) осуществлялось в хвостовую вену в концентрации 10х106 клеток/ мышь, объемом 0,5 мл. Органы реципи-
ентов (самок линии СВА) выделяли через 1 и 24 ч, 1 и 3 мес. после трансплантации клеток костного мозга доноров (самцов СВА). Забирали ткань сердца и периферическую кровь. Выделенные органы замораживались при минус 70 °С для последующего выделения ДНК.
Цельная ДНК была выделена из замороженных органов при помощи стандартной обработки sodium dodecyl sulfate (SDS) с протеиназой К (10 мкг/мл) и методом высаливания. Полученную ДНК растворяли и замораживали при минус 20 °С [6]. Для обнаружения клеток донорского происхождения в органах реципиента использовали маркер Y-хромосомы (ген sry), который был выявлен с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) [11]. Пробы ДНК приводили к единой концентрации, ампли-фицировали в реакционной смеси, содержащей мышиные праймеры, специфичные для Y-хромосомы. Условия ПЦР: денатурация 95 °С - 3 мин; затем 35 циклов по 50 с при 94 °С, 50 с при 60 °С и 50 с при 72 °С. Далее проводили ПЦР, используя вложенные праймеры [5].
В качестве матрицы использовали 3 мкл ампликонов после первичной ПЦР. Условия амплификации были теми же, что и в случае первичной ПЦР, только с 25 циклами. В результате амплификации получен фрагмент 320 п. о. В качестве позитивного и негативного контроля использовали ткань интактных самцов и самок соответственно. Полуколичественное определение маркера в органах проводили при помощи программного обеспечения Quantity One в денситометре Geldok (Bio-Rad) в единицах оптической плотности ампликонов электрофореграммы.
Статистическая обработка результатов проводилась при помощи непараметрических методов вариационной статистики с использованием пакета программ StatSoft Sta-tistica 6.0. Для оценки достоверности различий использовался непараметрический критерий Манна - Уитни. Результаты выражали в единицах оптической плотности (nt/mm) ± стандартное отклонение (M±o). Различия считали достоверными при уровне р<0,05.
результаты
Миграция клеток костного мозга, определяемая по специфическому маркеру, была обнаружена в ткани сердца реципиентов во все исследуемые сроки (1 и 24 ч, 1 и 3 мес.). Временная динамика распределения изображена в таблице. Используемый нами методический прием, позволяющий выявлять присутствие сингенных клеток при трансплантации, основан на введении клеток чистоли-нейных самцов животным той же клеточной линии женского пола. Наличие хромосомной метки на Y-хромосоме самцов позволяет однозначно трактовать ее выявление в тканях миокарда как точное свидетельство наличия клеток в данном органе, а количественные подходы к оценке уровня метки позволяют судить о наличии или отсутствии пролиферативных процессов в месте фик-
сации трансплантированного материала. Применение хромосомной метки в сингенной модели обладает тем неоценимым преимуществом, что позволяет избежать неопределенности, характерной при использовании ферментных, металлических или флуоресцентных меток и связанной с высокой вероятностью схода меток с мембран и их реутилизацией клетками близлежащих тканей.
При исследовании временной динамики миграции и/или накопления 5гу-позитивных клеток в сердце было показано, что уже через 1 ч после внутривенного введения клетки костного мозга были обнаружены в сердце, причем их уровень был максимальным среди всех исследуемых сроков. Через 24 ч уровень накопления 5гу-позитивных клеток уменьшается в 1,85 раза и является минимальным из всех исследуемых сроков наблюдения. Через 1 мес. уровень маркера также достоверно ниже, чем через 1 ч после трансплантации, но в 1,2 раза выше, чем в срок исследования 24 ч. Уровень маркера (5гу-гена) через 3 мес. после трансплантации увеличивается в 1,6 раза по сравнению с 24 ч наблюдения и в 1,3 раза по сравнению с 1 мес. наблюдения, но не достигает исходного уровня маркера, регистрируемого через 1 ч после трансплантации (таблица).
Эти результаты свидетельствуют о том, что непосредственно после внутривенной трансплантации (1 ч) син-генные (аутологичные) клетки костного мозга активно закрепляются в миокарде. К последней точке наблюдения (3 мес.) уровень метки достоверно не отличается от исходного уровня, установленного непосредственно в течение первого часа после трансплантации. Следовательно, нами получены ответы на все поставленные вопросы. Их можно сформулировать следующим образом. Клетки аутологичного костного мозга, содержащие набор различных прогениторных клеток, при внутривенной трансплантации действительно активно мигрируют в миокард. Они активно фиксируются в миокарде и длительное время сохраняют свое присутствие в тканях сердца, при этом в отдаленные сроки после трансплантации выявляются признаки пролиферативной активности прогениторных клеток в миокарде. Эти результаты позволяют сделать заключение о том, что одним из наиболее вероятных механизмов позитивного влияния трансплантированных аутологичных клеток при повреждениях миокарда могут служить непосредственные эффекты пролифериру-ющих в тканях сердца трансплантированных прогениторных клеток [1].
обсуждение
Костный мозг является уникальным органом, в котором сосуществуют и функционально взаимодействуют два вида стволовых клеток: гемопоэтические и муль-типотентные мезенхимальные. Трансплантация цельной популяции клеток костного мозга считается наиболее предпочтительной, поскольку имеются данные, что котрансплантация мультипотентных мезенхималь-
Патология кровообращения и кардиохирургия 3. 2012
77
Интенсивность Время после трансплантации клеток
миграции трансплан- Орган '""{ "ч".......................................24 ч....................................1 мес."...........................3 мёс...........................
тированных клеток .............................................................................................................................................................................................
715,97±65,83 387,96±104,58 476,13±125,60 616,18±143,92
костного мозга Сердце
р1 = 0,01; р5 = 0,01 р2 = 0,18; р6 = 0,01 р3 = 0,16 р4 = 0,06 мышеи-самцов СВА в ...........................................5.....'............................'...6......!..................„3......'...........................„4......'..........................
ткани сердца сингенных Достоверность различий между группами: р1 - 1 и 24 ч; р2 - 24 ч и 1 мес.;р3 - 1 и 3 мес.; р4 - 3 мес. и реципиентов-самок 1 ч;р5 - 1 ч и 1 мес.;р6 - 24 ч и 3 мес.
ных и гемопоэтических клеток значительно увеличивает приживление последних [9, 13]. Мезенхимальные стволовые клетки, кроме поддержания кроветворения, способны дифференцироваться в специализированные клетки различных органов (остеобласты, хон-дроциты, миобласты, кардиомиоциты, нейрональные клетки и др.), что определяет перспективы их использования в регенеративной медицине и тканевой инженерии.
Эффективность трансплантации клеточного материала зависит не только от вида и количества клеток, но и связана с миграционной активностью трансплантируемых в организм клеток. В литературе описаны механизмы миграции клеток, связанные с цитокинами, хемо-кинами и их рецепторами на клетках. Очевидно, что миграция зависит от запроса клеток микроокружения того или иного органа, от запаса пула собственных стволовых клеток в каждом органе. Причем те молекулы, которые отвечают за миграцию клеток в поврежденный орган, являются определяющими и в условиях нормы.
При повреждении же органа важным миграционным стимулом становится гипоксия. SDF-1a/ CXCR4 ось определяет миграцию различных клеточных популяций, в том числе стволовых клеток. Секретируемый в условиях гипоксии хемоаттрактант SDF-1a регулирует хоминг и циркуляцию CXCR4 положительных стволовых клеток в место повреждения, что приводит к регенерации органа [7]. Секреция SDF-1a регулирует не только хоминг стволовых клеток, но и их пролиферацию и самоподдержание. Оба SDF-1a и CXCR4 конститутивно экспрессируются в различных тканях и клеточных типах и играют ключевую роль в мобилизации клеток, миграции, пролиферации и самоподдержании и удержании мигрирующих клеток и их выживании [8, 16].
Нами установлено, что клетки костного мозга мигрируют в интактное сердце, определяются там во все исследованные временные промежутки после трансплантации и присутствуют в сердце реципиента в течение, по крайней мере, 3 мес. (таблица). Уровень определяемого маркера клеток донорского происхождения в течение 1 ч наблюдения является максимальным, что связано с циркуляцией клеток в кровеносном русле. Предварительные экспериментальные данные по определению уровня 5гу-гена показали наличие меченых клеток в крови на минимальном уровне, который на 2 порядка ниже, чем в сердце.
Снижение количества меченых клеток через 24 ч говорит о перераспределении их в различных органах и крови.
В ряде работ показано, что при внутривенной трансплантации мезенхимальные клетки уже в первые часы после введения обнаруживаются практически во всех органах, однако через двое суток концентрация введенных клеток в организме реципиента уменьшается [10]. Нами выбраны более длительные временные промежутки и показано повышение уровня 5гу-гена к 1 и 3 мес., что может свидетельствовать не только о миграции, но и об удержании, а возможно, и о пролиферации трансплантируемых клеток в сердце.
Цельная фракция клеток костного мозга содержит в своем составе мультипотентные мезенхимальные стромаль-ные клетки, которые кроме миграционной активности способны дифференцироваться в кардиомиоциты [4, 12, 14] и стимулировать репарацию посредством стимуляции клеток - предшественников миокарда. Также показано, что при введении клетки костного мозга стимулируют репарацию миокарда путем паракринного влияния и секреции ряда активных веществ: цитокинов, ростовых факторов, которые в свою очередь стимулируют не только ангиогенез, но и способствуют васкулогенезу в миокарде.
В случае сердечно-сосудистых заболеваний и в частности инфаркта миокарда гипоксические сигналы поврежденного миокарда еще в большей степени активируют паракринные механизмы регуляции повышения выживаемости клеток, способствуют ангиогенезу, а также стимул и руют их дифферен цировку [3]. Тра нспланти ро-ванные клетки не только мигрируют, но и могут химе-ризовать ткани. Одни авторы считают, что происходит слияние клеток донора с клетками реципиента [15]. Другая группа исследователей предложила теорию тро-гоцитоза, при котором поверхностные клеточные антигены донора переносятся на клетки реципиентов [17].
Полученные нами данные о миграции клеток костного мозга, а также данные литературы позволяют предположить, что мобилизация и хоминг представляют собой цепь взаимосвязанных физиологических событий, интересных с точки зрения возможности целенаправленного воздействия на ее звенья с целью повышения эффективности репаративной клеточной терапии. Окончательное решение этого вопроса пока остается открытым.
Клетки костного мозга, введенные внутривенно, мигрируют в неповрежденную ткань сердца и удерживаются в ней во все исследуемые сроки, так как маркер клеток костного мозга определялся в ткани сердца через 1 и 24 ч, 1 и 3 мес. после трансплантации. Внутривенное введение клеток костного мозга, как известно, содержащего большое количество гемопоэтических и мезен-химальных прогениторных клеток, - технологически оптимальный способ доставки этого клеточного материала в нелимфоидные органы. Длительная сохранность в сердце внутривенно введенных клеток костного мозга, содержащих значительное количество прогениторных клеток, обосновывает возможность использования внутривенного способа аутотрансплантации стволовых клеток и позволяет полагать, что это перспективный путь для разработок в области клеточной терапии.
список литературы
1. Коненков В.И., Покушалов Е.А., Повещенко О.В. и др. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2012. № 1. С. 9-14.
2. Соловьева А.О., Повещенко А.Ф., Шевченко А.В. и др. // Бюл. Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. 2011. № 3 (79). С. 221-225.
3. Abbott J.D., Huang Y., Liu D. et al. // Circulation. 2004. V. 110. P. 3300-3305.
4. Bearzi C., Rota M., Hosoda T. et al. // Proc. Nat. Acad. Sc. USA. 2007. V. 104. P. 14068-14073.
5. Cousin B., Andre M., Arnaud E. et al. // Biocehem Biopshys Res. Commun. 2003. V. 301 (4). P. 1016-1022.
6. Julkowska J., Pieczonka A., Strabel T. // BMC Blood Disord. 2005. V. 5 (1). P. 1-6.
7. Koc O.N., Gerson S.L., Cooper B.W. et al. // J. Clin. Oncol. 2000. V. 18. P. 307-316.
8. Kucia M., Jankowski K., Reca R. et al. // J. Mol. Histol. 2004. V. 35. P. 233-245.
9. Li Z.H., Liao W., Cui X.L. // Int. J. Med. Sci. 2011. V. 8 (1). P. 74-83.
10. Mezey, E., Chandross K.J., Harta G. et al. // Science. 2000. V. 290. P. 1779-1782.
11. Pang W. // Blood. 2000. V. 95 (3). P. 1106-1108.
12. Quevedo H.C., Hatzistergos K.E., Oskouei B.N. et al. // Proc. Nat. Acad. Sc. USA. 2009. V.106. P. 14022-14027.
13. Tomita Y., Makino S., Hakuno D. et al. // Med. Biol. Eng. Comput. 2007. V. 45(2). P. 209-220.
14. Urbanek K., Cesselli D., Rota M. et al. // Proc. Nat. Acad. Sc. USA. 2006. V.103. P. 9226-9231.
15. Weimann J.M., Charlton C.A., Brazelton T.R. // Proc. Nat. Acad. Sc. USA. 2003. V. 100 (4). P. 2088-2093.
16. Wen J., Zhang J.Q., Huang W., Wang Y. // Am. J. Cardiovasc. Dis. 2012. V. 2 (1). P. 20-28.
17. Yamanaka N., Wong C.J., Gertsenstein M. // PLoS One. 2009. V. 4 (12). P. 84-89.
Анастасия олеговна Соловьева - младший научный сотрудник ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН (Новосибирск).
ольга Владимировна Повещенко - кандидат медицинских наук, заведующая лабораторией лимфотропной терапии и лимфодиаг-ностики ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН (Новосибирск).
александр Федорович Повещенко - доктор медицинских наук, заведующий лабораторией физиологии протективной системы ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН (Новосибирск).
Владимир иосифович Коненков - доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, директор ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН (Новосибирск).
александр Михайлович Караськов - доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, Заслуженный деятель науки РФ, директор ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздравсоцразвития России (Новосибирск).
