CC BY
72
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
А.С. Урбанский, И.Н. Овчарук
Кемеровская государственная медицинская академия, Кафедра дерматовенерологии, Кафедра биологической химии
ИЗУЧЕНИЕ МЕТАБОЛИЗМА УРОКАНИНОВОЙ КИСЛОТЫ В КОЖЕ И ТКАНЯХ ВНУТРЕННИХ ОРГАНОВ
Разработана методика определения уроканиновой кислоты по разности поглощения с использованием ДЕ в сочетании с восстановлением кратности атомарных связей водородом, позволяющая осуществить более точное определение содержания уроканиновой кислоты (УКК) и активности гистидазы в тканях и биологических жидкостях.
Ключевые слова: кожа, обмен, уроканиновая кислота, гистидаза.
The technique of definition urocanic acid on a difference of absorption with use ДЕ in a combination to restoration brieve of atomic connections by hydrogen, allowing is developed to carry out exacter definition of the contents urocanic acid and activity hystidase in fabrics and biological liquids.
Key words: skin, exchange, urocanic acid, hystidase.
Гистидаза (КФ. 4.3.1.3) осуществляет внутримолекулярное дезаминирование гистидина [1], в процессе которого образуется уроканиновая кислота. Дефект гистидазы или ее отсутствие в тканях обусловливает развитие гистидинемии, гистидинурии и сопровождается выделением с мочой продуктов трансаминирования гистидина [2]. Низкая активность гистидазы в коже наблюдается при псориазе, экземе, нейродермите и злокачественных новообразованиях [3, 4, 5]. Получены данные о том, что уроканиновая кислота блокирует образование гистамина, защищает кожу от эри-темного действия ультрафиолетовых лучей, снижает перекисное окисление липидов и тормозит развитие раковых клеток [5, 6, 7, 9].
Широкий спектр биологической активности уроканиновой кислоты свидетельствует об актуальности исследования активности гистидазы в клетках тканей в процессе их дифференцировки и при развитии патологии. Однако методы определения гистидазы имеют существенные различия, что делает оценку результатов весьма затруднительной.
Целью настоящей работы явился поиск оптимальных условий для определения уроканиновой кислоты и активности гистидазы в гомогенатах тканей внутренних органов и коже при действии на организм некоторых патогенных факторов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты проводили на крысах-самцах массой 150-180 г. Воспалительную реакцию вызывали вве-
дением под кожу 0,5 мл скипидара [8] или облучением лишенного шерсти участка кожи спины (4 см2) эритемной дозой УФО с длиной волны 315 нм. Через сутки животных забивали декапита-цией. Из облученного участка кожи, тканей печени, миокарда и почек готовили 10 % гомогенаты и в них определяли содержание белка по методу Ло-ури [10], активность гистидазы по модифицированному методу [11] с некоторыми изменениями. В пробирки вносили по 2,8 мл пирофосфатного буфера рН 9,2, затем 0,5 мл гомогената (1,5-2 мг белка) и прибавляли 0,1 мл гистидина (10 ммоль). Пробирки помещали в ультратермостат и инкубировали при 37°С в течение одного часа. Контролем служили пробирки, в которые гистидин вносили в конце срока инкубации. Реакцию останавливали добавлением 0,6 мл 3М ацетатного буфера рН 5,0. Содержимое пробирок перемешивали и на 3 минуты помещали в кипящую водяную баню. Охлаждали и центрифугировали или фильтровали через плотные бумажные фильтры. Для анализа использовали надосадочную жидкость или фильтрат. Оптическую плотность (ОП) фильтратов измеряли на спектрофотометре СФ-26 при 264 нм и 277 нм в кювете толщиной 1 см против контрольных проб. Из ОП при 264 нм вычитали ОП при 277 нм. Полученная ДЕ служила показателем содержания уроканиновой кислоты в исследуемой пробе. Концентрацию последней находили с помощью калибровочного графика, построенного с использованием препарата уроканиновой кислоты фирмы "КеапаГ'. Активность гистидазы выражали в мкмолях уроканиновой кислоты на миллиграм белка за час инкубации.
мо 1 2пп2 t^eàiwHa
14- I îuuî â Куз6ассе
Об активности уроканиназы в гомогенатах кожи и печени [12] судили по изменению ДЕ после 30-минутной инкубации при 37°С в 0,05М фосфатном буфере рН 7,4.
Влияние восстановленного глутатиона на активность гистидазы изучали in vitro. Для этого гомо-генаты предварительно инкубировали с 10 мкмоля-ми восстановленного глутатиона при 370С в течение 30 минут.
Изучение спектра поглощения уроканиновой кислоты проводили на СФ-26 в 0,05М фосфатном буфере рН 7,4. Содержание уроканиновой кислоты в смывах с поверхности кожи определяли по методу [13]. В отдельной серии опытов количество уро-каниновой кислоты находили путем измерения ОП при 264 нм и 277 нм рН 1,0 до и после 30-минутного восстановления двойных связей атомарным водородом. Полученные значения ОП использовали для вычисления ДЕ.
Статистическую обработку данных проводили на ПЭВМ c использованием t-критерия Стьюден-та.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ
Спектр поглощения уроканиновой кислоты в щелочной и кислой среде представлен на рисунке 1. Смещение максимума оптической плотности уроканиновой кислоты при переходе от рН 7,4 к рН 1,0 не сопровождается изменением величины оптической плотности. При рН 7,4 и рН 1,0 уро-каниновая кислота имеет максимум поглощения при 277 и 264 нм, соответственно. По мере увеличения длины волны поглощение резко снижается и достигает практически нулевого значения при 300 нм.
Результаты исследования зависимости ДЕ (Е 264 — Е 277нм) в кислой среде от содержания
уроканиновой кислоты в растворе показаны на рисунке 2. Из графика следует, что ДЕ зависит от содержания уроканиновой кислоты в растворе. Установленная зависимость позволяет определять количество уроканиновой кислоты в растворе и активность гистидазы в присутствии посторонних УФ-поглощающих веществ. Интенсивность поглощения УФ-света органическими молекулами определяется характером распределения кратных связей.
Рисунок 2
Зависимость ДЕ от концентрации уроканиновой кислоты
0,3
0 -1-1-1-
0 10 20 30 40
мкМоль
Проведенные нами исследования показали, что восстановление двойных связей атомарным водородом в кислой среде снижает ДЕ уроканиновой кислоты. Нулевое значение ДЕ соответствует равенству оптической плотности при 264 нм и 277 нм. Следовательно, вычитая от значения ДЕ до восстановления кратных связей величину ДЕ после восстановления кратных связей, можно более точно определить концентрацию уроканиновой кислоты. Использование данного метода значительно усложняет процедуру определения уроканиновой кислоты по сравнению с одноволновым методом. Однако в присутствии веществ со спектральной характеристикой, близкой к уроканиновой кислоте и при невозможности использовать ферментный метод, он является единственным способом объективной оценки содержания уроканиновой кислоты в растворе.
Изучение скорости внутримолекулярного дезаминирования гистидина гомогенатами исследуемых тканей свидетельствует о том, что в тканях здоровых крыс с помощью двухволно-вого метода гистидазная активность выявляется только в коже (25,29 ± 1,67) и печени (98,57 ± 3,88).
Учитывая длительность инкубации (60 мин.) и щелочной характер среды (рН 8,0-9,0) при определении активности гистидазы представляли интерес данные о сохранности нативности фермента. Результаты представлены в таблице 1.
Из приведенных данных следует, что в отсутствии субстрата прединкубация гомогенатов печени и кожи при 370С в пирофосфатном буфере рН 7,2 в течение 30 минут снижает активность гистидазы
Рисунок 1
Спектр поглощения уроканиновой кислоты: 1 - рН 7,4; 2 - рН 1,0
Смещение максимума ОП уроканиновой кислоты при переходе от рН 7,4 к рН 1,0 не сопровождается изменением величины ОП. При рН 7,4 и рН 1,0 уроканиновая кислота имеет максимум поглощения при 277 и 264 нм соответственно. По мере увеличения длины волны поглощение резко снижается и достигает практически нулевого значения при 300 нм.
(Медицина № 1 ?00? -,->
в Кузбассе 33
Таблица 1
Активность гистидазы кожи и печени после 30-ти минутной прединкубации в отсутствии и присутствии восстановленного глутатиона (М ± т в мкмоль/мг белка час)
Режим проведения анализа Печень Кожа
п = 5 п = 5
Без 30-ти минутной прединкубации Прединкубация при 370 С в течение 30 мин. 30-ти минутная прединкубация с восстановленным глутатионом 98,57 ± 3,88 25,29 ± 1,67 65,78 ± 5,81 85,78 ± 4,74 30,04 ± 5,30
примерно на 30 %. Добавление 10 мкмолей восстановленного глутатиона к гомогенатам стабилизирует фермент. Явление стабилизации фермента субстратом впервые было обнаружено при изучении механизма индукции ферментов катаболизма аминокислот у животных [13]. Следовательно, время прединкубации гомогенатов при 370С в щелочной среде может существенно повлиять на результаты определения активности гистидазы.
Результаты влияния облучения кожи спины эри-темной дозой УФ-света и введения скипидара на активность гистидазы в коже и печени приведены в таблице 2. Из таблицы следует, что облучение кожи эритемной дозой УФ излучения увеличивает активность гистидазы в 2,6 раза, по сравнению с контролем. На такую же величину повышается активность фермента после подкожного введения скипидара.
Таблица 2
Активность гистидазы в гомогенатах кожи и печени (М ± т в мкмоль/мг белка час) при воспалении
Органы
Группы животных Кожа Печень
Контроль (п = 5) 17,8 ± 2,0 106,6 ± 5,0
Облучение УФЛ (п = 5) 47,0 ± 5,0 123,2 ± 6,4
Введение скипидара подкожно (п = 5) 48,5 ± 9,0 99,92 ± 6,86
Стимулирующий эффект УФ-излучения на активность гистидазы был отмечен в ряде других исследований [3, 7]. Имеются данные о том, что под влиянием УФ излучения увеличивается распад богатого гистидином белка кератогиалиновых гранул [15]. По-видимому, этот процесс сопряжен с активацией гистидазы и увеличением количества урока-ниновой кислоты. Показано, что под влиянием УФ излучения метаболически активная транс-урокани-новая кислота переходит в метаболически инертную цис-форму [16]. Возможно, в этом заключается механизм защиты кожи уроканиновой кислотой от эритематозного действия УФ-лучей.
Воспалительная реакция кожи, полученная подкожным введением скипидара или облучением УФ-лучами, не оказывала влияния на активность гис-тидазы в печени. Отсутствие эффекта можно объяснить особенностями метаболизма аминокислот в исследуемых тканях. Печень участвует в регуляции уровня белков в крови, и в стрессовой ситуации она дополнительно синтезирует и секретирует в кровь так называемые белки острой фазы воспаления [8, 17]. В этих условиях, по-видимому, снижается катаболизм аминокислот и увеличивается их использование в синтезе белков. На-
ряду с этим в печени, возможно, происходит изменение активности гистидазы на более ранних, чем в коже, сроках с нормализацией к концу суток. Данное предположение согласуется с результатами исследования Капланского С.Я. с соавт. [14].
С целью установления дальнейшего пути утилизации уроканиновой кислоты проведено изучение активности уроканиназы в печени и коже.
Исходное значение ДЕ уроканиновой кислоты до инкубации с гомогенатом печени составляло 0,51 ± 0,04. Через 30 минут инкубации при 370С и рН 7,4 ДЕ уменьшилась до 0,34 ± 0,02 или, в среднем, на 30 %. В аналогичных условиях инкубация урокани-новой кислоты с гомогенатом кожи (соответственно, 0,40 ± 0,03 и 0,38 ± 0,03) снижением ДЕ не сопровождалась, что указывает на очень низкую активность или отсутствие уроканиназы в коже. Следовательно, в коже уроканиновая кислота не превращается в глутамат, а удаляется вместе с отторгающимся эпидермисом или поступает в кровь и метаболи-
зируется печенью (рис. 3).
Мандель А.Ш. с соавт. [4] показали, что в смывах с поверхности кожи преобладает метаболически активная транс-урока-ниновая кислота (до 90 %). Низкое содержание неметаболизируемо-го цис-изомера (8 %) подтверждает наше предположение о возможности превращения в транс-урока-ниновую кислоту в клетках эпидермиса.
Для определения количества уроканиновой кислоты в смывах с поверхности кожи здоровых и больных контактными аллергическими дерматоза-
Рисунок 3
Схема метаболического превращения гистидина
в коже и печени
_ м0 1 2002 Медицина
34 1 в Кузбассе
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ми мы использовали разные методические приемы (табл. 3). Из таблицы следует, что показатели содержания уроканиновой кислоты при использовании двухволнового метода значительно выше, чем при использовании метода восстановления кратных связей. Таблица 3
Содержание уроканиновой кислоты в смывах с поверхности кожи предплечий здоровых и больных контактными аллергическими дерматозами в мкмоль/см2 поверхности
Барашнев Ю.И., Вельтищев Ю.Е. Наследственные болезни обмена веществ у детей. — Л.: Мед., 1978. — 319 с. Кубанова А.А. Нарушение метаболизма катехоламинов и гисти-дина у больных зудящими дерматозами и их терапевтическая коррекция (фотохимиотерапия вигератин): Автореф. дис. ... канд. мед. наук. — М., 1979. — 17 с.
4. Оценка эффективности
Методы определения
Использование АЕ (264-277 нм) Использование восстановления кратных связей
Здоровые (N = 32) M ± m
0,55 ± 0,05 0,21 ± 0,01*
Больные (N = 15) M ± m
0,76 ± 0,02**' 0,19 ± 0,07**
Примечание: * - достоверность (р < 0,001) разницы показателей разных методов в группе "здоровые";
** - достоверность (р < 0,01) разницы показателей разных методов в группе "больные";
*** - достоверность (р < 0,05) разницы показателей в группе "здоровые" и группе "больные", полученных с использованием ДЕ.
Снижение ДЕ уроканиновой кислоты после восстановления кратных связей свидетельствует о том, что в смывах с поверхности кожи в растворе, кроме уроканиновой кислоты, присутствуют и другие УФ-поглощающие соединения, например, аминокислоты, продукты распада пуриновых нуклеоти-дов. Кроме того, содержание уроканиновой кислоты в смывах у больных контактными аллергическими дерматозами превышает такой показатель у здоровых.
ВЫВОДЫ
1. Предложен двухволновый метод определения уроканиновой кислоты в биологических средах по величине ДЕ (Е 264 — Е 277 нм, рН 1,0), позволяющий повысить точность определения и уменьшить влияние посторонних УФ-поглоща-ющих соединений.
2. Показано, что гистидаза присутствует исключительно в клетках печени и в коже, а уроканина-за, участвующая в превращении уроканиновой кислоты в глутамат, присутствует только в печени.
3. Дальнейший катаболизм уроканиновой кислоты эпидермиса до глутамата протекает в клетках печени.
4. Данный метод может быть использован дерматологами, косметологами, профпатологами при исследовании состояния кожи, печени и при лечении гистидинемии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Определение свободного гистидина методом тонкослойной хроматографии / Ильинская О.Н., Скипина И.М., Карамова Н.С., Иванченко О.Б. // Клин. лаб. диагн. - 2001. - № 6. - С. 12-14.
лазерной фотохимиотерапии по содержанию уроканиновой кислоты в смывах с поверхности кожи / Ман-дель А.Ш., Буробин В.А., Осипов Е.В. и др. // Вестн. дерматол. - 1986. - № 2. -С. 10-14.
5. Буробина С.С. Энзимо-логия опухолей. — М., 1979. — 30 с.
6. Сравнительное изучение влияния лазерного излучения на активность гис-
тидазы и перекисное окисление липидов в коже экспериментальных животных / Мандель А.Ш., Осипов Е.В., Буробин В.А. и др.// Вестн. дерматол. — 1986. — № 6. — С. 811.
7. Мардашев С.Р., Бабаянц Р.С., Шахтмейстер И.Я. К вопросу об обмене гистидина в коже при некоторых дерматозах // Вестн. дерматол. — 1972. — № 6. — С. 35-39.
8. Pick-Kober K.-H., Munker D., Gressner A.M. Fibronectin is Sinthesized as an Acute Phase Reactant in Rat Hepatocytes // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. — 1986. — Vol. 24. — Р. 521-528.
9. Вагнер Е.А., Хлебников В.В., Терехина Н.А., Палатова Л.Ф. Анти-оксиданты в лечении больных холелитиазом // Вестн. хирургии. — 1997. — С. 36-39.
10. Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н. Методы клинической биохимии // Лабораторные методы исследования: Справочник. — М.: Мед., 1987. — С. 174-179.
11. Буробин В.А. Определение активности гистидазы печени и кожи спектрофотометрическим методом // Методы исследования активности некоторых ферментов в клинике. — М., 1967. — С. 2838.
12. Буробин В.А., Лихачева Н.В., Абгафорова Г.Е. Определение активности уроканиназы в сыворотке крови и ткани печени. Микрометод // Лаб. дело. — 1978. — № 11. — С. 650653.
13. Буробин В.А., Пономарева О.В., Николаева Т.Г., Юрченко Н.Я. Изучение биологической активности уроканиновой кислоты // Вопр. мед. химии. — 1985. — № 1. — С. 102-106.
14. Капланский С.Я., Мясоедова К.Н., Протасова Т.Н. Адаптация обмена аминокислот при изменении содержания белка в питании и под влиянием различных гормональных систем // Проблемы биохимической адаптации. — М.: Мед., 1966. — С. 112-130.
15. Шубникова ЕА. Эпителиальные ткани. — М.: МГУ, 1996. — 250 с.
16. Николаев А.Я., Осипов Е.В., Буробин В.А., Козлов Е.А. Роль 3:5-АМР в регуляции активности гистидазы кожи и печени крыс // Биохимия. — 1977. — № 42. — С. 1111-1115.
17. Доценко ВЛ. Белки плазмы крови в острой фазе воспаления. — М., 1985. — 23 с.
(Медицина № 1 700? Зг
в Кузбассе 3Э
